TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.

HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN MÔN

PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG NẤM MEN NẤM MỐC

GVHD: NGUYỄN THỊ KIM OANH

SVTH: Nhóm 3

LỚP: Thứ 2, Tiết 10-11

TP.HCM, ngày 9 tháng 10 năm 2015

 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

Danh sách nhóm

STT Họ Và tên MSSV Phân Công
1 Trần Thị Mỹ Dung 2022130063 Tổng hợp word, tìm tài liệu
2 Nguyễn Hoàng Việt 2022130030 Chỉnh sửa word
3 Bùi Thị Thanh Hương 2022130033 Tìm tài liệu
4 Khương Thị Thảo 2022130062 Tìm tài liệu
5 Nguyễn Thị Vân Anh 2022130038 Tìm tài liệu
6 Thái Thị Tuyết Hà 2022130001 Tổng hợp power point, báo cáo

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 1

 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

Mục lục
1. Tổng quan về nấm men và nấm mốc.......................................................................3
2. Phương pháp định lượng tổng nấm men nấm mốc................................................4
2.1. Phương pháp 1: Phương pháp truyền thống..............................................................4
2.1.1. Phạm vi áp dụng.................................................................................................4
2.1.2. Nguyên tắc.........................................................................................................5
2.1.3. Môi trường và hóa chất......................................................................................6
2.1.4. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh............................................................................10
2.1.5. Thực hành.........................................................................................................11
2.2. Phương pháp 2: phân lập nấm men, nấm mốc ưa khô............................................16
2.3. Phương pháp 3: Đếm nấm men và nấm mốc bằng phương pháp màng khô có thể
hoàn nước (Phương pháp Petrifilm TM)..........................................................................16
2.3.1. Nguyên tắc.......................................................................................................16
2.3.2. Thuốc thử.........................................................................................................17
2.3.3. Thiết bị, dụng cụ..............................................................................................17
2.3.4. Chuẩn bị...........................................................................................................18
2.3.5. Cách tiến hành..................................................................................................18
2.3.6. Báo cáo thử nghiệm..........................................................................................19
Tài liệu tham khảo......................................................................................................21

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 2

 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG NẤM MEN-NẤM MỐC

1. Tổng quan về nấm men và nấm mốc

Nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật rất đa dạng, cho đến nay có hơn 400,000
loài nấm men và nấm mốc đã được mô tả. Đây là nhóm vi sinh vật nhân thật, có vách tế
bào là lớp vỏ chitin, có nhân và các bào quan khác. Tất cả các loài nấm men và nấm mốc
đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn dinh dưỡng cung cấp năng lượng
từ môi trường bên ngoài, vì thế vi sinh vật này thường xuyên được phân lập từ thực phẩm
hay các nguồn giàu dinh dưỡng khác. Ta có thể phân biệt nấm men và nấm mốc theo các
khái niệm cơ bản như sau:
 Nấm mốc có cấu tạo hình sợi phân nhánh, tạo thành một hệ chằng chịt phát triển
rất nhanh gọi là khuẩn ti thể hay hệ sợi nấm.
 Nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, phát triển thành
các khuẩn lạc tròn, lồi viền đều, bóng hoặc mờ trên bề mặt môi trường thạch nấm.
Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một
khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường. Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay
một đoạn của khuẩn ty. Trong thực phẩm nếu có thể sinh trưởng và phát triển của
nấm men, nấm mốc có thể làm thay đổi màu của thực phẩm, phát sinh mùi, vị lạ,
làm hư hỏng hay thay đổi cấu trúc của thực phẩm, một số tạo độc tố gây ngộ độc
thực phẩm.
 Quá trình tăng trưởng của nấm men và nấm mốc phụ thuô ̣c vào rất nhiều yếu tố từ
môi trường. Hầu hết nấm mốc, nấm men đều thuô ̣c nhóm vi sinh vâ ̣t ưa mát, nhiê ̣t
đô ̣ thích hợp cho sự phát triển của chúng trong khoảng 20 – 280C, mô ̣t số ít trong
nhóm này ưa lạnh hay ưa nóng. Nước hoạt tính cũng là mô ̣t nhân tố ảnh hưởng rất
quan trọng đến tăng trưởng. Hầu hết các loài nấm men nấm mốc và nấm men phát
triển tốt trong cơ chất có nước hoạt tính khoảng 85% hay lớn hơn, mô ̣t số ít loài có
thể tăng trưởng trong cơ chất có nước hoạt tính thấp hơn khoảng 60 – 70%. Nấm
mốc và nấm men tăng trưởng được trong vùng pH từ 2 - 9, trong đó pH thích hợp
GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 3
 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

