Professional Documents
Culture Documents
BÁO CÁO
THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM
Tp HCM, 11/2013
MỤC LỤC
BÀI 9: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN CÁC LOẠI ĐƯỜNG......................................55
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Một số dung cụ và kỹ thuật gieo cấy vi khuẩn...................................................................5
Hình 2. Mẫu cấy ziczac và cấy song song.......................................................................................6
Hình 3. Cấy gạc trên môi trường đĩa petri.......................................................................................6
Hình 4. Cách cấy truyền trên môi trường đĩa thạch.........................................................................7
Hình 5. Các kiểu cấy trên đĩa thạch.................................................................................................7
Hình 6. Trình tự cấy truyền..............................................................................................................8
Hình 7. Qui trình pha loãng mẫu.....................................................................................................9
Hình 8. Trình tự pha loãng mẫu.....................................................................................................12
Hình 9. Các kiểu cấy ria................................................................................................................13
Hình 10. Cấu tạo kính hiển vi quang học......................................................................................17
Hình 11. Cách làm tiêu bản giọt ép................................................................................................19
Hình 12, cách làm tiêu bản giọt treo..............................................................................................19
Hình 13. Nấm men (trái) Bacillus Subtilis (phải) dưới kính hiển vi.............................................21
Hình 14. Vi khuẩn Lactose Bacillus..............................................................................................21
Hình 15. Dưa cải muối chua, nem chua.........................................................................................23
Hình 16.chế phẩm vi sinh từ Bacillus Subtilis...............................................................................23
Hình 17.Hình vẽ nấm men.............................................................................................................24
Hình 18. Cách pha loãng mẫu và hình ảnh buồng đếm.................................................................27
Hình 19: Cấu tạo buồng đếm và các vùng đếm.............................................................................28
Hình 20. ứng dụng của nấm men trong sản xuất bánh mì, rượu, bia.............................................30
Hình 21. Các bước nhuộm Gram VSV..........................................................................................33
Hình 22. Hình VSV dưới kính hiển vi: bacillus subtilis, E.coli, Lactic........................................34
Hình 23. Mẫu nhuộm Gram Bacillus Subtilis, E.coli, Lactic........................................................35
Hình 24. Hình ảnh quan sát được..................................................................................................36
Hình 25. Sản phẩm thạch dừa........................................................................................................37
Hình 26. Probiotic với vai trò hang rào phòng ngự bảo vệ niêm mạc ruột...................................39
Hình 27. Chao từ nấm Mucor........................................................................................................43
Thóc Dd đường
Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 1
malt
Xay nhuyễn Hấp tiệt trùng trong nồi
autoclave
Cân 60g malt Kết tủa
Lọc tinh
Đun cách thuỷ (1)
H2O 300ml Đo độ đường, Vdd protein
Nâng nhiệt (2) Chỉnh độ đường (3)
Thử liugon
Bổ sung agar 2-2,5%
Lọc thô bã
Đun cách thuỷ
Dd đường Đồng hoá
Định hình
Mẫu môi
trường
Ghi chú:
(1) Đun cách thuỷ: nhiệt độ: 42-450C, thời gian 30 phút
(2) Nâng nhiệt: 68-700C, thời gian 1h
(3) Chỉnh độ đường: dùng balling kế đưa về dung dịch đường 70
(4) Phân phối: 3 ống nghiệm 1/4, 2 ống nghiệm ½
(5) Hấp tiệt trùng: 15-20p
Môi trường thạch nghiêng: cho vào 1/4 ống nghiệm sau đó để nghiêng định hình
Môi trường thạch đứng: cho vào ½ ống nghiệm sau đó để thẳng đứng
Thao tác phân phối phải nhanh, khéo léo để môi trường không dính vào miệng ống
nghiệm, đĩa petri hay nút bông và cần thực hiện trước khi môi trường bị đông đặc.
Môi trường thạch phải phẳng, nhẵn.
- Cấy trộn: phối trộn dịch cấy với thạch (500C) sau đó lắc đều và đổ vào hộp petri
đã khử trùng. Xoay tròn đĩa để thạch phân bố đều, để yên cho môi trường đặc lại
và cuối cùng là bao gói và nuôi trong tủ ấm. (có thể cho dịch cấy vào petri trước
và tiếp theo đổ thạch vào đĩa petri).
- Cấy ria: là việc sử dụng que cấy có chứa mẫu sau đó lướt que cấy lên mặt thạch
theo hình chữ chi hay đường song song hoặc theo 4 góc.
