TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

------

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM

KỸ THUẬT GEN
NHÓM 1
Lê Thị Châm: 20174471
Đặng Ngọc Mai: 20174924
Mai Thị Miên: 20174939
Đỗ Thị Na: 20174959
Đinh Thị Nhung: 20175047
Giảng viên: PGS.TS. Khuất Hữu
Thanh

Hà Nội, tháng 06/2020

BÀI 1: TÁCH DNA TỔNG SỐ TỪ CANH TRƯỜNG VI KHUẨN
I. Mục đích thí nghiệm
Tách chiết DNA tổng số từ canh trường đại diện vi khuẩn Gram âm và Gram
dương lần lượt là E.coli và Bacillus subtilis.
Yêu cầu: tách chiết và thu nhận được DNA nguyên vẹn, tinh sạch, không chứa tạp
chất từ mẫu phẩm và các hóa chất, dụng cụ dùng trong quá trình tách chiết. DNA tổng số
phải có nồng độ đủ lớn.
II. Tiến hành thí nghiệm
2.1. Chuẩn bi vật liệu
+ Canh trường vi khuẩn E.coli và Bacillus subtilis nuôi qua đêm trên môi trường giàu
dinh dưỡng
+ Dung dịch phân giải tế bào ( lysis buffer): SDS (0.5%) và Proteinase K ( 0.1 mg/mL)
trong dung dịch đệm TE (pH=8)
+ Dung dịch Choloroform: isoamyl alcohol (24:1)
+ Ethanol
+ Ống eppendorf 1.5 ml sạch ( DNAse free)
+ Đầu tip sạch 1000, 200 µl sạch ( DNAse free)
+ Ống falcon 15 ml sạch, mới

Bảng 1. Bảng thành phần để pha dung dịch phân giải tế bào
Thành phần Nồng độ cuối Thể tích hút
SDS (10%) 0.5% 200 µl
Proteinase K (20 mg/ml) 0.1 mg/ml 20 µl
Dung dịch đệm TE (pH= 8) 3.78 ml
Tổng thể tích 4 ml

