LÊN MEN TEMPEH

I. GIỚI THIỆU
1. Đậu nành

 Đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L).

 Đậu nành là loại cây thân cỏ một năm, hoa tập trung trên những nách lá, kiểu bào
nang.

 Quả đậu nành là loại quả giáp, mỗi quả có 2 - 3 hạt, hạt đậu hình ô van, khác
nhau về màu sắc, có vỏ bao bọc.

 Đậu nành là loại thực phẩm giàu protein nhưng lại ít calories, ít chất béo bão hòa
và hoàn toàn không có cholesterol.
• Phần lớn thực phẩm từ đậu nành đều thuộc loại tiêu hóa dễ dàng.

 Đậu nành hội đủ thành phần amino acid thiết yếu và hàm lượng cần thiết

 Hàm lượng chất khoáng trong đậu nành rất thấp, tổng cộng chỉ chiếm khoảng 4%
trọng lượng hạt khô.

 Vitamin trong hạt đậu nành có hàm lượng thấp và dễ bị mất đi trong quá trình
chế biến.

 Đôi khi qua tiến trình chế biến, thực phẩm được biến đổi theo chiều hướng tốt
hơn (như đậu hũ, qua tiến trình làm đông đặc với calcium sulphate, thường làm tăng
lượng calcium, hàm lượng sắt).
Bảng 5: Thành phần vitamine trong đậu nành
Thành phần Số lượng mg/kg Thành phần Số lượng mg/kg

Thiamin 11.0 – 17.5 Acid folic 1.9

Riboflavon 3.4 – 3.6 Inositol 2300

 Niacine 21.4 – 23.0 Viatamine A 0.18 – 2.43

Pyridoxin 7.1 – 12.0 Viatamine E 1.4

Biotin 0.8 Vitamine K 1.9

Acid pantothenic 13.0 – 21.5

 Do đậu nành có giá trị dinh dưỡng rất cao nên chúng thường được sử dụng làm
một số loại thực phẩm hằng ngày. Các sản phẩm không lên men từ đậu nành được chế
biến bằng cách biến tính đậu nành bằng sinh học, bằng cơ học, hóa học và bằng nhiệt: sữa
đậu nành, đậu hũ (hay đậu phụ), tàu hũ…Các sản phẩm lên men phổ biến từ đậu nành
bao gồm: chao, tương, miso, tempeh, natto, đạm tương…
2. Tempeh

 Tempeh là sản phẩm lên men đậu nành, dạng đặc màu trắng, nguyên hạt, có mùi
đặc trưng, pH khoảng 6,5 – 6,8.

 Tempeh có nguồn gốc từ Java, Indonesia nhưng cũng được phổ biến ở Hà Lan và
nó đã đạt được thị trường tiêu thụ đáng kể ở Mỹ, châu Âu và Úc. Tempeh là một bánh có
thể thái (cắt) được, thu được bởi phương pháp lên men bề mặt với nấm của những hạt
đậu, ngũ cốc hoặc vật liệu phù hợp khác sau khi đã ngâm rồi nấu. Cơ chất được dùng
nhiều và phổ biến nhất là đậu nành. Tempeh cung cấp một nguồn đạm thực vật rẻ tiền
giàu dinh dưỡng dễ tiêu hoá và an toàn.

 Nó thường được ăn chỉ khi sau khi nấu hoặc rán/chiên trong dầu. Đậu nành được
ngâm và tách vỏ, hoặc tách vỏ khô trước rồi ngâm. Trong quá trình ngâm sự lên men
lactic tự nhiên diễn ra làm hạ thấp pH của đậu, làm cho chúng phù hợp hơn cho sự phát
triển của nấm mốc và chống lại vi khuẩn gây hư hỏng và các mầm bệnh.

 Sau khi nấu sôi và làm nguội, đậu được chủng giống truyền thống “usar”
(Rhizopus spp. hiện diện trên lá cây Hisbiscus, hoặc giống thuần chủng trong bột gạo
hoặc bột khoai mì. Mốc chức năng chính yếu là Rhizopus oligosporus và R.oryzae, chúng
nảy mầm nhanh ở 37°C và sự phát triển sợi nấm nhanh của chúng đảm bảo sự chiếm ưu
thế và lấn át các dòng tạm nhiễm khác như Aspergillus spp. trong vòng 30 giờ các đậu rời
rạc đã được kết chặt lại nhau tạo thành khối rắn. R.oligosporus được khảo sát là thâm
nhập khoảng 2mm vào sâu bên trong đậu nấu.