nhất nằm trong khoảng 4 – 6,5. Hầu hết nấm mốc, nấm men đều thuô ̣c nhóm hiếu
khí bắt buô ̣c, mô ̣t số có thể phát triển trong điều kiê ̣n vi hiếu khí. Mô ̣t số loài có thể
tiếp nhâ ̣n oxy nguyên tử từ cơ chất của chúng, nhưng dù ở dạng nào, oxy vẫn là
nguyên tố cần thiết cho quá trình phát triển của nấm mốc và nấm men.
Mật độ nấm men và nấm mốc trong mẫu được xác định chung dưới dạng tổng nấm
men và nấm mốc bằng kỹ thuật pha loãng, trãi hộp và đếm khuẩn lạc trên môi trường
Dichloran 18% Glycerol Agar (DG 18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol
Agar (DRBC). Môi trường DRBC được sử dụng cho các loại mẫu thực phẩm và thức ăn
chăn nuôi có hoạt độ nước lớn hơn 0.95 như thịt, trứng, các sản phẩm sữa ( trừ sữa bột )
rau quả, các loại pate tươi… Môi trường DG18 được sử dụng cho các loại mẫu thực phẩm
và thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0.95 như quả khô, bánh ngọt,
mứt, thịt khô, cá muối, ngũ cốc, đậu đỗ và các sản phẩm đậu đỗ, bột mì, quả hạch, gia
vị…
Trong thực phẩm, khi có sự hiện diện của mốc và men, chúng phát triển làm thay
đổi màu của thực phẩm, phát sinh mùi, vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cấu trúc của thực
phẩm, một số tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm.
2. Phương pháp định lượng tổng nấm men nấm mốc
2.1. Phương pháp 1: Phương pháp truyền thống
2.1.1. Phạm vi áp dụng.
Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 8275-1,2:2012 (ISO 21527-1,2:2008)
dùng để định lượng nấm men và nấm mốc trong các sản phẩm thực phẩm hoặc trong thức
ăn chăn nuôi có hoạt độ nước lớn hơn 0.95% và hoạt độ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0.95%.
2.1.2. Nguyên tắc
1. Chuẩn bị các đĩa nuôi cấy bề mặt, sử dụng môi trường nuôi cấy chọn lọc qui định.
Tùy chọn vào số lượng khuẩn lạc dự kiến, sử dụng lượng xác định của mẫu (nếu
sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (nếu sản phẩm ở dạng khác), hoặc
các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu/huyền phù.

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 4

 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

Có thể chuẩn bị các đĩa bổ sung trong cùng điều kiện, sử dụng các dung dịch thập
phân của mẫu thử hoặc các huyền phù ban đầu.
2. Ủ các đĩa đã cấy trong điều kiện hiếu khí ở 25⁰C ± 10C trong 5 ngày. Các đĩa
thạch có thể được để trong ánh sáng khuếch tán từ 1 ngày đến 2 ngày, nếu cần.
3. Đếm các khuẩn lạc/các chồi, khẳng định việc nhận dạng các khuẩn lạc nghi ngờ
bằng kính phóng đại hoặc kính hiển vi (để phân biệt các khuẩn lạc của nấm men
với các khuẩn lạc của vi khuẩn), nếu cần.
4. Số lượng nấm men và nấm mốc trong một gam hoặc một mililit mẫu được tính từ
số lượng khuẩn lạc/chồi/mầm thu được trên các đĩa đã chọn ở các mức pha loãng
tạo ra các khuẩn lạc có thể đếm được. Nấm men và nấm mốc được đếm riêng, nếu
cần.
Xác định số lượng nấm men và nấm mốc trong mẫu bằng kỹ thuật pha loãng và đổ
đĩa, một khối lượng mẫu xác định được cấy trang trên môi trường DG18 ( Dichloran
Glycerol Agar ) hay DRBC ( Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar ). Sau khi ủ
250C trong 5-7 ngày, đếm số khuẩn lạc nấm men và nấm mốc riêng biệt.

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 5

 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

2.1.3. Môi trường và hóa chất.

Môi trường – Hóa chất Mục đích
Saline Pepton Water (SPW) Pha loãng mẫu
DG18
Nuôi cấy nấm men và nấm mốc
DRBC
HCl 10%
Chỉnh pH
NaOH 10%

Bảng 1. Môi trường và hóa chất.

2.1.3.1. Dịch pha loãng

2.1.3.1.1. Yêu cầu chung

Xem TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phần), TCVN 6263 (ISO 8261) và tiêu
chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm.
CHÚ THÍCH: có thể bổ sung các tác nhân hoạt động bề mặt như natri poly
(oxyetylen) sorbatitanmonooleat [0,05 % nồng độ khối lượng] vào dịch pha loãng để giảm
các màng bào tử nấm mốc và bào tử dính .
Khuyến cáo sử dụng canh thang nước pepton 0,1% (nồng độ khối lượng) làm dịch
pha loãng, trừ khi để chuẩn bị mẫu thử cụ thể.

