Professional Documents
Culture Documents
BÁO CÁO
THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM
Tp HCM, 11/2013
MỤC LỤC
BÀI 9: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN CÁC LOẠI ĐƯỜNG...................................... 55
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Một số dung cụ và kỹ thuật gieo cấy vi khuẩn .................................................................. 5
Hình 2. Mẫu cấy ziczac và cấy song song ...................................................................................... 6
Hình 3. Cấy gạc trên môi trường đĩa petri ...................................................................................... 6
Hình 4. Cách cấy truyền trên môi trường đĩa thạch ........................................................................ 7
Hình 5. Các kiểu cấy trên đĩa thạch ................................................................................................ 7
Hình 6. Trình tự cấy truyền............................................................................................................. 8
Hình 7. Qui trình pha loãng mẫu .................................................................................................... 9
Hình 8. Trình tự pha loãng mẫu .................................................................................................... 12
Hình 9. Các kiểu cấy ria ................................................................................................................ 13
Hình 10. Cấu tạo kính hiển vi quang học...................................................................................... 17
Hình 11. Cách làm tiêu bản giọt ép............................................................................................... 19
Hình 12, cách làm tiêu bản giọt treo ............................................................................................. 19
Hình 13. Nấm men (trái) Bacillus Subtilis (phải) dưới kính hiển vi ............................................ 21
Hình 14. Vi khuẩn Lactose Bacillus ............................................................................................. 21
Hình 15. Dưa cải muối chua, nem chua ........................................................................................ 23
Hình 16.chế phẩm vi sinh từ Bacillus Subtilis .............................................................................. 23
Hình 17.Hình vẽ nấm men ............................................................................................................ 24
Hình 18. Cách pha loãng mẫu và hình ảnh buồng đếm ................................................................ 28
Hình 19: Cấu tạo buồng đếm và các vùng đếm ............................................................................ 28
Hình 20. ứng dụng của nấm men trong sản xuất bánh mì, rượu, bia ............................................ 30
Hình 21. Các bước nhuộm Gram VSV ......................................................................................... 33
Hình 22. Hình VSV dưới kính hiển vi: bacillus subtilis, E.coli, Lactic ....................................... 34
Hình 23. Mẫu nhuộm Gram Bacillus Subtilis, E.coli, Lactic ....................................................... 35
Hình 24. Hình ảnh quan sát được ................................................................................................. 36
Hình 25. Sản phẩm thạch dừa ....................................................................................................... 37
Hình 26. Probiotic với vai trò hang rào phòng ngự bảo vệ niêm mạc ruột................................... 39
Hình 27. Chao từ nấm Mucor ....................................................................................................... 43
Th Dd đường
óc
Xay nhuyễn Hấp tiệt trùng trong
m
nồi autoclave
alt
Cân 60g malt
Lọc tinh Kết tủa
Đun cách thuỷ (1) H2O protei
Đo độ đường, Vdd
300ml n
Nâng nhiệt (2)
Chỉnh độ đường (3)
Thử liugon
Bổ sung agar 2-2,5%
Lọc thô bã
Đun cách thuỷ
Dd đường
Đồng hoá
Định hình
Mẫu
môi
Ghi chú: trường
(1) Đun cách thuỷ: nhiệt độ: 42-450C, thời gian 30 phút
(2) Nâng nhiệt: 68-700C, thời gian 1h
(3) Chỉnh độ đường: dùng balling kế đưa về dung dịch đường 70
(4) Phân phối: 3 ống nghiệm 1/4, 2 ống nghiệm ½
(5) Hấp tiệt trùng: 15-20p
Môi trường thạch nghiêng: cho vào 1/4 ống nghiệm sau đó để nghiêng định hình
- Cấy trộn: phối trộn dịch cấy với thạch (500C) sau đó lắc đều và đổ vào hộp petri
đã khử trùng. Xoay tròn đĩa để thạch phân bố đều, để yên cho môi trường đặc lại
và cuối cùng là bao gói và nuôi trong tủ ấm. (có thể cho dịch cấy vào petri trước và
tiếp theo đổ thạch vào đĩa petri).
- Cấy ria: là việc sử dụng que cấy có chứa mẫu sau đó lướt que cấy lên mặt thạch
theo hình chữ chi hay đường song song hoặc theo 4 góc.
5. Tiến hành thí nghiệm (gieo cấy trên môi trường thạch nghiêng ống nghiệm)
Mô tả qui trình:
a) Một tay cầm 2 ống nghiệm: một ống canh trường và một ống môi trường (ống canh trường
nằm bên ngoài, ống môi trường nằm bên trong)
Tay còn lại cầm que cấy và đốt đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.