Khi pha dung dịch phân giải tế bào thì dùng pipet thích hợp lấy dung dịch có thể tích lớn
nhất trước sau đó lần lượt lấy dung dịch có thể tích nhỏ hơn.
2.2 Quy trình thí nghiệm
Quy trình 1: Tách DNA tổng số của vi khuẩn bằng phương pháp tiêu chuẩn
Thực hiện tách DNA tổng số của vi khuẩn bằng phương pháp tiêu chuẩn đối với vi khuẩn
Bacillus subtilis.
  Khi tiến hành thí nghiệm cần chú ý những điều sau:
Trong bài thí nghiệm này sử dụng máy li tâm lạnh, đọc hướng dẫn sử dụng để
dùng máy li tâm. Chú ý khi đặt ống cần ly tâm trong máy ly tâm phải đặt đối trọng nhau,
nếu ống chứa mẫu không đủ để đối trọng thì đặt thêm 1 ống chứa nước sao cho các ống
đối trọng nhau
Bài thí nghiệm đối tượng tách chiết là DNA nên mọi thao tác phải cẩn thận như:
hút pipet phải chuẩn về thể tích, mở nắp ống eppendorf tránh động vào mép ống vì có thể
làm dây enzym từ tay người thao tác làm phân hủy DNA
Tất cả dịch nổi bỏ đi trong quá trình thí nghiệm phải đổ vào cốc đựng rác chứa
cloroforn
Sử dụng nước khử ion với mục đích hòa tan DNA.
 Các bước tiến hành thí nghiệm
Bước 1: Dùng pipet hút 1.5 ml canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi qua
đêm trên môi trường giàu dinh dưỡng vào ống eppendorf 1.5 ml và đem đi li tâm ở 10000
vòng/ phút trong thời gian 10 phút, ở 4 oC . Sau khi li tâm xong loại bỏ dịch canh trường
trong ống eppendorf, thu sinh khối ( sinh khối đóng cặn ở đáy ống Eppendorf, lượng sinh
khối thu được rất ít).
Bước 2: Bổ sung 600µl dung dịch phân giải tế bào vào ống eppendorf chứa sinh
khối, dùng pipet hút lên hút xuống đảo trộn hỗn hợp sau đó đem đi votex ở tốc độ cao để
hòa tủa tế bào. Ủ hỗn hợp ở 37oC trong 1h.
Bước 3: Sau khi ủ xong, bổ sung 600µl hỗn hợp chloroform: isoamyl alcohol
(24:1), votex mạnh hỗn hợp trong khoảng 15 giây.
Bước 4: Ly tâm hỗn hợp ở 10000 vòng/ phút trong 10 phút để tách pha. Ly tâm
xong hỗn hợp tách làm hai pha ( hai lớp)
+ lớp dưới chứa protein và các thành phần tế bào, trên lớp này có lớp màng
mỏng dạng tủa ( chứa xác tế bào)
+ lớp trên là dịch trong chứa DNA
Dùng pipet 200 µl hút 200 µl hút pha trên chứa DNA ( hút từ từ để không bị hút phải
dịch ở pha dưới) chuyển sang ống eppendorf mới chứa sẵn 500µl hỗn hợp Choloroform:
isoamyl alcohol (24:1).
Bước 5: Votex mạnh hỗn hợp trong ống eppendorf mới trong khoảng 15 giây
 Bước 6: Đem li tâm tách pha ở 10000 vòng/ phút trong 10 phút, dùng pipet 200 µl
hút pha trên chứa DNA, hút 150 µl (do pha trên ít) rồi chuyển sang ống eppendorf sạch
mới.
Bước 7: Hút 375 µl ethanol 100% và ống eppendorf chứa 150 µl dịch DNA. Đảo
trộn hỗn hợp và ủ ở -20oC trong 15 phút. ( Chú ý: hút 2.5 thể tích ethanol 100% vào 1 thể
tích dịch chứa DNA. Ví dụ thể tích dịch chứa DNA là 300 µl thì lượng ethanol 100% cần
dung là 750 µl)
Bước 8: Ly tâm ở 12000 vòng/ phút ở 4 oC trong khoảng 15 phút. Bỏ dịch nổi đi
và thu được tủa DNA
Bước 9: Dùng pipet bổ sung thêm 500 µl etanol 70% phủ lên lớp tủa DNA với tác
dụng làm sạch, ly tâm ở 12000 vòng/ phút ở 4 oC trong 5 phút. Bỏ dịch nổi bên trên và để
nắp ống mở trên máy ổn nhiệt ở 37 oC để bay hơi hết lượng ethanol còn lại.
Bước 10: Lấy 60 µl nước khử ion cho vào ống đựng DNA để hòa tan tủa, vô trùng
trên máy ổn nhiệt ở 70 oC trong 10 phút để loại bỏ DNAse. Cất mẫu DNA trong tủ -20 oC
để tiến hành thí nghiệm PCR nhân gen.
Quy trình 2: Tách DNA tổng số bằng phương pháp đun sôi
Bước 1: Dùng pipet hút 1.5 ml canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi qua
đêm trên môi trường giàu dinh dưỡng vào ống eppendorf 1.5 ml và đem đi li tâm ở 10000
vòng/ phút trong thời gian 10 phút, ở 4 oC . Sau khi li tâm xong loại bỏ dịch canh trường
trong ống eppendorf, thu sinh khối ( sinh khối đóng cặn ở đáy ống Eppendorf lượng sinh
khối thu được rất ít)
Bước 2: Bổ sung 200 µl nước khử ion vào ống eppendorf chứa sinh khối, lắc đều
và đun sôi hỗn hợp trong 15 phút. ( khi hòa với nước khử ion tránh búng, trộn mạnh tay