2.1.3.1.2. Thành phần của canh thang nước pepton 0,1 % (nồng độ khối lượng)
Dịch thủy phân mô động vật hoặc thực vật bằng enzym 1,0 g
Nước 1000 ml
Dịch thủy phân mô động vật hoặc thực vật bằng enzyme (1,0g) là hàm lượng để vi
sinh vật phát triển không nhằm mục đích tăng sinh.

2.1.3.1.3. Chuẩn bị canh thang nước pepton 0,1% (nồng độ khối lượng)
Hòa tan các thành phần trên trong nước, đun nóng nếu cần.
Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 250C, nếu cần.
2.1.3.2. Môi trường nuôi cấy

2.1.3.2.1. Thạch dichloran-rose bengal chloramphenicol (DRBC)

Thành phần

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 6

 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

Sản phẩm thủy phân mô động vật hoặc thực vật bằng
5,0 g
enzyme
D-Glucoza (C6H12O6) 10,0 g
Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 1,0 g
Magie sulfat (MgSO4.H2O) 0,5 g
Dichloran (2,6-dicloro-4-nitroanilin) 0,002 g
Rose Bengal 0,025 g
Thạch từ 12 g đến 15 ga
Chloramphenicol 0,1 g
Nước cất hoặc nước đã loại ion 1 000 ml

2.1.3.2.2. Thạch dicloran glycerol 18% (nồng đồ khối lượng) (DG18)

Thành phần
Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym 5,0 g
D-Glucoza (C6H12O6) 10,0 g
Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 1,0 g
Magie sulfat (MgSO4.H2O) 0,5 g
Dichloran (2,6-dicloro-4-nitroanilin) 0,002 g
Glycerol khan 220 g
Thạch từ 12 g đến 15 ga
Chloramphenicol 0,1 g
Nước cất hoặc nước đã loại ion 1 000 ml
a
Tùy vào sức đông của thạch.

 Vai trò của các thành phần trong môi trường

Sản phẩm thủy phân mô động vật hoặc thực vật bằng enzyme chứa phong phú các
chất đạm hữu cơ, cũng có một số vitamin và đường cung cấp các chất dinh dưỡng cho vi
sinh vật phát triển.

D-Glucoza (C6H12O6) là nguồn vật chất cung cấp C trong quá trình sinh trưởng của
vi sinh vật. Trong tế bào nguồn C trải qua một loạt quá trình biến hoá hoá học phức tạp sẽ
biến thành vật chất của bản thân tế bào và các sản phẩm trao đổi chất. Ngoài ra, nguồn C
còn là nguồn cung cấp năng lượng tốt cho vi sinh vật.

Kali dihydro phosphat (KH2PO4) : là thành phần của acid nucleic, nucleoprotein,
phospholipid, coenzyme, ATP…. Làm nên hệ thống đệm giúp điều chỉnh pH môi trường.

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 7

 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

Magie sulfat (MgSO4.H2O): là thành phần trung tâm hoạt tính của một số emzyme,
thành phần của sắc tố quang hợp.

 Môi trường có chứa dichloran và rose bengal nên ức chế sự kéo dài khuẩn ty nấm
mốc mọc nhanh , vì thế cho phép phát hiện những nấm mốc mọc chậm.
 Rose bengal là chất dễ bị phân hủy trong ánh sáng, nên cần giữ môi trường

trong tối.

Glycerol khan có vai trò khử độc cho môi trường. Với phương pháp bảo quản lạnh
sâu, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Để khắc phục nhược
điểm này người ta đã bổ sung Glycerol làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh.

Thạch dùng để làm rắn môi trường chứ không phải là cơ chất dinh dưỡng cho vi
sinh vật sử dụng

Cloramphenicol là kháng sinh, có tác dụng kìm khuẩn, nhưng có thể diệt khuẩn ở
nồng độ cao hoặc đối với những vi khuẩn nhạy cảm cao.

Nước là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy, là yếu tố quan
trọng nhất quyết định sự phát triển của mọi sinh vật. Sự trao đổi chất, quá trình sinh tổng
hợp các cấu trúc tế bào, nghĩa là các phản ứng sinh hóa chỉ có thể xảy ra trong môi trường
nước. trong môi trường không có nước mọi hoạt động dinh dưỡng đều bị dừng lại, bởi ở
trạng thái khô các chất dinh dưỡng đều không thể thâm nhập vào tế bào.