Dùng ngón út và áp út rút nút bông của ống canh trường ra.
c) Đợi que cấy nguội, lấy vi sinh vật từ ống canh trường đưa sang ống môi trường.
d) Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo kiểu hình chữ chi.
Mẫu Mẫu
Mô tả qui trình:
⅀𝐶
X=(𝑛1+0.1𝑛2+0.01𝑛3).𝑑𝑛 (tế bào/1ml mẫu)
Trong đó:
⅀C : tổng số khuẩn lạc của tất cả hộp petri đã chọn.
n1, n2, n3: số hộp petri gieo cấy ở các nồng độ khác nhau
dn: hệ số pha loãng gieo cấy đậm đặc.
Kết quả thu được:
⅀𝐶 n1 n2 n3 dn X
118 0 2 1 10-4 5 619 048
Ở đây xin cung cấp thêm một số thông tin về 2 phương pháp định lượng VSV trực
tiếp thường dùng sau phương pháp dùng buồng đếm hình cầu: phương pháp đo độ đục và
MPN
Phương pháp đo độ đục:
o Cơ sở: khi pha lỏng chứa nhiều phần tử không tan sẽ tạo thành hệ huyền phù và có độ đục
bởi các thành phần trong môi trường lỏng cản ánh sang, làm phân tán chùm sáng tới. Tế
bào VSV là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm đục môi trường
o Phương pháp: xác lập quan hệ tỉ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào VSV và độ đục.
o Xây dựng phương trình đường chuẩn
o Định lượng gián tiếp thông qua độ đục OD dựa vảo đường chuẩn.
Phương pháp MPN:
o Là phương pháp pha loãng tới hạn hay còn gọi phương pháp sử dụng chỉ số xác suất cao
nhất.
o Cơ sở: phân tích thống kê số liệu.
Ưu nhanh, gọn, dễ quan sát. tiêu bản giữ được lâu hơn,
điểm quan sát dễ dàng hơn.
Nhược không quan sát được trong Khó làm
điểm thời gian lâu
Số 12 14 8
Nấm men Vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Lactose
Subtilic Bacillus
KíKích thước Rất lớn Rất bé: 0.5-1 µm Rất bé
Dài:10-12µm
Rộng:2-7 µm
Hình dạng Hình cầu Trực khuẩn ngắn, trực khuẩn dài
Oval
Ellipse
Khuẩn ty giả
Do điều kiện kính hiển vi không tốt lắm nên việc quan sát gặp nhiều khó khăn. Nên hình
ảnh của nấm men thì tương đối riêng vi khuẩn thì khó quan sát.
Hình ảnh mẫu quan sát được
Vi khuẩn Lactobacillus được sử dụng trong nhiều sản phẩm probiotic, các chủng
Lactobacillus có đặc tính probiotic ở đường dạ dày – ruột người. Ngoài ra, các chủng
Lactobacillus có đặc tính probiotic ở trên cũng thể hiện một số ích lợi đối vớisức khỏe con
người như: kháng với các vi khuẩn gây bệnh, tạo ra bacteriocin và các chất kháng
khuẩnkhác. Đồng thời, chúng cũng kháng với một số loại kháng sinh. Tùy theo khả năng
kháng kháng sinh của mỗi chủng, chúng có thể được đưa vào cơ thể của các bệnh nhân sử
dụng các loại kháng sinh (như: amikacin, kanamycin, gentamicin, streptomycin,
vancomycin và co-trimoxazole) mà không bị tiêu diệt bởi các loại kháng sinh mà chúng
kháng lại, từ đó tạo nên những hiệu quả có lợi cho bệnh nhân.
Hơn nữa, các chủng Lactobacillus này cũng an toàn đối với người sử dụng khi
nhạy cảm vớ một số loại kháng sinh. Đặc biệt, 11 chủng Lactobacillus (gồm: L. paracasei/
Cụ thể:
Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 23
B. subtilis có khả năng sản sinh nhiều enzyme, nhưng quan trọng nhất là amylase
và protease, 2 loại enzyme thuộc hệ thống men tiêu hóa.
B.subtilis có khả năng sinh tổng hợp một số chất kháng sinh có tác dụng ức chế
sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn Gram(-),
Gram(+) và nấm gây bệnh.
B. subtilis thường tồn tại trong sản phẩm ở trạng thái bào tử, nhờ vậy khi uống vào
dạ dày, nó không bị acid cũng như các men tiêu hóa ở dịch vị phá hủy. Ở ruột, bào tử nẩy
mầm và phát triển thành thể hoạt động giúp cân bằng hệ vi sinh có ích trong đường ruột,
cải thiện hệ thống tiêu hóa, nhất là sau khi sử dụng kháng sinh kéo dài.
- Hình dạng: có hình bầu dục, hình trứng,… (tùy điều kiện môi trường).