 Hoạt động enzyme của Rhizopus spp. bao gồm enzim thuỷ phân protein, enzyme
thuỷ phân chất béo, enzyme thuỷ phân các hơp chất carbon và phosphatase. Nhờ hoạt
động của các enzyme này, một phần các cơ chất mạch dài bị thuỷ phân thúc đẩy cho sự
tiêu hoá dễ dàng.

Hình 2: Tempeh từ đậu nành

(http://www.goeatgive.com/fried-tempeh-in-sweet-sauce/, truy cập ngày 14/5/2014)
Tempeh là sản phẩm giàu protein, calories, vitamin (đặc biệt vitamin B12)
Bảng 6: Giá trị dinh dưỡng trong 100gram Tempeh

Chất dinh dưỡng Hàm lượng

Protein 18.54 g

Chất béo 10.80 g

Hydratcacbon 9.39 g

Canxi 111 mg
Phospho 266 mg

Fe 2.70 mg
Pantothenic acid 0.278 mg

Vitamin B1 0.078 mg
 Vitamin B2 0.358 mg
Vitmin B3 2.640 mg

Vitamin B6 0.215 mg

Vitamin B12 0.08g

(Nguồn: USDA Nutrient Database for Standard Reference)

3. Vi sinh vật tham gia

 Tempeh truyền thống là sản phẩm của sự lên men của một nhóm đa dạng các vi
sinh vật:
+ Nấm mốc

+ Nấm men

+ Vi khuẩn sinh acid lactic

+ Một số vi khuẩn gram âm khác.

 Trong đó, Rhizopus oligosporus là loại nấm có ý nghĩa nhất, ngoài ra còn có các
loại nấm mốc khác như R.oryzae, R. arrbizus, Mucor spp cũng góp phần làm tăng hương
vị và dinh dưỡng cho sản phẩm. Trong bài thực tập này, đậu nành được lên men với nấm
mốc Rhizopus oligosporus.

 Nhiều loài nấm mốc được phát hiện trong Tempeh nhưng chỉ Rhizopus là chiếm
đa số nhất. Rhizopus bao gồm 3 nhóm loài là: R. oryzae, R. stolonifer và R. microspores.
Trong đó loài R. oligosporus được sử dụng nhiều nhất trong quá trình lên men. Do chúng
có các đặc tính sinh trưởng mạnh ở nhiệt độ cao (32-42 oC) và không thủy phân sucrose,
thủy phân mạnh protein cao phân tử và lipid, có thể sản xuất ra chất chống oxy hóa mạnh.

 Trong quá trình lên men R. oligosporus còn có khả năng sinh các enzyme phân
giải các cơ chất như là carbohydratases, lipase, proteases và phytases. Các enzyme này
làm phân giải các chất dinh dưỡng trong Tempeh và đặc biệt là enzyme phytases có khả
năng làm giảm lượng axit phyxit, một loại chất có ảnh hưởng đến chất lượng dinh dưỡng
trong sản phẩm.
  R. oligosporus có thể ức chế sự sinh trưởng và sinh độc tố aflatoxin B1 của nấm
Aspergillus flavus và A. parasiticus. Từ R. oligosporus người ta cũng có thể tinh chế ra
một loại protein kháng khuẩn, chống lại sự phát triển của Bacillus spp, Staphylococus
aureus và Streptococus cremoris và E. coli.

 Các vi khuẩn acid lactic đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất
Tempeh. Trong quá trình ngâm đậu chúng làm aixit hóa môi trường do đó ngăn chặn
được sự phát triển của nguồn vi khuẩn gây bệnh. Các loài vi khuẩn acid lactic thường
được sử dụng: Lactococus lactic, pedicoccus pentosaceus, L. reuter, L. plantarum,…

 Nấm men được phát hiện nhiều trong các loại Tempeh là chi Trichosporon. Gồm
các loài như: Trichosporon beigelii, Saccharomyces dairensis chúng thường khôn ảnh
hưởng hoặc ảnh hưởng rất ít. Tuy nhiên nếu số lượng quá cao thì chúng sẽ cạnh tranh
nguồn dinh dưỡng và ức chế sự phát triển của nấm mốc.