2.1.3.2.3. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Yêu cầu chung
Hòa các thành phần trên vào nước bằng cách đun sôi để hòa tan, trừ
chloramphenicol. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 5,6 ± 0,2 ở 250C, nếu cần.
Cho thêm 10 ml dung dịch chloramphenicol 1% (nồng độ khối lượng) trong etanol
và trộn. Phân phối môi trường này vào các vật chứa có dung tích thích hợp. Khử trùng 15
min bằng hấp áp lực ở 1210C.
Làm nguội ngay môi trường trong nồi cách thủy được duy trì ở nhiệt độ từ 44 0C đến
470C. Làm nguội đến dưới 500C và phân phối các lượng 15 ml vào các đĩa Petri vô trùng.

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 8

 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

Để yên cho môi trường đông đặc và làm khô bề mặt thạch theo TCVN 6404 (ISO
7218) và TCVN 8128 (ISO/TS 11133) (tất cả các phần), nếu cần.
Sử dụng ngay hoặc bảo quản nơi tối thiểu TCVN 8128 (ISO/TS 11133) (tất cả các
phần) cho đến khi sử dụng.
CẢNH BÁO - Không để môi trường tiếp xúc với ánh sáng, vì khi tiếp xúc với
ánh sáng có thể sinh ra các sản phẩm gây độc cho tế bào làm ảnh hưởng đến kết quả
định lượng.

2.1.3.2.4. Phương pháp bổ sung chlortetracycline clohydric

Việc phát triển quá mức vi khuẩn có thể là một vấn đề (ví dụ: thịt tươi), do đó
khuyến cáo sử dụng chloramphenicol (50 mg/l) và chlortetracycline (50 mg/l). Trong
trường hợp nay, chuẩn bị môi trường cơ bản như trên nhưng chỉ sử dụng 50 mg
chloramphenicol rồi phân phối các lượng 100 ml và khử trùng. Đồng thời chuẩn bị dung
dịch Chlortetracycline clohydric 0,1 % (khối lượng) trong nước (vì dung dịch này không
ổn định nên phải chuẩn bị ngay trước khi sử dụng) và lọc để khử trùng. Ngay trước khi sử
dụng, thêm 5 ml dung dịch này một cách vô trùng vào 100 ml môi trường cơ bản và đổ ra
đĩa. Không khuyến cáo sử dụng gentamicin vì việc sử dụng gentamicin cho thấy ức chế
một số loài nấm men.

2.1.3.2.5. Phương án bổ sung các nguyên tố với lượng vết.

Để cho nấm mốc thể hiện hoàn toàn hình thái, cụ thể là sắc tố của chúng, thì cần đến
nguyên tố với lượng vết mà có thể không có trong DRBC. Để nhận biết các nấm mốc trên
môi trường này, thì thêm dung dịch nguyên tố với lượng vết sau đây với 1 ml trên 1li môi
trường, trước đó đã được hấp áp lực: 1 g ZnSO 4.7H2O; 0,5 g CuSO4.5H2O; 100 ml nước
cất hoặc nước đã loại ion.

2.1.3.2.6. Phương án bổ sung Tergitol (đối với môi trường DRBC)

Để tránh Mucoraceae mọc quá dày trên các đĩa thạch, thì nên bổ sung Tergitol(1
ml/l) vào môi trường nuôi cấy.

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 9

 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

2.1.4. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Có thể dùng dụng cụ sử dụng một lần để thay thế cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng
nhiều lần nếu nó có các đặc tính kỹ thuật phù hợp.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN
6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau:
1. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 250C ± 10C.
2. Pipet xả hết, vô trùng, dung dịch danh nghĩa 1 ml, được chia vạch 0,1 mlít
3. Nồi cách thủy, hoặc dụng cụ tương tự, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 44 0C đến
470C.
4. Máy đo pH, có độ chính xác 0,1 đơn vị pH ở 250C.
5. Chai, bình và ống nghiệm, để đun sôi và bảo quản môi trường nuôi cấy và pha
loãng dung dịch.
6. Đĩa Petri vô trùng, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, đường kính từ 90 mm đến 100
mm.
7. Kính hiển vi, để phân biệt nấm men với các tế bào vi khuẩn (có trường sáng, độ
khuếch đại từ 250 lần đến 1 000 lần).
8. Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo (đường kính nhỏ hơn 2 mm và dài 80
mm). Đường kính không được vượt quá 2 mm để giảm thiểu lượng mẫu dính vào
que khi kết thúc dàn mẫu.
9. Kính khuếch đại hai thị kính, để phân biệt các khuẩn lạc/tế bào nấm men và nấm
mốc (khuếch đại từ 6,5 lần đến 50 lần).
2.1.5. Thực hành.
1.1.1. Cân 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc hút 10ml/25ml đối với mẫu lỏng +
90/225ml Saline Pepton Water.

Đồng nhất mẫu bằng máy Stomacher trong 60 giây

Dịch mẫu [ 10-1] Pha loãng
Dịch mẫu [ 10-2]

0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 10

 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

DRBC DRBC DRBC DRBC

hoặc hoặc hoặc hoặc
DG18 DG18 DG18 DG18

Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn mẫu vô trùng cho đến
khi khô bề mặt thạch. Ủ 250C/3-5 ngày.