- Cấu tạo tế bào: thành tế bào, màng tế bào, tế bào chất, ty thể, riboxom, nhân, không bào và
các hạt dự trữ.
- Những thay đổi của tế bào nấm men trong quá trình phát triển:
o Nấm men trẻ (qua 12-16 giờ nuôi cấy): màng mỏng, tế bào chất đồng nhất, không bào chưa
có hoặc mới bắt đầu xuất hiện, tế bào sinh sản chiếm tỷ lệ cao.
Tính tỷ lệ nảy
chồi
Lưu ý: tế bào được xem là đang nảy chồi là những tế bào có tế bào con bé hơn hoặc bằng
½ tế bào mẹ, nếu tế bào con lớn hơn ½ tế bào mẹ thì phải tính là 2 tế bào.
Bảng 6.Tỷ lệ nảy chồi của nấm men
% tỷ lệ không nảy
Vùng Nảy chồi Tổng nấm % tỷ lệ nảy chồi
chồi
1 5 33 15.2% 84.8%
2 5 37 13.5% 86.5%
3 3 23 21.7% 78.3%
4 17 71 23.5% 76.5%
5 12 82 14.6% 85.4%
Kết luận: tỷ lệ tế bào nảy chồi chiếm trung bình 17% tức là tế bào nấm men đang ở cuối
giai đoạn trường thành (tỷ lệ nảy chồi 10 – 15%) đầu giai đoạn già.
Chuẩn bị mẫu
Tổng số tế % tỷ lệ chết
vùng Tế bào chết Tế bào sống
bào
1 20 107 127 15.7%
2 5 59 64 7.8%
3 10 65 75 13.3%
4 17 117 134 12.7%
5 22 110 132 16.7%
Kết luận: tỷ lệ tế bào chết >> 4%, số tế bào chết quá lớn. Việc này không thích hợp cho
việc chuyển canh trường này để nuôi cấy.
4. Đếm tế bào nấm men trong 1ml canh trường: (dùng buồng đếm Thomas)
o Pha loãng mẫu với độ pha loãng 10-2.
o Tiệt trùng buồng đếm bằng cách ngâm trong cồn 700.
Đậy lá kính lên trên buồng đếm và nhỏ mẫu vào khe hẹp phía trên buồng đếm, dùng
giấy thấm , sau đó tiến hành quan sát bằng kính hiển vi trên 3 trong 5 vùng của buồng đếm.
(lưu ý: khi vi sinh vật nằm ở biên giới thì chỉ đếm trên 2 cạnh liên tiếp).
𝑎. 𝑏. 103
𝑥=
𝑉. 𝑐
Bảng 8. Số VSV trong ba vùng quan sát và tổng số VSV TB trong 1ml mẫu
Hình 20. ứng dụng của nấm men trong sản xuất bánh mì, rượu, bia
Nấm men là tác nhân cơ bản gây nên quá trình lên men rượu, tuy nhiên không phải
loài nào cũng lên men đường thành rượu được mà chỉ có một số loài có khả năng này.
Trong sản xuất hiện nay người ta thường dùng một số loài thuộc họ Saccharomycesaceae.
Theo đặc tính lên men người ta chia nấm men thành hai nhóm: nấm men lên men
nổi và nấm men lên men chìm (Tiêu biểu là loài Saccharomyces ellipsoideus. Nấm men
chìm thường dung trong sản xuất bia, rượu vang, sampan). Nấm men nổi ít được sản xuất
bia vì tạo đục gây mất cảm quan cho sản phẩm.
Phức của VSV Gram (+) Phức của VSV Gram (-)
Loại phức chất có khả năng giữ Loại phức chất không còn giữ được màu của thuốc
nguyên màu của thuốc nhuộm nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu
nên không bị rửa trôi khi xử lý của thuốc nhuộm bổ sung
bằng cồn
d. Nhuộm Gram
Các bước thực hiện:
Nhuộm màu
Nhỏ vài giọt Gantialviolet lên vết bôi (chờ 1p)
Nhuộm màu
Nhỏ fuchshin bazơ để từ 1-2 phút
Rửa, lau khô ( tránh lau chà mạnh trên vết VK)
Ép lá kính lại, quan sát trên KHV
Sau mỗi bước phải rửa nước, rồi dùng giấy thấm khô.
e. Nhuộm
Hình 21. Các bước nhuộm Gram VSV màng
nhày
Cố định mẫu như đã nói
Các bước nhuộm:
Nhuộm màu
Nhỏ vài giọt Crital violet lên vết bôi (chờ 1p)
Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 33
Rửa nước, thấm khô
Rửa nước => thấm khô nước => quan sát trên KHV
Hình ảnh
Hình 22. Hình VSV dưới kính hiển vi: bacillus subtilis, E.coli, Lactic
Hình ảnh
Hình ảnh
Hình 26. Probiotic với vai trò hang rào phòng ngự bảo vệ niêm mạc ruột
Phó-mát Camembert
Đây là một của nhiều phó-mát bề mặt chín. Có nguồn gốc từ Normandy, Pháp lần
đầu tiên nó được làm bởi Marie Harel vào năm 1791. Năm 1890, M. Ridel phát triển hộp
gỗ nổi tiếng tạo điều kiện xuất khẩu với lượng lớn.