 Bên cạnh đó cũng tồn tại các loại vi sinh vật gây hại cạnh tranh với nấm R.
oligosporus và sinh ra độc tố vi khuẩn hay độc tố nấm. Tuy nhiên chúng bị ức chế trong
môi trường có pH thấp.

 Một số vi sinh vật có lợi có thể tổng hợp nhiều loại vitamine như: niacin (B3),
riboflavin (B2), pyridoxine (B6), pantothenic acid và thiamine. Trong Tempeh còn có các
loài vi sinh vật có khả năng cải thiện chất lượng sản phầm thông qua việc tổng hợp các
vitamine B12 như: Klebsiella pneumoniae, Klebsiella pneumoniae spp, Citrobacter
freundii,…Ngoài ra vi khuẩn acid latic cũng có khả năng tổng hợp một số vitamine nhớm
B.
 Hình 3: Nấm mốc Rhizopus oligosporus
(http://fineartamerica.com/featured/fruiting-bodies-of-rhizopus-oligosporus-power-and-
syred.html, truy cập ngày 14/5/2014)
II. MỤC ĐÍCH

 Làm quen và thực tâp quy trình chuẩn bị đậu lên men bằng phương pháp lên men
bề mặt.

 Quan sát sự phát triển của khuẩn ty cũng như quá trình lên men bề mặt

 Làm quen với các thao tác trong quá trình phân tích hóa học sản phẩm

III. PHƯƠNG TIỆN

1. Nguyên liệu

 Đậu nành (500gram/nhóm + 4 túi đậu nành 50g/túi).

 Mốc giống Rhizopus oligosporus

2. Dụng cụ, thiết bị

 Bình tam giác 250ml.

 Ống đong 100ml.

 Cốc thủy tinh.

 Đĩa petri.

 Máy đo pH.

 Máy xay.

 Nhiệt kế.

 Burette (bán tự động).

 Tủ ủ, cân, thùng chứa chất thải.

 3. Hóa chất
 Nước cất.
 Dung dịch formaldehyde 37%.
 NaOH 0.1M chuẩn.
IV. PHƯƠNG PHÁP
1. Quy trình thực hiện
Tempeh được sản xuất khá dễ dàng và đơn giản. Dưới đây là qui trình sản xuất
tempeh từ đậu nành:

Đậu nành (500g), chia làm 4 túi

Đem túi 1 cân
(50g/túi)
3 lít nước+ 100ml nước chua
Ngâm qua đêm

Cân túi 2, Đo pH
phân tích ẩm (PTA)
Rửa sạch, tách vỏ

Lấy 2 túi đậu 3, 4. Đem cân túi

Nấu 20 phút
3, 4; túi 3 PTA, túi 4 chủng 1ml
dịch trích bòa tử nấm mốc,
Để nguội (khoảng 40-450C) trữ lạnh để phân tích formol

10ml dịch trích bào Chủng nấm mốc R.oligosporus LU575

tử

Trộn đều

Ép khuôn

Ủ (24-36 giờ)

Thu hoạch

Đánh giá cảm quan Phân tích hóa học đậu nấu và
Tempeh

Phân tích vật chất khô hòa tan của Chuẩn độ formol pH
đậu khô, nấu và Tempeh
 2. Giải thích quy trình

 Qua các bước tiền xử lí (ngâm và nấu), đậu nành mất nhiều các chất phân tử
lượng thấp hòa tan như đường đơn và các acid amin. Trong quá trình lên men, các chất đa
phân tử (polysaccharides và protein) bị phân cắt bởi enzyme. Các biến đổi này có thể
được xác định bởi xử dụng các thử nghiệm hóa (chất khô hòa tan, chuẩn độ formol).
Trong suốt quá trình chế biến cho đến thành phẩm, nguyên liệu sẽ mất dần chất khô qua
từng công đoạn. Hiệu quả của toàn bộ tiến trình có thể được xác định bằng việc xác định
chất khô qua từng bước.