Đọc kết quả Chọn các đĩa mọc ≤ 150 khuẩn lạc/mầm/chồi ở hai độ pha loãng
liên tiếp.

Tính và biểu thị kết quả

Hình 1. Quy trình định lượng tổng nấm men-nấm mốc
2.1.5.1. Các bước tiến hành
Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu
Mục đích: chuẩn bị mẫu cho các giai đoạn tiếp theo trong quá trình phân tích thực
hiện được chính xác hơn, chuyển vi sinh vật trong mẫu ban đầu vào dung dịch pha loãng,
đồng nhất mẫu, tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển, chứ không nhằm mục đích tăng
sinh
Cân chính xác 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml/25ml đối
với mẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ±5%, cho vào túi nhựa vô
trùng ( bình tam giác ).
Cho dung dịch pha loãng SPW 90/225ml (sai số cho phép ±5%) vô trùng vào túi
nhựa ( bình tam giác ) chứa mẫu. SPW tạo môi trường đẳng trương và không làm tổn
thương vi sinh vật.
Đồng nhất mẫu và dung dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc
lắc đều bình tam giác có mẫu và dung dịch pha loãng trong 2÷3 phút. Việc này giúp
phóng thích vi sinh vật trong mẫu ra bên ngoài trộn với dung dịch pha loãng mẫu, để các
bước phân tích tiếp theo được chính xác hơn

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 11

 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

Để vi sinh vật không bị tổn thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, thì nhiệt độ của
dịch pha loãng trong suốt trong quá trình thao tác luôn phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ
phòng.
Do các bào tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang
(không để đứng) khi được làm đầy với một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch pha
loãng thích hợp.
Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng bằng máy vortex để tránh các
phần tử có vi sinh vật lắng xuống.
Bước 2. Pha loãng mẫu
Mục đích: dung dịch sau khi pha loãng sẽ có mật độ vi sinh vật phù hợp cho kỹ thuật
phát hiện, định lượng hoặc phân lập vi sinh vật thành những khuẩn lạc riêng biệt. Từ đó
chúng ta có thể gián tiếp xác định được mật độ tế bào hay bào tử có trong thực phẩm cũng
như phân lập để tạo dòng thuần vi sinh vật.
Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ±5% cho vào một ống
nghiệm chứa 9ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp.
Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5-10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10 -2 (đối
với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10 -1). Nếu cần,
lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5 ,… cho đến khi thu
được lượng vi khuẩn thích hợp.
Bước 3. Cấy và ủ mẫu
Cấy: là những thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường đang sống sang môi trường
thuận lợi hơn cho sự phát triển của chúng.
Ủ mẫu: là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho sự hoạt
động và phát triển của vi sinh vật.
Mục đích:
 Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu vật phẩm cần nghiên cứu.
 Tiến hành nhân giống vi sinh vật một cách nhanh chóng

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 12

 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

 Bảo tồn các giống thuần khiết.

 Nghiên cứu các đặc tính sinh học và hệ thống sinh học của chúng.
Dùng pipet vô trùng chuyển 0.1 ml mẫu thử lỏng 0.1 ml huyền phù ban đầu đối với
sản phẩm ở dạng khác cho vào đĩa thạch DRBC hoặc DG18.
Dùng pipet vô trùng mới để chuyển 0.1ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất
(10-1) ( sản phẩm dạng lỏng) hoặc 0.1 ml dung dịch pha loãng thập phân 10 -2 ( sản phẩm ở
dạng khác) cho vào đĩa thạch DRBC hoặc DG18 thứ hai.
Để thuận cho việc định lượng các lượng nhỏ nấm men và nấm mốc, lấy các lượng
đến 0.3ml dung dịch pha loãng 10-1 của mẫu hoặc của mẫu thử dạng lỏng, dàn đều trên ba
đĩa.
Lặp lại các thao tác này với các dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng pipet vô
trùng mới cho mỗi dung dịch pha loãng.
Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa bằng que dàn mẫu vô trùng cho đến khi dịch
lỏng hấp thụ hết vào môi trường.
Có thể sử dụng kỹ thuật cấy bằng phương pháp đổ đĩa nhưng trong trường hợp này
sự tương đương của các kết quả phải được đánh giá bằng cách so sánh với kết quả được
cấy trên bề mặt đĩa. Phương pháp cấy bề mặt có thể cho kết quả định lượng cao hơn. Kỹ
thuật dàn đĩa tạo điều kiện cho các tế bào tiếp xúc tối đa với oxi của không khí và tránh
mọi nguy cơ bị bất hoạt do nhiệt của chồi nấm. Các kết quả có thể phụ thuộc vào từng
loại nấm.
Ủ các đĩa đã chuẩn bị trong môi trường hiếu khí, nắp hướng lên trên, tư thế thảng
đứng trong tủ ấm ở 25±10C trong 3-5 ngày. Khuyến cáo ủ các đĩa trong túi chất dẻo để
không làm nhiễm bẩn tủ ấm trong trường hợp nấm mốc lan ra ngoài đĩa.
Bước 4. Đếm và chọn lọc các khuần lạc để khẳng định.
Mục đích: chọn lọc loại vi sinh vật cần định lượng để đếm, thu thập số liệu để tính
toán.