5. Tiến hành thí nghiệm (gieo cấy trên môi trường thạch nghiêng ống nghiệm)
Mô tả qui trình:
a) Một tay cầm 2 ống nghiệm: một ống canh trường và một ống môi trường (ống canh
trường nằm bên ngoài, ống môi trường nằm bên trong)
Tay còn lại cầm que cấy và đốt đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.
Dùng ngón út và áp út rút nút bông của ống canh trường ra.
d) Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo kiểu hình chữ chi.
Mẫu Mẫu
Mô tả qui trình:
o Chuẩn bị sẵn 95ml nước vô khuẩn trong bình tam giác và 5 ống nghiệm chứa 9ml
nước vô khuẩn
o Dùng pipet 10ml hút 5ml vi sinh vật cho vào bình tam giác có chứa sẵn 95ml
nước vô khuẩn và lắc đều (bình mẫu).
o Dùng pipet 1ml hút 1ml vi sinh vật từ bình mẫu cho vào ống nghiệm thứ nhất có
chứa sẵn 9ml nước vô khuẩn (độ pha loãng 10-1)
o Tiếp tục dùng pipet 1ml hút 1ml vi sinh vật từ ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm
thứ 2 có chứa sẵn 9ml nước vô khuẩn (độ pha loãng 10-2)
o Lần lượt ta làm tương tự đối với ống thứ 3, thứ 4 và thứ 5(độ pha loãng 10-3, độ
pha loãng 10-4, độ pha loãng 10-5)
b. Phân lập: đối với mẫu có độ pha loãng: 1 ống 10-3, 1 ống 10-4, 1 ống 10-5
Hấp cách thủy, rã đông môi trường ½ .
Tháo bao gói petri đã vô khuẩn, hơ quanh hộp petri trên ngọn lửa đèn cồn.
Tay trái cầm hộp petri, dùng ngón tay hé mở nắp và rồi dùng tay phải đổ thạch đã
rã đông vào trong hộp petri.
Xoay đều để thạch phân bố đều trong hộp và bề mặt phẳng, nhẵn. Để nguội cho
thạch đông lại.
Dùng pipet lấy mẫu ở ống nghiệm có độ pha loãng 10-3 và cho vào hộp petri (vẫn
dùng tay để hé nắp hộp petri).
Vô khuẩn que trang bằng cồn và hơ nóng, sau đó để nguội rồi dàn đều mẫu trên
bề mặt thạch để nấm men phát triển đều trên khắp bề mặt thạch.
Để ổn định trong 5 phút, lật ngược hộp petri lại và tiến hành bao gói.
Để nguội trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp (28-300C), trong vòng 48-72 giờ.
III. Bàn luận và mở rộng
⅀C
X= (tế bào/1ml mẫu)
( n1+0.1 n 2+0.01 n 3 ) .d n
Trong đó:
⅀C : tổng số khuẩn lạc của tất cả hộp petri đã chọn.
n1, n2, n3: số hộp petri gieo cấy ở các nồng độ khác nhau
dn: hệ số pha loãng gieo cấy đậm đặc.
Kết quả thu được:
⅀C n1 n2 n3 dn X
118 0 2 1 10-4 5 619 048
Ở đây xin cung cấp thêm một số thông tin về 2 phương pháp định lượng VSV trực
tiếp thường dùng sau phương pháp dùng buồng đếm hình cầu: phương pháp đo độ đục và
MPN
Phương pháp đo độ đục:
o Cơ sở: khi pha lỏng chứa nhiều phần tử không tan sẽ tạo thành hệ huyền phù và có độ
đục bởi các thành phần trong môi trường lỏng cản ánh sang, làm phân tán chùm sáng tới.
Tế bào VSV là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm đục môi trường
o Phương pháp: xác lập quan hệ tỉ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào VSV và độ đục.
Ưu nhanh, gọn, dễ quan sát. tiêu bản giữ được lâu hơn,
điểm quan sát dễ dàng hơn.
Nhược không quan sát được trong Khó làm
điểm thời gian lâu
Ngâm lam kính và lam men trong cồn 700 để tiệt trùng
Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 17
Dùng kéo kẹp lam kính và hơ trên đèn cồn.
Đặt lam kính lên giá đỡ.
Đánh đều mẫu.