 Nước chua: nước đậu ngâm qua đêm có tác dụng để điều chỉnh pH protein đậu,
tăng mật số vi khuẩn lactic.

 Ngâm nước qua đêm: hạt đậu nành mềm và nở ra để xảy ra qúa trình lên men
lactic bởi vi khuẩn lactic có trong đậu nành (làm pH trở nên acid để vi khuẩn gây bệnh
và mầm bệnh không phát triển được).

 Nấu 20 phút: làm chín đậu, loại bỏ lectin, chất gây ức chế trypsin và phóng thích
ra các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của nấm.

 Đục lổ khuôn: để cung cấp oxy cho sự phát triển của nấm mốc và để loại bỏ
nhiệt, ngăn chặn nhiệt độ vượt quá nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của nấm mốc.

 Ép khuôn: định hình sản phẩm tempeh, tăng diện tích tiếp xúc giữa đậu nành và
nấm mốc. Tuy nhiên sự nén quá chặt sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của khuẩn ty nấm
đều khắp bề mặt hạt đậu và sự bốc hơi của ẩm độ.

 Ủ 24-36 giờ: tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển mạnh, sinh tổng hợp nhiều
chất, cũng như tạo hệ sợi nấm phát triển ra khắp hạt và đan xen các hạt lại thành khối rắn
chắc.
3. Phương pháp phân tích hóa học
Xác định vật chất khô
  Tiến hành phân tích ẩm bằng cách xay các mẫu (4 mẫu từ 4 túi và mẫu Tempeh
đã chủng 1ml dịch trích bào tử nấm R. oligosporus), cân 5g vào đĩa petri (đã sấy khô và
cân trước đó; độ chính xác 0.01g), sấy 1050C đến khi trọng lượng khô không đổi.
( M 1−M 2 )
x 100
X = m

=> % chất khô = 100 - %Hàm lượng ẩm

Trong đó: X: Hàm lượng nước trong mẫu (%)
M1: khối lượng đĩa và mẫu trước khi sấy (g)
M2: khối lượng đĩa và mẫu sau khi sấy (g)
m: khối lượng mẫu ban đầu (g)
Đo pH

 Tiến hành xay 20 đến 25g đậu nấu (hoặc Tempeh) dùng cho xác định pH và phân
tích formol.

 Cân 10g đậu nấu hoặc Tempeh đã xay mịn, thêm 90g nước cất và khuấy đều, thu
dịch trích. Sau đó đem xác định pH.
Phân tích formol

 Lượng các nhóm acid amin tự do được xác định dựa trên nguyên tắc sau:
RNH3 + CH2O  RN(CH2O)2 + CH2O + H+
( H+ được chuẩn độ với OH- ở pH 8.5)
 Chuẩn độ:

 Cân 5g đậu xay (đậu nấu hoặc Tempeh) + 45g nước

 Khuấy đều và chỉnh pH đến 7 (ổn định trong 30s), sử dụng NaOH 0.1M.

 Thêm vào 5ml dung dịch formaldehyde 37% (pH 7)

 Đợi khoảng 2 phút.

 Chuẩn độ với NaOH 0.1M cho đến khi pH đạt 9.2-9.3 (ổn định trong 30s).

 Ghi nhận thể tích (ml) của NaOH đã sử dụng.

  Lưu ý: Lấy đủ mẫu để dung lượng NaOH chuẩn độ phải lớn hơn 1ml thì kết
quả mới có độ chính xác cao. Khi mẫu đậu nành sử dụng, vào khoảng 0.1g chất khô thì
dung lượng tối ưu được chuẩn độ.
 Nitơ formol được xác định bằng công thức:
( V −V 0 ) x 0 . 0014
x 100
Nitơ formol = m (g/l)
Trong đó:
- V : số ml NaOH 0.1N dung chuẩn độ mẫu (ml)

- V0 : số ml NaOH 0.1N dung chuẩn độ mẫu thử không (ml)

- 0.0014: số gram nitơ tương ứng với 1ml NaOH 0.1N

- m: số ml mẫu phân tích (ml)