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 13

 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

Đếm các đĩa trong khoảng thời gian ủ từ 3-5 ngày. Chọn ra các đĩa chứa ít hơn 150
khuẩn lạc và đếm chúng. Nếu trên các đĩa có nấm mọc quá nhanh thì có thể đếm các
khuẩn lạc sau khi ủ 2 ngày và đếm lại sau khi ủ 5 ngày.
Tiến hành kiểm tra bằng kính hiển vi để phân biệt giữa các tế bào nấm men hoặc
nấm mốc và vi khuẩn từ các lạc khuẩn, nếu cần.
Đếm các khuẩn lạc nấm men và nấm mốc riêng rẽ, nếu cần.
Để nhận biết nấm men và nấm mốc, chọn các vùng phát triển nấm và lấy ra để kiểm
tra bằng kính hiển vi hoặc cấy trên môi trường phân lập hoặc nhận dạng thích hợp.
2.1.5.2. Kết quả.
2.1.5.3. Tính toán kết quả.
Tổng số nấm men và nấm mốc trong 1g mẫu (X) được tính theo công thức

X=
∑C (CFU/g hay CFU/ml)
V × ( n1 +0.1 ×n2 ) × d

C: tổng số khuẩn lạc nấm men hoặc nấm mốc đếm được trên 4 đĩa của 2 độ pha
loãng liên tiếp.
V: thể tích dịch cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit
n1: Số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất.
n2: Số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất.
d: Hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất
Làm tròn số kết quả có được tới 2 số có nghĩa ( chẳng hạn 2864 làm tròn 2900) và
biểu thị theo công thức: a x 10n
a: số thập phân tương ứng có giá trị từ 1.0 đến 9.9
n: số mũ phù hợp của 10
2.1.5.4. Biểu thị kết quả.
Ví dụ cách tính tổng nấm men, nấm mốc:
Độ pha loãng 10-2 10-3
Số khuẩn lạc 83 13
97 8
Số khuẩn lạc nấm men hoặc nấm mốc đếm được trên hai độ pha loãng liên tiếp là:
GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 14
 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

 Ở độ pha loãng d=10-2: đếm được 83 khuẩn lạc và 97 khuẩn lạc

 Ở độ pha loãng d=10-3: đếm được 13 khuẩn lạc và 8 khuẩn lạc, ta có

X=
∑C =
83+ 97+13+8
−2
V × ( n1 +0.1 ×n2 ) × d 0.1× ( 2+ 0.1× 2 ) × 10

Làm tròn kết quả là 9.1 x 104 CFU/g

2.2. Phương pháp 2: phân lập nấm men, nấm mốc ưa khô
Phân lập nấm men, nấm mốc chịu sự thẩm thấu (osmophilic) có thể phát triển ở
nồng độ đường cao. Để có được những gốc giống này cần phải điều chỉnh hoạt độ nước
(aw) của việc pha loãng (diluent) và môi trường phân lập nước pha loãng có 50% (W/w)
glucose. Môi trường thạch chứa 35-60% glucose sẽ cho phép tìm lại được gốc giống chịu
khô hanh (xerotolerant strains) không xảy ra phát triển dưới những điều kiện như thế này
loại trừ gốc giống cây hư hỏng tiềm tàng mặt hàng có lượng đường cao như mứt kẹo, a w
của môi trường giảm có thể đòi hỏi ủ ấm kéo dài nhiều tuần.
Cách làm
1. Chuẩn bị mẫu đồng nhất 10-1 và một loạt mấu thực phẩm pha loãng ở dung dịch
glucose 50% (W/W)
2. Một ước số phù hợp của mẫu đồng nhất và pha loãng trải trên bề mặt cao nấm
men, mạch nha 40% (W/W) thạch glucose
3. Ủ ấm đĩa nuôi nấm mốc ở 20-25 ⁰C và đĩa nuôi nấm men ở 25-30⁰C, đối với nấm
men phải tới 3 tuần.
4. Đếm khóm nấm men và nấm mốc và tính toán ước lượng trong mỗi gam.
2.3. Phương pháp 3: Đếm nấm men và nấm mốc bằng phương pháp màng khô có thể
hoàn nước (Phương pháp Petrifilm TM)
2.3.1. Nguyên tắc
Phương pháp này sử dụng các đĩa cấy chứa môi trường khô được bổ sung các kháng
sinh, thuốc nhuộm để tăng khả năng quan sát sự phát triển và các chất tạo đông có thể tan
trong nước lạnh. Các dung dịch huyền phù chưa pha loãng hoặc đã pha loãng được cho