Tempeh
Tempeh có nguồn gốc từ Java, Indonesia nhưng cũng được phổ biến ở Hà Lan và
nó đã đạt được thị trường tiêu thụ đáng kể ở Mỹ, châu Âu và Úc. Tempeh là một bánh có
thể thái (cắt) được, thu được bởi phương pháp lên men bề mặt với nấm của những hạt đậu,
ngũ cốc hoặc vật liệu phù hợp khác sau khi đã ngâm rồi nấu. Cơ chất được dùng nhiều và
Sau khi nấu sôi và làm nguội, làm cơ chất cho quá trình lên men. Mốc chức năng
chính yếu là Rhizopus oligosporus và R.oryzae, chúng nảy mầm nhanh ở 37°C và sự phát
triển sợi nấm nhanh của chúng đảm bảo sự chiếm ưu thế và lấn át các dòng tạm nhiễm khác
như Aspergillus spp. trong vòng 30 giờ các đậu rời rạc đã được kết chặt lại nhau tạo thành
khối rắn. R.oligosporus được khảo sát là thâm nhập khoảng 2mm vào sâu bên trong đậu
nấu.
Hoạt động enzim của Rhizopus spp. bao gồm enzim thuỷ phân protein, enzim thuỷ
phân chất béo, enzim thuỷ phân các hơp chất các-bon và phosphatase. Nhờ hoạt động của
các enzim này, một phần các cơ chất mạch dài bị thuỷ phân thúc đẩy cho sự tiêu hoá dễ
dàng.
Qui trình mới cải tiến đã được báo cáo bao gồm tiến trình bán liên tục cho lên men tempeh
với nhiệt độ được điều khiển trong thùng lên men xoay vòng.
Làm giàu thêm đạm cho thực phẩm tinh bột và thức ăn gia súc
Do có khả năng phân cắt vật chất các-bon, nấm là hữu dụng trong việc nâng cao
giá trị dinh dưỡng của các sản phẩm phụ nông-công nghiệp sau chế biến, chẳng hạn như
tinh bột chứa trong chất cặn bã khoai lang (Yang et al., 1993) hoặc bã mía đường cellulose
(Moo-Young et al., 1992). Cho mục đích thêm vào các nguồn đạm rẽ tiền như (NH4)2SO4
và urea có thể biến đổi thành đạm vì thế làm giàu dinh dưỡng thêm cho thức ăn. Sản phẩm
Hình 31. Nấm mốc tân công nông sản, trái cây
Bacillus Subtilis
Cả 2 mẫu hiếu khí và yếm khí đều chuyển màu, từ xanh sang vàng.
Mẫu hô hấp hiếu khí vàng nhiều hơn.
Hình 33. Mẫu hô hấp hiếu khí (bên trái) và yếm khí (bên phải)
Lacto bacillus
Cả 2 mẫu hiếu khí và yếm khí đều chuyển màu, từ xanh sang vàng xanh.
Hình 34. Mẫu Lacto bacillus hô hấp hiếu khí (bên trái) và yếm khí (bên phải)
Phần nào tinh bột thủy phân môi trường sẽ trong suốt. Không thủy phân môi trường sẽ
có màu xanh.
Ứng dụng khả năng dị hoá các loại đường của VSV vào trong sản xuất:
+ Nấm men: ứng dụng hô hấp yếm khí vào quá trình sản xuất thực phẩm như làm cơm
rượu, muối chua,….
Hình ảnh
Hình 39. Acetobacterxylium trong trong môi trường theo thứ tự S-L-M-L.
IV. Mở rộng
Việc tìm hiểu xem loại VSV nào có khả năng lên men loại đường nào và loại nào là tốt
nhất nhằm mục đích chọn được chủng vi sinh vật tối ưu tuỳ theo mục đích sản phẩm. Ví
dụ:
+ Nấm men có khả năng lên men mạnh Glucose, Sacarose. Ứng dụng lên men nguyên liệu
giàu những loại đường này: các dịch quả => tạo rượu.
+ Acetobacterxylium có khả năng lên men hầu hết các loại đường nên phạm vi ứng
dụng rộng.