sẽ tạo ra bọt, nên sử dụng đầu côn pipet hút lên hút xuống nhẹ nhàng vài lần để trộn đều).
Bước 3: Sau khi đun sôi, nhanh chóng đưa ống eppendorf sang bình đá, để trong
bình đá 30 phút sau đó đem ống eppendorf đi ly tâm ở 12000 vòng/ phút ở 4 oC trong 15
phút.
Bước 3: Sau khi ly tâm, hỗn hợp phân tách làm hai pha: pha trên và pha dưới.
Dùng pipet hút dịch nổi pha trên chứa DNA, hút 100 µl chuyển sang ống eppendorf sạch,
ủ trên máy ổn nhiệt ở 70 oC trong 10 phút, sau đó giữ ở -20 oC cho đến khi làm thí
nghiệm PCR nhân gen.
 Kiểm tra chất lượng của DNA tổng số
 Sau khi tách được DNA bằng hai quy trình 1 và quy trình 2 như trên ta thực hiện
kiểm tra độ tinh sạch của DNA vừa tách được bằng phương pháp đo quang- dựa vào độ
hấp thụ mạnh ánh sang tử ngoại, độ hấp thụ này tỉ lệ với nồng độ DNA.
Sử dụng máy đo quang phổ kế trong phòng thí nghiệm. Đọc kĩ hướng dẫn sử dụng
máy đo quang trước khi thao tác.
Đo mẫu ở 2 bước sóng là 260nm và 280 nm vì ở bước sóng 280nm là mức hấp thu
cực đại của protein, nhưng các protein cũng hấp thu ánh sang ở bước sóng 260nm như
các nucleotit acid, do đó làm sai lệch kết quả thật của nồng độ acid nucleic.
Tỉ lệ A260/A280 nằm trong khoảng từ 1.8 đến 2.2 là đạt yêu cầu.
+ OD260nm/OD280nm= 1.8-2.2 thì dịch chiết DNA là tinh sạch
+ OD260nm/OD280nm >2 thì dịch chiết DNA bị biến tính hoặc phân hủy
+ OD260nm/OD280nm <1.8 thì dịch chiết DNA có lẫn tạp chất
Chú ý trong thao tác: + chỉ sử dụng một cuvet để chứa dung dịch vì nếu dùng hai cuvet
thì dẫn đến sai số do thông số cuvet là có thể không giống nhau, hạn chế tối đa sai số do
thiết bị và thao tác.
+ Sauk hi đo mẫu xong muốn đo ở bước sóng khác thì phải blank lại
từ đầu và rửa cuvet bằng nước cất nhiều lần. Hoặc khi chuyển đổi đo từ mẫu này sang
mẫu của nhóm khác cũng phải rửa cuvet cẩn thận bằng nước cất.
Tiến hành đo OD:
Bật máy đo quang cho ổn định
Pha loãng dịch chiết DNA với 1200 µl bằng nước khử ion
Chuẩn bị mẫu blank, dùng pipet hút 1200 µl nước cất cho vào cuvet thạch anh,
dùng giấy mềm thấm quanh cuvet ( cầm vào phần có rãnh trên cuvet, tránh chạm tay vào
bề mặt nhẵn- vị trí mà ánh sang đi qua cuvet)
Sau khi blank về 0 xong, ta đo mẫu với 1200 µl. Đo lần lượt 260nm và 280 nm
III. KẾT QUẢ
Nhóm 1 chúng em đo OD của dịch chiết DNA tách bằng phương pháp đun sôi được kết
quả đo OD như sau:
+ ở bươc sóng 260nm: OD= 0.396
+ ở bước sóng 280nm: OD= 0.237
 OD260nm/OD280nm = 0.396/ 0.237 = 1.67 < 1.8 nên dịch chiết DNA chưa sạch, có
lẫn tạp chất.
Bài 2 : PCR phân đoạn gen mã hóa 16S rRNA của Vi khuẩn
I.Mục đích thí nghiệm
Dùng kỹ thuật PCR để nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA của vi khuẩn
II.Quy trình thí nghiệm
2.1.Vật liệu
GoTaq MasterMix : có sắn Taq DNA polymerase, dNTP, MgCl2 trong dung dịch
đệm thích hợp cho phản ứng PCR tiêu chuẩn.
Mồi xuôi 27F : AGRGTTYGATYMTGGCTCAG*
Mồi ngược 1492R : TACGGYTACCTTGTTACGACTT*
Ống effendorf 1,5mL
Ống PCR 0,5mL
Các đầu tip sạch 200, 10-20𝜇𝐿 sạch, DNAse Free
Mồi suy biến được sử dụng trong thí nghiệm này là hỗn hợp các đoạn nucleotide . Theo
quy tắc IUPAC : R , Y, M là ký hiệu cho các nucleotide sau
R : A hoặc G
Y : C hoặc T
M : A hoặc C
2.2 Tiến hành thí nghiệm
Bước 1 : Ghi ký hiệu mẫu trên mỗi ống PCR sạch
Ống PCR đánh số 1: Ống chứa DNA tách chiết từ bài thí nghiệm số 1 bằng
phương pháp sốc nhiệt ( ghi ký hiệu nhóm ( ví dụ 1.1 ) để không bị lẫn mẫu trong quá
trình thao tác )
Ống PCR đánh số 2: Ống chứa mẫu đối chứng dương ( mẫu DNA của một số
chủng vi sinh vật đã được xác định là có phản ứng PCR)
Ống PCR đánh số 3: Ống chứa mẫu đối chứng âm ( mẫu nước khử ion vô trùng
thay cho DNA )
Bước 2: Tính toán thể tích các thành phần phản ứng PCR cần sử dụng theo bảng.
 Bảng 2.Bảng thành phần phản ứng PCR
Thành phần Nồng độ trong 1 phản Thể tích Thể tích
ứng ( 1 phản ứng ) ( n phản ứng )
PCR Mastermix ( 2X) 1X 12.5 𝜇𝐿 37.5 𝜇𝐿