Số 12 14 8
Nấm men Vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Lactose
Subtilic Bacillus
KíKích Rất lớn Rất bé: 0.5-1 µm Rất bé
Dài:10-12µm
thước
Rộng:2-7 µm
Hình dạng Hình cầu Trực khuẩn ngắn, trực khuẩn dài
Oval
Ellipse
Khuẩn ty giả
Do điều kiện kính hiển vi không tốt lắm nên việc quan sát gặp nhiều khó khăn. Nên hình
ảnh của nấm men thì tương đối riêng vi khuẩn thì khó quan sát.
Hình ảnh mẫu quan sát được
o Mở rộng
Vi khuẩn Lactobacillus được sử dụng trong nhiều sản phẩm probiotic, các chủng
Lactobacillus có đặc tính probiotic ở đường dạ dày – ruột người. Ngoài ra, các chủng
Lactobacillus có đặc tính probiotic ở trên cũng thể hiện một số ích lợi đối vớisức khỏe
con người như: kháng với các vi khuẩn gây bệnh, tạo ra bacteriocin và các chất kháng
khuẩnkhác. Đồng thời, chúng cũng kháng với một số loại kháng sinh. Tùy theo khả năng
kháng kháng sinh của mỗi chủng, chúng có thể được đưa vào cơ thể của các bệnh nhân sử
dụng các loại kháng sinh (như: amikacin, kanamycin, gentamicin, streptomycin,
vancomycin và co-trimoxazole) mà không bị tiêu diệt bởi các loại kháng sinh mà chúng
kháng lại, từ đó tạo nên những hiệu quả có lợi cho bệnh nhân.
Hơn nữa, các chủng Lactobacillus này cũng an toàn đối với người sử dụng khi
nhạy cảm vớ một số loại kháng sinh. Đặc biệt, 11 chủng Lactobacillus (gồm: L.
paracasei/ casei B5, L. salivarius B6, L. gasseri B8a, L. fermentum B8b, L. fermentum
Cụ thể:
- Hình dạng: có hình bầu dục, hình trứng,… (tùy điều kiện môi trường).
- Cấu tạo tế bào: thành tế bào, màng tế bào, tế bào chất, ty thể, riboxom, nhân, không bào
và các hạt dự trữ.
- Những thay đổi của tế bào nấm men trong quá trình phát triển:
o Nấm men trẻ (qua 12-16 giờ nuôi cấy): màng mỏng, tế bào chất đồng nhất, không bào
chưa có hoặc mới bắt đầu xuất hiện, tế bào sinh sản chiếm tỷ lệ cao.
o Nấm men trưởng thành (24-48 giờ): không bào lớn, số không bào có thể đến hai, lượng
glycogen tăng, tế bào sinh sản chiếm tỷ lệ cao 10-15%.
Lưu ý: tế bào được xem là đang nảy chồi là những tế bào có tế bào con bé hơn hoặc bằng
½ tế bào mẹ, nếu tế bào con lớn hơn ½ tế bào mẹ thì phải tính là 2 tế bào.
Bảng 6.Tỷ lệ nảy chồi của nấm men
% tỷ lệ không nảy
Vùng Nảy chồi Tổng nấm % tỷ lệ nảy chồi
chồi
1 5 33 15.2% 84.8%
2 5 37 13.5% 86.5%
3 3 23 21.7% 78.3%
4 17 71 23.5% 76.5%
5 12 82 14.6% 85.4%
Tổng 42 246 17.1% 82.9%
Kết luận: tỷ lệ tế bào nảy chồi chiếm trung bình 17% tức là tế bào nấm men đang ở cuối
giai đoạn trường thành (tỷ lệ nảy chồi 10 – 15%) đầu giai đoạn già.
3. Quan sát tỷ lệ sống chết:
Cơ sở của việc nhuộm màu nấm men
o Thuốc nhuộm đi qua màng tế bào chết dễ hơn tế bào sống.
o Nguyên sinh chất tế bào chết dễ bắt màu.
→ Vì vậy ta dùng xanh metylen (pha loãng 10 lần) để nhuộm màu, phân biệt tế bào sống
và tế bào chết.
Chờ khoảng 1-2 phút đủ thời gian để màu thấm vào tế bào nấm men.
Chuẩn bị mẫu
Tổng số tế % tỷ lệ chết
vùng Tế bào chết Tế bào sống
bào
1 20 107 127 15.7%
2 5 59 64 7.8%
3 10 65 75 13.3%
4 17 117 134 12.7%
5 22 110 132 16.7%
Kết luận: tỷ lệ tế bào chết >> 4%, số tế bào chết quá lớn. Việc này không thích hợp cho
việc chuyển canh trường này để nuôi cấy.