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 15

 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

vào các đĩa với lượng 1 ml/đĩa. Dàn đều dung dịch huyền phù trên diện tích khoảng 30
cm2. Có thể dùng chất tạo đông để làm đông đặc các đĩa, ủ ấm và đếm nấm men và nấm
mốc.
2.3.2. Thuốc thử
Trong quá trình phân tích, chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất
hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có qui định khác.
 Nước pha loãng, dung dịch nước đệm phosphat: Cho 34 g KH 2PO4 vào 500 ml
nước đựng trong bình định mức 1 lít. Dùng natri hydroxit để chỉnh pH đến 7,2 và
pha loãng bằng nước đến vạch. Khử trùng dung dịch 15 min trong nồi hấp áp lực ở
121 °C. Bảo quản dung dịch gốc này trong tủ lạnh. Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng
pha loãng bằng cách dùng pipet lấy 1,25 ml dung dịch gốc cho vào bình định mức
1 I và pha loãng bằng nước đến vạch. Phân phối 90 ml ± 1 ml hoặc 99 ml ± 1 ml
dung dịch này vào các chai. Khử trùng các chai này 15 min trong nồi hấp áp lực ở
121 °C.
 Kali dihydro phosphat (KH2PO4).
 Natri hydroxit (NaOH), dung dịch 1 M (40 g/L)
 Dung dịch clotetraxyclin.
 Dung dịch cloramphenicol.
 Chất tạo đông có thể tan trong nước lạnh.
2.3.3. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và các thiết bị,
dụng cụ sau đây:
 Đĩa đếm nấm men và nấm mốc: Các đĩa chứa chất dinh dưỡng được bổ sung
clotetraxyclin, cloramphenicol, chất tạo đông tan trong nước lạnh và thuốc nhuộm
màu nhạy với phosphataza (5-brom-4-clo-3-indolyl phosphat) để tăng khả năng
quan sát sự phát triển của nấm men và nấm mốc. Khoanh tròn vùng phát triển trên
mỗi đĩa có ba mươi ô vuông 1 cm x 1 cm trên nền màng mỏng1).

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 16

 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

 Que dàn mẫu bằng chất dẻo, để dàn đều huyền phù lên khắp vùng phát triển của
đĩa.
 Pipet, dùng cho huyết thanh học hoặc pipet dạng xylanh có thể phân phối 1,0 ml.
 Dụng cụ đếm khuẩn lạc, loại chuẩn hoặc loại có độ khuếch đại tương đương 1,5
lần.
 Bộ trộn: Bộ trộn cơ có tốc độ cao từ 10 000 vòng/min đến 12 000 vòng/min hoặc
loại túi nhu động.
 Binh định mức 1l.
 Nồi hấp áp lực.
2.3.4. Chuẩn bị
2.3.4.1. Yêu cầu chung
Bảo quản các túi đĩa đựng đĩa đếm nấm men và nấm mốc chưa mở ở nhiệt độ dưới 8
°C. Sau khi mở, để các đĩa chưa sử dụng vào lại trong túi. Đóng kín túi bằng cách gấp và
cuộn đầu mỏ. Bảo quản túi đựng đã đóng kín lại này ở nhiệt độ dưới 8 °C, nơi khô ráo.
Các đĩa sau khi đã mở chỉ được dùng trong một tháng. Để các đĩa đếm nấm men và nấm
mốc tiếp xúc với nhiệt độ cao hơn 25 °C và độ ẩm tương đối cao hơn 50 % có thể ảnh
hưởng đến tính năng của đĩa.
Sau khi sử dụng, các đĩa vẫn còn chứa khuẩn lạc nấm men và/hoặc nấm mốc mà có
thể phát triển được, nên trước khi thải bỏ cần được khử trùng bằng hấp áp lực 15 min ở
121 °C.
2.3.4.2. Chuẩn bị huyền phù thử nghiệm
Chuẩn bị huyền phù từ sản phẩm thực phẩm trong điều kiện vô trùng với độ pha
loãng 1/10 hoặc lớn hơn bằng nước. Trộn bằng bộ trộn hoặc túi nhu động trong 2 min và
đổ đĩa. Chuẩn bị các dung dịch pha loãng tiếp theo, nếu cần.