27F (10 𝜇𝑀) 0.5 𝜇𝑀 1.25 𝜇𝐿 3.75 𝜇𝐿

1492R (10 𝜇𝑀) 0.5 𝜇𝑀 1.25 𝜇𝐿 3.75 𝜇𝐿

DNA tổng số 1 ng – 1 𝜇𝑔 2 𝜇𝐿 6 𝜇𝐿( mỗi ống PCR có

thành phần khác nhau )
Nước khử ion 8 𝜇𝐿 24 𝜇𝐿

Tổng thể tích 25 𝜇𝐿 75 𝜇𝐿

Ở đây n =3 (có 3 ống mang đi PCR )

Bước 3: Phối trộn các thành phần phản ứng PCR (ngoại trừ DNA )
Sau khi đã đánh dấu 3 ống PCR
Tại ống PCR thứ 3 : cho vào ống nước khử ion , PCR Mastermix , mồi xuôi 27F,
mồi ngược 1492R, theo thứ tự từ thể tích cao đến thể tích thấp nhất.
Hút 24 𝜇𝐿 nước khử ion bằng micropipet thể tích 100 𝜇𝐿 (mục đích hút nước khử
ion trước là để không bị nhiễm các thành phần khác)
Hút 37,5 𝜇𝐿 PCR Mastermix bằng micropipet thể tích 100 𝜇𝐿 (vì micropipet
100 𝜇𝐿 không có thể tích lẻ, nên hút 38 𝜇𝐿 PCR Mastermix) cho vào ống PCR thứ 3.
Trước khi hút từ ống mẫu PCR Mastermix cần đảo trộn lên xuống nhẹ nhàng bằng
micropipet để lấy được lượng mẫu đồng đều.
Sau khi cho vào dùng micropipet đảo trộn nhẹ nhàng ( tránh tạo bọt).
Tiếp theo, hút 3,75 𝜇𝐿 mồi 27F bằng micropipet 10 𝜇𝐿 ( tương tự như trên hút 3,8
𝜇𝐿 ) cho vào ống PCR thứ 3, đảo trộn nhẹ nhàng.
Hút 3,75 𝜇𝐿 mồi 1492R bằng micropipet 10 𝜇𝐿 ( cũng hút 3,8 𝜇𝐿 ) cho vào ống
PCR thứ 3, đảo trộn nhẹ nhàng.
 Sau khi hút lần lượt các thể tích như trên, dùng micropipet đảo trộn đều lên.
 Bước 4: Vortex nhẹ (dùng tay lắc nhẹ) để các thành phần phản ứng được hòa trộn
đồng đều, sau đó có thể ly tâm nhẹ để các chất tập trung ở đáy ống effendorf.
Bước 5: Tổng thể tích các chất trong ống PCR thứ 3 là 69 𝜇𝐿. Dùng micropipet chia
ra 2 ống PCR 1 và 2 , mỗi ống PCR 23 𝜇𝐿 dung dịch thành phần phản ứng đã được đảo
trộn ở trên.
Bước 6: Tại ống PCR thứ 1: bổ sung vào 2 𝜇𝐿 DNA đã tách chiết được ở bài thí
nghiệm thứ 2 ( ở đây, nhóm em sử dụng mẫu DNA tách chiết được từ vi khuẩn Bacilus
bằng phương pháp sốc nhiệt )
Tại ống PCR thứ 2: bổ sung 2 𝜇𝐿 DNA đối chứng dương (đã được PTN chuẩn
bị)
Tại ống PCR thứ 3: bổ sung 2 𝜇𝐿 nước khử ion (mẫu đối chứng âm)
Bước 7: Vortex nhẹ hỗn hợp trong ống PCR ( có thể không vortex mà dùng
micropipet đảo trộn nhẹ nhàng), ly tâm nhanh để các thành phần rơi xuống đáy ống. Nếu
chưa mang đi PCR ngay thì phải đặt trong bình đá để giữ các thành phần không bị biến
đổi.
Bước 8: Đặt các ống PCR lên máy PCR đã cài đặt sẵn chu trình nhiệt như sau:
Bước 8.1: 94 0C trong 5 phút
Bước 8.2 : 94 0C trong 30 giây
Bước 8.3: 550 C trong 40 giây
Bước 8.4: 720 C trong 1 phút 30 giây. Lặp lại từ bước 2 đến bước 4 trong 35 lần
Bước 8.5 : 720 C trong 5 phút.
Chú ý nhiệt độ ổn định ở phần đặt các ống PCR chọn t = 1050 C ( nhiệt độ luôn phải duy
trì cao hơn nhiệt độ chạy PCR để các mẫu PCR không bị bay hơi trong quá trình chạy
máy PCR )
Sau khi lập trình chương trình chạy PCR xong => bấm Start => bấm files => Chọn
chương trình mình vừa lập ( chương trình ký hiệu N1905 – ngày 19/05/2020 ) => Bấm
Enter để xác nhận thao tác.
Sau khi bắt đầu khởi động quá trình chạy PCR mới cho mẫu vào, tốc độ cho mẫu sao cho
sau khi cho mẫu vào trong thiết bị thì nhiệt độ hiển thị trên lid ( nhiệt độ biến tính) là
1050C ( thông thường nhiệt độ cứ tăng được 10C thì cho vào một mẫu, phân bố mẫu cho
đều, và đậy nắp ống PCR cẩn thận trước khi cho vào máy PCR ).
Sau khi cho đủ mẫu vào, đậy nắp buồng phản ứng đúng vị trí loại ống Effendorf.
 Đợi máy chạy PCR xong, lấy các mẫu PCR ra và chuẩn bị cho thí nghiệm tiếp
theo.
Bảo quản các mẫu PCR trong tủ lạnh.
III.Kết quả thí nghiệm
Trong bài thí nghiệm này, kết quả thí nghiệm cho thấy quá trình PCR thành công,
nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA của vi khuẩn Bacillus Subtilis thành công, đủ điều kiện
thực hiện thí nghiệm điện di và biến nạp vào plasmid vào tế bào khả biến ( bài thí nghiệm
số 3 ).
BÀI 3: ĐIỆN DI KIỂM TRA SẢM PHẨM PCR TRÊN GEL AGAROSE
NỘI DUNG 1: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose
I. Mục đích bài thí nghiệm.
Củng cố kiến thức, thành thục thao tác về kỹ thuật điện di.
Kiểm tra, đánh giá kết quả sản phẩm PCR.
II. Quy trình thí nghiệm
2.1 Vật liệu
Dụng cụ dùng để điện di (bao gồm khay đổ gel, lược)
Chai 250ml, bình chia độ, pipet, agarose, nước cất, ethidium bromide
Đệm điện di: 1X TAE gồm các thành phần: Tris-base (40 mM), Acetic acid
(20 mM), EDTA (1 mM), pH 8.5
2.2. Quy trình
 Chuẩn bị bể đổ gel
1. Đóng kín hai đầu của bể điện di bằng chốt cao su hoặc dùng băng dính, chú
ý kiểm tra kỹ để đảm bảo khi đổ gel không bị rò.
2. Đặt lược (có rãnh chia phù hợp) vào trong bể đổ gel sao cho lược được xếp
thẳng hàng và gắn chắc với bể điện di. (Khi đặt lược, có thể kê cao 2 đầu lược để
tránh tạo giếng quá sâu)
 Đổ gel (thí nghiệm này yêu cầu gel có nồng độ 1%)
3. Cân 0,5 g agarose hòa tan bằng đệm TAE , thể tích đệm TAE là 50mL
(nồng độ gel cuối là 1%). Một khay chứa gel nhỏ có thể chứa 25 mL gel, ở đây làm
pha 50mL gel tương ứng với 2 bản gel.
4. Đun nóng hỗn hợp trong lò vi sóng để hòa tan hoàn toàn gel agarose.
5. Làm nguội gel đến khoảng 55oC và lắc bình nhẹ nhàng để tránh bị bay hơi.
Bổ sung thêm dung dịch nhuộm an toàn Redsafe với lượng 2, 5 𝜇𝐿 cho
50000
25mL gel. (Vì thuốc nhuộm Redsafe ( 20000x) nên thể tích hút = = 2,5
20000
𝜇𝐿, trong đó 50mL là thể tích gel agarose đã pha).
 Hình 1: Hình ảnh minh họa thuốc nhuộm Redsafe ( 20000x)
 Tìm hiểu về thuốc nhuộm Redsafe :
Dung dịch nhuộm axit nucleic RedsafeTM(20,000x) là một chất nhuộm axit
nucleic mới và an toàn, nó được sử dụng thay thế cho chất nhuộm truyền thống
Ethidium Bromide (EtBr) để phát hiện ra axit nucleic trong gel agarose.
Nguyên lý: Nó sẽ phát xạ huỳnh quang màu xanh khi liên kết với DNA hoặc
RNA. Chất nhuộm mới này có 2 điểm kích thích phát huỳnh quang cực đại khi liên
kết với axit nucleic, một điểm có trung tâm ánh sáng ở 309nm và điểm còn lại ở
419nm. Chất phát xạ huỳnh quang của RedsafeTM liên kết với DNA ở trung tâm
537nm.
Đặc điểm:
Dung dịch RedSafeTM (20,000x) có độ nhạy tương đương với EtBr.
Các bước nhuộm với RedsafeTM cũng giống như khi nhuộm với EtBr.
Bởi vì EtBr là 1 chất gây đột biến mạnh, gây nguy hại trong quá trình sử dụng,
còn RedSafeTM ít gây đột biến hơn,không gây ung thư, không tạo ra chất thải độc
hại nên trong thí nghiệm này ta dùng Redsafe thay cho thuốc nhuộm truyền thống
EtBr. (Chú ý khi thực hiện pha gel cũng phải đeo găng tay và tránh dây vào da, niêm
mạc…)
6. Đổ lượng gel agarose vào trong khay, đổ từ từ tránh bọt khí (nếu có bọt khí
sử dụng đầu tip sạch để kéo bọt khí về phía thành bản điện di), đổ gel vào đến gần
hết chiều cao của khay.
7. Chờ cho gel đông lại hoàn toàn. Thời gian chờ khoảng 30-45 phút.
  Chuẩn bị gel để điện di
8. Tháo lược bằng cách nhẹ nhàng kéo lược theo chiều thẳng đứng, chú ý
không làm thủng giếng.
9. Đặt bản gel và khay đựng gel ở trong bể điện di, kiểm tra chiều điện di.
(Các phân tử nucleic acid chạy từ cực âm sang cực dương, vì vậy các giếng phải
được đặt gần cực âm).
10. Đổ đầy đệm chạy vào trong bể điện di sao cho dung dịch đệm ngập bản
gel.
 Tiến hành điện di gel agarose
11. Sử dụng micropipet để tra các mẫu vào giếng.
7 µL sản phẩm PCR được trộn với 2 µL gel loading dye trước khi được tra
vào giếng. Mỗi bản gel sẽ được tra DNA ladder với lượng 7 µL
Ở đây có 3 mẫu PCR:
 1 mẫu DNA tách chiết ở bài 2 (1) (nhóm em sử dụng kết quả PCR gen
mã hóa 16S rRNA của vi khuẩn Bacillus Subtilis (tách chiết bằng
phương pháp sốc nhiệt)
 1 mẫu đối chứng dương (2)
 1 mẫu đối chứng âm (3)
Cả 3 mẫu này đều được PCR và giữ trong tủ lạnh trước khi mang ra sử dụng.
 Cách trộn mẫu PCR với gel loading dye :
Lấy một mảnh giấy bạc, hút 3 lần, mỗi lần 2 µL gel loading dye vào 3
vị trí khác nhau.