- 1000: hệ số qui đổi tự ml sang lít

 Đánh giá cảm quan

 Đánh giá cảm quan dựa trên các giá trị đại diện chất lượng: xuất sắc, tốt, kém,
của Tempeh (tương ứng 10, 6,2) được đề ra. Mỗi tiêu chuẩn cho điểm giá trị giữa 2 và
10, trung bình các tiêu chuẩn cố điểm 7 là trung bình của chất lượng.
Bảng 7: Tiêu chuẩn đánh giá cảm quan Tempeh

Tiêu chuẩn Xuất sắc Tốt Kém

Điểm 10 6 2

Nhẵn, vàng kem, có Biến động nhỏ về Không đồng nhất

Diện mạo/hình
thể hơi nhìn thấy màu sắc hoặc sự
dáng bên ngoài
hạt đậu đều đặn

Không có Ít (có xuất hiện rìa Xám hoặc đen sậm

Sự tạo bào tử
đen) màu

Độ rắn chắc Rắn chắc Hơi mềm Quá mềm

 Phát triển đều khắp Ở trung tâm ít thâm Phát triển kém,
Sự thâm nhập của
và thâm nhập vào nhập hơn không khuẩn ty ở
khuẩn ty nấm
trung tâm trung tâm

Dễ chịu, ưa thích Có thể chấp nhận Mùi khó chịu (thối,

(trung hòa, thơm, được (chin, giống khai, chua,…)
Mùi
dịu) nấm men, khai-
chua, ngọt)

6.2 – 6.7 6.0 – 6.2 hoặc 6.7 – <6.0 hoặc >7.0

pH
7.0

Trắng (tươi mắt), Vàng nhạt Vàng đến nâu

Màu
vàng nhạt
 V. KẾT QUẢ, THẢO LUẬN
1. Xác định vật chất khô
Bảng 8: Khối lượng và vật chất khô của các mẫu đậu
Mẫu Đậu khô Đậu ngâm Đậu nấu Tempeh

Khối lượng (g) 50 109.1 86.55 83.42

Ẩm 12.3 60.46 60.56 59.36

Vật chất khô (g) 43.817 43.14 34.135 33.901

120

100

80

Khối lượng (g) 60

40

20

0
Đậu khô Đậu ngâm Đậu nấu Tempeh
Mẫu đậu

Hình 4: Biểu đồ biễu diễn sự thay đổi khối lượng của các loại đậu
Nhận xét:

 Đậu khô sau khi ngâm: trọng lượng mẫu tăng lên. Đậu sau khi ngâm nước sẽ hút
nước nên trọng lượng đậu tăng.
 Đậu ngâm sau khi nấu: trọng lượng giảm. Vì đậu ngâm sau đó được loại bỏ vỏ và
trong quá trình nấu đậu một phần vật chất trong đậu được hòa tan nên trọng lượng đậu
giảm xuống
 Tempeh: trọng lượng giảm nhẹ. Ngoài các lí do giảm khối lượng như của đậu
nấu , sự giảm khối lượng của Tempeh còn do lượng nước trong đậu bốc hơi 1 phần và
nấm mốc sử dụng cơ chất đậu để phát triển để xảy ra quá trình hô hấp.
 45
40
35
30
25
Vật chất khô (g)
20
15
10
5
0
Đậu khô Đậu ngâm Đậu nấu Tempeh
Mẫu đậu

Hình 5: Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi vật chất khô

Nhận xét

 Vật chất khô giảm mạnh từ đậu khô (43.817g) đến đậu ngâm (33.901g). Vì khi
ngâm nước sẽ thấm vào đậu làm cho khối lượng tổng số tăng => khi tính phần trăm vật
chất khô sẽ giảm. Từ đậu ngâm đến đậu nấu lượng vật chất giảm mạnh có thể là do đậu
được loại bỏ vỏ và một phần vật chất trong đậu được hòa tam hoặc do lượng nước bốc
hơi bớt. Khi đậu nấu được lên men thành Tempeh thì chỉ số này lại giảm nhẹ, do 1 phần
đã được nấm mốc sử dụng để chuyển hóa thành năng lượng sử dụng trong quá trình lên
men phân cắt Protein có trong đậu.
2. pH và Hàm lượng đạm formol
Bảng 9: Sự thay đổi pH của Tempeh