4. Đếm tế bào nấm men trong 1ml canh trường: (dùng buồng đếm Thomas)
o Pha loãng mẫu với độ pha loãng 10-2.
o Tiệt trùng buồng đếm bằng cách ngâm trong cồn 700.
Hình 18. Cách pha loãng mẫu và hình ảnh buồng đếm
Đậy lá kính lên trên buồng đếm và nhỏ mẫu vào khe hẹp phía trên buồng đếm,
dùng giấy thấm , sau đó tiến hành quan sát bằng kính hiển vi trên 3 trong 5 vùng của
buồng đếm. (lưu ý: khi vi sinh vật nằm ở biên giới thì chỉ đếm trên 2 cạnh liên tiếp).
2 3
a . b .103
x=
V .c
Bảng 8. Số VSV trong ba vùng quan sát và tổng số VSV TB trong 1ml mẫu
Hình 20. ứng dụng của nấm men trong sản xuất bánh mì, rượu, bia
Nấm men là tác nhân cơ bản gây nên quá trình lên men rượu, tuy nhiên không
phải loài nào cũng lên men đường thành rượu được mà chỉ có một số loài có khả năng
này. Trong sản xuất hiện nay người ta thường dùng một số loài thuộc họ
Saccharomycesaceae.
Theo đặc tính lên men người ta chia nấm men thành hai nhóm: nấm men lên men
nổi và nấm men lên men chìm (Tiêu biểu là loài Saccharomyces ellipsoideus. Nấm men
chìm thường dung trong sản xuất bia, rượu vang, sampan). Nấm men nổi ít được sản
xuất bia vì tạo đục gây mất cảm quan cho sản phẩm.
Phức của VSV Gram (+) Phức của VSV Gram (-)
Loại phức chất có khả năng giữ Loại phức chất không còn giữ được màu của thuốc
nguyên màu của thuốc nhuộm nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu
nên không bị rửa trôi khi xử lý của thuốc nhuộm bổ sung
d. Nhuộm Gram
Các bước thực hiện:
Nhuộm màu
Nhỏ fuchshin bazơ để từ 1-2 phút
Rửa, lau khô ( tránh lau chà mạnh trên vết VK)
Ép lá kính lại, quan sát trên KHV
Sau mỗi bước phải rửa nước, rồi dùng giấy thấm khô.
e. Nhuộm
màng
nhày
Cố định
Hình 21. Các bước nhuộm Gram VSV
Rửa nước => thấm khô nước => quan sát trên KHV
Hình ảnh
Hình 22. Hình VSV dưới kính hiển vi: bacillus subtilis, E.coli, Lactic
Hình ảnh
Phó-mát Camembert
Đây là một của nhiều phó-mát bề mặt chín. Có nguồn gốc từ Normandy, Pháp lần
đầu tiên nó được làm bởi Marie Harel vào năm 1791. Năm 1890, M. Ridel phát triển hộp
gỗ nổi tiếng tạo điều kiện xuất khẩu với lượng lớn.
Tempeh
Tempeh có nguồn gốc từ Java, Indonesia nhưng cũng được phổ biến ở Hà Lan và
nó đã đạt được thị trường tiêu thụ đáng kể ở Mỹ, châu Âu và Úc. Tempeh là một bánh có
thể thái (cắt) được, thu được bởi phương pháp lên men bề mặt với nấm của những hạt
đậu, ngũ cốc hoặc vật liệu phù hợp khác sau khi đã ngâm rồi nấu. Cơ chất được dùng
nhiều và phổ biến nhất là đậu nành (Nout and Rombouts, 1990; Wood, 1998). Tempeh
cung cấp một nguồn đạm thực vật rẻ tiền giàu dinh dưỡng dễ tiêu hoá và an toàn. Nó
thường được ăn chỉ khi sau khi nấu hoặc rán/chiên trong dầu.. Đậu nành được ngâm và
tách vỏ, hoặc tách vỏ khô trước rồi ngâm (cơ giới hoá như ở Hà lan). Trong quá trình
ngâm sự lên men lactic tự nhiên diễn ra làm hạ thấp pH của đậu, làm cho chúng phù hợp
hơn cho sự phát triển của nấm mốc và chống lại vi khuẩn gây hư hỏng và các mầm bệnh.