Hút 7 µL mẫu âm tính (3) phủ lên trên bề mặt gel loading dye ở trên
mảnh giấy bạc, dùng micropipet đảo trộn vài lần cho đồng đều rồi hút toàn bộ
9 µL hỗn hợp cho vào giếng 1 trên bản điện di. (Gọi là mẫu 1.3 – ký hiệu
nhóm 1)
Hút 7 µL mẫu tách chiết DNA của bài thí nghiệm 2 (1) phủ lên trên bề
mặt gel loading dye ở trên mảnh giấy bạc, dùng micropipet đảo trộn vài lần
cho đồng đều rồi hút toàn bộ 9 µL hỗn hợp cho vào giếng 2 trên bản điện di.
(gọi là mẫu 1.1)
 Hút 7 µL mẫu dương tính (2) phủ lên trên bề mặt gel loading dye ở trên mảnh
giấy bạc, dùng micropipet đảo trộn vài lần cho đồng đều rồi hút toàn bộ 9 µL hỗn
hợp cho vào giếng 3 trên bản điện di. (gọi là mẫu 1.2)
 Như vậy, thứ tự tra giếng của nhóm 1 là : mẫu âm tính (1.3) => mẫu tách
chiết DNA bài 2 (1.1) => mẫu dương tính 1.2)
 Sau khi các nhóm lần lượt tra xong mẫu vào giếng, tiến hành tra vào giếng
cuối mẫu DNA ledder (hút 7 𝜇𝐿 mẫu DNA ledder ).
12. Đậy nắp bình điện di một cách cẩn thận.
13. Cắm dây màu đen vào trong đầu vào màu đen của nguồn điện (cực âm),
cắm dây màu đỏ vào đầu vào màu đỏ của nguồn điện (cực dương)
14. Đặt điện thế ở 100V và chạy trong 30-45 phút.
Kiểm tra xem liệu dòng điện có được lắp đúng không và quá trình điện di có
đang diễn ra hay không, ta sẽ nhìn thấy các bọt khí nổi lên ở các điện cực, đồng thời
các mẫu chạy theo chiều điện di.
Chạy điện di đến khi vạch chạy còn cách mép bản điện di từ 1,5- 2cm thì dừng
lại.
15. Sau khi kết thúc điện di, tắt nguồn điện, tháo các dây nối và nắp bể điện
di.
Nhuộm gel bước nhuộm gel không làm vì đã bổ sung thêm thuốc nhuộm Redsafe
vào bản gel trước khi chạy điện di).
16. Sau khi chạy điện di xong, nhấc bản gel ra, có thể dùng giấy thấm bớt
dung dịch đệm chạy.
17. Rửa gel bằng nước.
18. Quan sát kết quả trên hệ thống soi gel ( hệ thống soi gel sử dụng tia UV)
III.Kết quả thí nghiệm.
Đem soi bản gel trên hệ thống soi gel ta quan sát được kết quả như sau:
  Giếng 1: Mẫu âm tính (mẫu 1.3)
 Giếng 2: Mẫu DNA tách chiết được từ vi khuẩn Bacillus subtilis ở bài thí
nghiệm số 2 (mẫu 1.1)
 Giếng 3: Mẫu DNA dương tính (mẫu 1.2 )
 Giếng 8: DNA Ledder
Nhận xét:
Cả ba giếng 1,2,3 đều hiện vạch, so với thang DNA ledder chuẩn thì ở vạch 1500
bp.
Giếng 1 là mẫu âm tính. Theo lý thuyết mẫu này không hiện vạch do không có
DNA. Tuy nhiên trong quá trình thao tác chưa chuẩn,đầu pipet chưa sạch nên chưa
đảm bảo được điều kiện vô trùng cho mẫu nên trong mẫu vẫn chứa một lượng nhỏ
DNA, chính vì thế khi điện di giếng này vẫn hiện một vach mờ, mảnh.
Giếng 2 và 3:
 Hiện vạch rõ ràng và đậm nét, chứng tỏ hàm lượng DNA trong mẫu tương đối
cao. Chứng tỏ quá trình thực hiện phản ứng PCR đã cho kết quả tốt. Tuy
nhiên mẫu vẫn chưa tinh sạch một cách hoàn toàn.
 Giếng 2 là mẫu DNA tách chiết được từ vi khuẩn Bacillus Subtilis bằng
phương pháp sốc nhiệt (do mẫu tách chiết bằng phương pháp tiêu chuẩn không
sử dụng để PCR ) , vạch mẫu hiện rõ nét, độ sáng cao. Tuy nhiên quá trình
chạy điện di vẫn để lại các vạch mờ do trước đó mẫu DNA chưa được tinh
 sạch hoàn toàn ( theo lý thuyết chỉ có DNA mới hiện sáng khi soi gel dưới tia
UV, các vạch mờ là do các plasmid vụn còn sót lại trong quá trình tinh sạch
DNA).
 Giếng 3 là mẫu dương tính ( mẫu DNA đã được PTN chuẩn bị sẵn để kiểm
chứng kết quả chạy điện di : nếu mẫu DNA tách chiết được ở bài 2 không hiện
vạch mà chỉ có mẫu dương tính hiện vạch thì kết quả PCR của bài 2 không
thành công). Mẫu này vạch hiện rõ, độ sáng cao.
Kết luận:
Sau khi đọc kết quả điện di, thấy rằng quá trình tách chiết DNA tổng số từ vi
khuẩn Bacillus subtilis (nhóm 1 thực hiện với vi khuẩn Bacillus subtilis) ở bài thí
nghiêm 1 thành công, quá trình PCR khuếch đại gen 16S rRNA ở bài thí nghiệm 2
thành công.
Tuy nhiên kết quả chạy điện di chưa sạch.
Nội dung 2 : Biến nạp plasmid vào tế bào E.coli khả biến