Tempeh 1 Tempeh 2 Tempeh 3 Mẫu trữ

pH Tempe 6.48 7.18 7.16 6.92

Bảng 10: Hàm lượng Nito formol

Mẫu Đậu chủng Tempeh 1 Tempeh 2 Tempeh 3

Nitơ acid amin (g/kg) 0.252 1.876 3.584 1.484

 Nhận xét:

 pH của Tempeh có giá trị cao hơn so với các mẫu trữ là do quá trình lên men R.
oligosporus sinh các enzyme phân giải các cơ chất như là carbohydratases, lipase,
proteases và phytases. Các enzyme này làm phân giải các chất dinh dưỡng trong Tempeh
và đặc biệt là enzyme phytases có khả năng làm giảm lượng axit phyxit nên pH tăng so
với mẫu trữ. Riêng Tempeh 1 pH thấp hơn mẫu trữ có thể là do vị nhiễm vi sinh vật lạ.
Nếu sản phẩm lên men tốt và không bị nhiễm thì sẽ tạo ra các acid amin, tùy vào thành
phần acid amin có mặt trong sản phẩm mà pH có sự thay đổi khác nhau.
 Hàm lượng nitơ formol của Tempeh thành phẩm cao hơn rất nhiều so với đậu
trước chủng. Hàm lượng này cao nhất ở nhóm 2 (3.584g/kg) và thấp nhất ở nhóm 3
(1.484 g/kg). Nguyên nhân của sự khác biệt này có thể do thao tác trong quá trình thực
hiện việc chủng chưa đồng đều hoặc trong quá trình định hình sản phẩm Tempeh, sự nén
quá chặt sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của khuẩn ty nấm đều khắp bề mặt hạt đậu và sự
bốc hơi của ẩm độ nên hiệu suất lên men có sự khác biệt.
3. Sự thay đổi nhiệt độ
Bảng 11: Sự thay đổi nhiệt độ Tempeh của các nhóm

Giờ I II III

13h 38.5 40.0 37.9

15h50 31.3 31.5 31.1

Nhiệt độ (oC)
8h20 43 44.8 39.8

9h50 45.5 46 41.1

Nhận xét:

 Nhìn chung nhiệt độ trong 3 mẫu Tempeh sau gần 21 giờ lên men đều tăng do
hoạt động của vi sinh vật. Trong đó, nhiệt độ mẫu ở nhóm 2 là cao nhất (46 oC) và nhiệt
độ mẫu ở nhóm 3 là thấp nhất (41.1 oC). Điều này chứng tỏ hoạt động của nấm mốc
Rhizopus oligosporus và các vi sinh vật khác (vi khuẩn lactic, nấm men,…) ở mẫu 2 là
mạnh nhất do đó chỉ sô nitơ acid amin là cao nhất và nhóm 3 có chỉ số acid amin thấp
nhất.

4. Đánh giá cảm quan

Bảng 12: Kết quả đánh giá cảm quan tempeh thành phẩm
Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3

Diện mạo 8 10 9

Sự tạo bào tử 10 9 10

Độ rắn chắc 9 7 8

Sự thâm nhập 10 9 6
của khuẩn ty

Mùi 9 8 7

pH 10 5 7

Màu 9 8 7

Trung bình 9.28 8.3 7.74

chất lượng

 Thành phẩm Tempeh của cả 3 nhóm đều cho chất lượng tốt (trung bình chất
lượng đều trên 7) và Tempeh không bị nhiễm. Trong đó, chất lượng sản phẩm của nhóm
1 tốt hơn hai nhóm còn lại.

Hình 6: Tempeh từ đậu nành

VI. KẾT LUẬN

 Chất lượng của Tempeh phụ thuộc vào nhiều yếu tố: chất lượng đậu, chất lượng
của chủng mốc giống, thao tác và các khâu khử trùng trong quá trình thực hiện.

 Tuy một số chỉ tiêu về cảm quan chưa thực sự tốt nhưng bước đầu sinh viên được
làm quen với quy trình lên men theo phương pháp lên men bề mặt. Từ đó có thể áp dụng
với các sản phẩm lên men truyền thống khác.