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 17

 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

2.3.5. Cách tiến hành

Đặt đĩa đếm nấm men và nấm mốc lên bề mặt mặt pbẳng. Nhấc tấm màng mỏng
phía trên ra, giữ pipet vuông góc với đĩa và cấy cẩn thận 1 ml huyến phù thử nghiệm vào
chính giữa mảng mỏng. Đậy tấm màng mòng phía trên xuống chất cấy.
Dùng tay nhấc que dàn mẫu bằng chất dẻo. Dóng thẩng tâm que dán mẫu với tâm
dĩa. Dàn đều huyền phù bằng cách ấn nhẹ que dàn mẫu xuống tâm đĩa. Không gạt que dàn
mẫu từ bên này sang bẽn kia màng mỏng. Lấy que dàn mẫu ra và để yên đĩa trong 1 min
cho đông đặc lại.
Đặt các đĩa vào tủ ấm theo phương nằm ngang, hướng lên trên, không chồng cao
quá 20 đĩa. Ủ các đĩa này năm ngày ở nhiệt độ từ 20 °C đến 25 °C.
Đếm các đĩa ngay sau giai đoạn ủ. Các khuẩn lạc nhỏ có màu xanh lục hoặc trắng
nhạt là nấm men. Các khuẩn lạc nấm mốc thường có màu xanh nhưng cũng có thể có sắc
tố tự nhiên của chúng (ví dụ: màu đen, vàng, xanh lục), chúng có khuynh hướng lớn hơn
và khuếch tán nhiều hơn so với các khuẩn lạc nấm men.
Để tính số nấm men và nấm mốc, nhân số lượng tổng số nấm men và nấm mốc/đĩa
(hoặc số lương trung bình các khuẩn lạc/đĩa, nếu đếm các đĩa kép của cùng một độ pha
loãng) với hệ số pha loãng tương ứng. Khi đếm các khuẩn lạc trên các đĩa kép của các độ
pha loãng kế tiếp, thì tính số lượng trung bình các khuẩn lạc cho mỗi độ pha loãng trước
khi xác định trung bình số đếm của nấm men và nấm môc.
Các số đếm ước tính có thể được thực hiện trên các đĩa có nhiều hơn 150 khuẩn lạc
và phải được ghi là số ước tính. Trong việc đếm như thế, xác định số đếm trung bình/1
cm2 và nhân với 30 (diện tích phát triển là khoảng 30 cm2).
Với số lượng lớn các khuẩn lạc nấm men có thể làm cho toàn bộ diện tích phát triển
trở thành màu xanh. Với số lượng lớn các khuẩn lạc nấm mốc có thể làm cho toàn bộ diện
tích phát triển trở thành màu xanh, màu đen, màu vàng ...Khi đó, không thể có được số
đếm ước tính, nhưng có thể pha loãng tiếp và đổ đĩa huyền phù thử nghiệm để thu được
số đếm chính xác hơn.

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 18

 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

2.3.6. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin dưới đây:
 Mọi thông tin cần thiết để nhận biết hoàn toàn mẫu thử;
 Viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp đã sử dụng;
 Kết quả và đơn vị biểu thị kết quả;
 Ngày tháng lấy mẫu và phương thức lấy mẫu (nếu có);
 Ngày tháng nhận mẫu phòng thử nghiệm;
 Ngày tháng thử nghiệm;
 Các điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm;
 Mọi thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tuỳ chọn, cùng
với các chi tiết của sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 19

 Phâ n tích vi sinh thự c phẩ m

Tài liệu tham khảo

1. Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm Tp.HCM, Phân Tích Vi Sinh Thực
Phẩm
2. Trần Linh Thước, Phương Pháp Phân Tích Vi Sinh Vật Trong Nước, Thực Phẩm
Và Mỹ Phẩm.
3. Nguyễn Phùng Tiến, Bùi Minh Đức, Nguyễn Văn Dịp, Vi sinh vật thực Phẩm, kỹ
thuật kiểm tra và chỉ tiêu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm
4. TIÊU CHUẨN QUỐC GIA, TCVN 8275-1:2010 (ISO 21527-1:2008)
5. TIÊU CHUẨN QUỐC GIA, TCVN 8275-2:2010 (ISO 21527-2:2008)
6. TIÊU CHUẨN QUỐC GIA, TCVN 7852:2008, Đếm nấm men và nấm mốc bằng
phương pháp màng khô có thể hoàn nước ( Phương pháp Petrifilmtm)
7. Hoạt độ nước (ký hiệu là aw) là lượng nước tự do tồn tại trong sản phẩm hoặc vật chất. Nó
được xác định như là tỷ lệ giữa áp suất bay hơi của nước trong vật chất chia cho áp suất
bay hơi của nước tinh khiết ở cùng điều kiện nhiệt độ. Nước cất có hoạt độ nước bằng 1,0.
Khi nhiệt độ tăng thì aw tăng, ngoại trừ một số sản phẩm tinh luyện với muốihoặc đường.

GVHD: Nguyễn Thị Kim Oanh 20