I.Mục đích thí nghiệm

Hiểu về biến nạp plasmid.
Biết cách biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli khả biến.
II. Quy trình thí nghiệm
2.1.Vật liệu
Plasmid pJET1.2/blunt-VP6.

 Tế bào E.coli BL21.

 Đá vụn và hộp đựng đá .
 Môi trường SOS lỏng, môi trường LB thạch có ampicillin và không có
ampicillin (đã được chuẩn bị sẵn).
 Đá bào .
 Môi trường LB : trytone 10g
Yeast xtract 5g
NaCl 5g
Nước 1 lít .
 Môi trường SOC : tryptone 20g
Yeast xtract 5g
NaCl 10 mM
KCl 2,5 mM
𝑀𝑔𝐶𝑙2 10 mM
𝑀𝑔𝑆𝑂4 10mM
Glucose 20 mM
2.2.Quy trình
 Chuẩn bị tế bào khả biến
Bước 1 đến bước 3 được thực hiện trước bởi cán bộ phòng thí nghiệm
B1. Lấy 1 khuẩn lạc từ đĩa cấy vạch chủng E. coli BL21 (DE3) thương mại,
đưa vào 2ml môi trường LB lỏng .
B2. Nuôi qua đêm ở 370C .
B3. Cấy chuyển vào môi trường LB lỏng nuôi trong 18h
B4. Hút canh trường E. coli vào ống Eppendorf 1.5 mL. Ly tâm thu sinh khối
3000 vòng, 5 phút ở 40C. Tuy nhiên, do máy ly tâm lạnh bị hỏng, nên đã chuyển
sang ly tâm thường trong 5 phút.
B5. Hòa tan tủa trong 1 mL CaCl2 0.1M vô trùng, để trên đá lạnh 15 phút.
Dùng micropipet đảo trộn nhẹ nhàng để sinh khối đồng đều trong dung dịch.
B6. Ly tâm 2500 vòng/phút, 2 phút , loại bỏ dịch nổi. (Theo lý thuyết là ly
tâm lạnh ở 40C nhưng do máy ly tâm lạnh bị hỏng => ly tâm thường)
B7. Hòa tan tủa trong 100 µL CaCl2 0.1M vô trùng. Dùng micropipet đảo trộn
nhẹ nhàng để sinh khối đồng đều trong dung dịch. Đến thời điểm này, tế bào E. coli
trở thành tế bào khả biến và có thể thu nhận DNA trong môi trường.