Sau khi nấu sôi và làm nguội, làm cơ chất cho quá trình lên men. Mốc chức năng
chính yếu là Rhizopus oligosporus và R.oryzae, chúng nảy mầm nhanh ở 37°C và sự phát
triển sợi nấm nhanh của chúng đảm bảo sự chiếm ưu thế và lấn át các dòng tạm nhiễm
khác như Aspergillus spp. trong vòng 30 giờ các đậu rời rạc đã được kết chặt lại nhau tạo
thành khối rắn. R.oligosporus được khảo sát là thâm nhập khoảng 2mm vào sâu bên trong
đậu nấu.
Hoạt động enzim của Rhizopus spp. bao gồm enzim thuỷ phân protein, enzim
thuỷ phân chất béo, enzim thuỷ phân các hơp chất các-bon và phosphatase. Nhờ hoạt
động của các enzim này, một phần các cơ chất mạch dài bị thuỷ phân thúc đẩy cho sự tiêu
hoá dễ dàng.
Qui trình mới cải tiến đã được báo cáo bao gồm tiến trình bán liên tục cho lên men
tempeh với nhiệt độ được điều khiển trong thùng lên men xoay vòng.
Nó là một chất lỏng nâu xậm trong với thành phần xấp xỉ: 17% NaCl, 1,6% đạm
tổng số, 1% đạm formol, 3% đường khử, 2,3% rượu alcohol và pH 4.7. Về cơ bản của
quá trình chế biến (Hình 7.4) bao gồm 3 giai đoạn: đậu nành lên men trong nước muối và
lọc trong. Nó được chủng giống với bào tử Aspergillus oryzae hoặc A.sojae và được ủ ở
25°C trong 2-3 ngày để thu được sự phát triển dày đặc và sự tạo bào tử xanh vàng chỉ ra
rằng mức độ cao của enzim đã được tạo ra. Những enzim này bao gồm peptidases,
Làm giàu thêm đạm cho thực phẩm tinh bột và thức ăn gia súc
Do có khả năng phân cắt vật chất các-bon, nấm là hữu dụng trong việc nâng cao
giá trị dinh dưỡng của các sản phẩm phụ nông-công nghiệp sau chế biến, chẳng hạn như
tinh bột chứa trong chất cặn bã khoai lang (Yang et al., 1993) hoặc bã mía đường
cellulose (Moo-Young et al., 1992). Cho mục đích thêm vào các nguồn đạm rẽ tiền như
(NH4)2SO4 và urea có thể biến đổi thành đạm vì thế làm giàu dinh dưỡng thêm cho thức
ăn. Sản phẩm cuối cùng (sau vài ngày lên men) có thể chứa dựng xấp xỉ 30% đạm thô
trên trọng lượng khô, khi sử dụng nấm Aspergillus niger, Rhizopus spp. và Neurospora
sitophila.
Hình 31. Nấm mốc tân công nông sản, trái cây
Hình 32. Mẫu nấm men hiếu khí (bên trái) và yếm khí (bên phải) so với mẫu chuẩn
Bacillus Subtilis
Cả 2 mẫu hiếu khí và yếm khí đều chuyển màu, từ xanh sang vàng.
Mẫu hô hấp hiếu khí vàng nhiều hơn.
Lacto bacillus
Cả 2 mẫu hiếu khí và yếm khí đều chuyển màu, từ xanh sang vàng xanh.
Theo lý thuyết mẫu yếm khí vàng nhiều hơn do quá trình oxi hoá xảy ra mạnh hơn
nhưng do quá trình đuổi khí không hoàn toàn nên màu sắc mẫu yếm khí thực tế
khác lý thuyết.
Hình 34. Mẫu Lacto bacillus hô hấp hiếu khí (bên trái) và yếm khí (bên phải)
Hình 35. Mẫu A.oryzae hô hấp hiếu khí (bện trái) và yếm khí (bên phải)
Hình ảnh
Hình 39. Acetobacterxylium trong trong môi trường theo thứ tự S-L-M-L.
IV. Mở rộng
Việc tìm hiểu xem loại VSV nào có khả năng lên men loại đường nào và loại nào là tốt
nhất nhằm mục đích chọn được chủng vi sinh vật tối ưu tuỳ theo mục đích sản phẩm. Ví
dụ:
+ Nấm men có khả năng lên men mạnh Glucose, Sacarose. Ứng dụng lên men nguyên
liệu giàu những loại đường này: các dịch quả => tạo rượu.