Giải thích : Dùng CaCl2 0.1M để dãn màng tế bào E.Coli giúp plasmid dễ dàng
chui vào => gọi là tế bào E.Coli khả biến.
Ở bước 5 và bước 7 , hòa tan tủa bằng CaCl2 0.1M nhưng dùng 2 thể tích khác
nhau ( 1mL và 100𝜇𝐿 ) vì trong bước 5 hòa tan tủa, dùng dung dịch CaCl2 với thể
tích lớn để lượng tế bào tiếp xúc lớn nhất với CaCl 2, màng tế bào dãn ra tạo điều
kiện để DNA plasmid chui qua dễ dàng.
Còn ở bước 7, lặp lại quá trình hòa tan tủa trong 100 𝜇𝐿 CaCl2 0.1M để duy trì
trạng thái dãn của màng tế bào E.Coli và tăng hiệu quả của quá trình biến nạp ở bước
tiếp theo ( thể tích nhỏ thì hiệu quả sốc nhiệt và biến nạp sẽ tốt hơn thể tích lớn, nhiệt
độ sẽ khếch tán đồng đều hơn trong mẫu )

 Biến nạp và trải đĩa

B8. Bổ sung 2 µl DNA plasmid (PTN chuẩn bị) vào 100 µL tế bào khả biến
chuẩn bị ở trên
B9. Trộn nhẹ nhàng, để trong đá 30 phút.
B10. Sốc nhiệt ở 420C trong chính xác 90 giây.
Lưu ý ở bước này cần bấm thời gian chuẩn xác, vì nếu thời gian sốc nhiệt quá ngắn
thì không đủ làm thủng màng tế bào và DNA plasmid sẽ không biến nạp vào được.
Trường hợp thời gian sốc nhiệt dài hơn 90 giây ( khoảng 1 – 2 phút ) thì lỗ thủng
trên màng tế bào quá lớn, vi khuẩn sẽ chết và DNA plasmid cũng bị mất khả năng
biến nạp vào tế bào.
 B11. Chuyển ống lên khay đựng đá bào trong 2 phút
Sau khi sốc nhiệt làm cho màng tế bào dãn ra tạo lỗ thủng, thì đưa tế bào vào môi
trường có nhiệt độ thấp để tạo điều kiện cho màng tế bào co lại (tế bào E.Coli bị tổn
thương ở mức độ nhẹ, quá trình sinh trưởng sau biến nạp vẫn có thể diễn ra, tạo
khuẩn lạc mong muốn).
B12. Trộn 500 µl môi trường LB vào ống, ủ ở 370C trong 1h, có lắc 200
vòng/phút.
B13. Cấy canh trường lên hộp petri
 Trải 50 µL canh trường E. coli đã được biến nạp ở trên lên mỗi hộp Petri
chứa thành phần môi trường như sau:
 1 hộp chứa môi trường LB + Ampicillin (100 µg/ml) (hộp petri 1)
 1 hộp chứa môi trường LB không bổ sung Ampicillin (kiểm chứng) (hộp
petri 2)
 Trải 50 µL canh trường E. coli không được biến nạp plasmid lên hộp petri
chứa môi trường LB + Ampicillin (100 µg/ml) (hộp petri 3 – dùng chung
cho tất cả các nhóm).
Giải thích:
Ở đây dùng môi trường dinh dưỡng LB (môi trường có độ dinh dưỡng trung
bình) mà không dùng môi trường SOC (môi trường giàu dinh dưỡng, gồm nhiều
thành phần vi lượng) là vì: E.Coli là chủng vi khuẩn có khả năng biến nạp tốt, quá
trình biến nạp plasmid ở đây là biến nạp thông thường nên sử dụng môi trường LB
đã đáp ứng được yêu cầu của thí nghiệm, không cần sử dụng môi trường giàu dinh
dưỡng SOC.
Mẫu kiểm chứng bao gồm 2 mẫu :
 Mẫu kiểm chứng 1 : hộp petri được trải canh trường E.Coli đã biến nạp + môi
trường LB không bổ sung Ampicillin (100 µg/ml) (hộp petri 2)  Mục đích
là để kiểm chứng mật độ tế bào E.Coli phát triển trên hộp sau thời gian nuôi
cấy.
 Theo lý thuyết, mật độ tế bào trên hộp petri này (hộp petri 2 ) sẽ lớn
hơn rất nhiều mật độ tế bào trên hộp petri 1.
Do trên hộp petri 1 chỉ có những tế bào E.Coli đã được biến nạp có bổ
sung gen kháng kháng sinh mới sinh trưởng và phát triển được.
Còn trên hộp petri 2 cả những tế bào E.Coli đã được biến nạp thành
công và chưa được biến nạp đều có khả năng sinh trưởng và phát triển bình
thường.
 Mẫu kiểm chứng 2 : hộp petri được trải canh trường E.Coli chưa được biến
nạp plasmid + môi trường LB + Ampicillin (100 µg/ml) (hộp petri 3)
 Mục đích là để kiểm chứng xem trong tế bào vi khuẩn E.Coli sử dụng
trong thí nghiệm này đã có sẵn gen kháng kháng sinh hay chưa, và kiểm
tra môi trường có đạt yêu cầu không (nếu E.Coli không có sẵn gen
 kháng kháng sinh mà vẫn phát triển thành khuẩn lạc thì chứng tỏ chất
lượng Ampicillin không đạt chuẩn hoặc có thể lúc đổ môi trường
Ampicillin cho vào lúc nóng => bị biến tính, mất tác dụng).

B14. Nuôi ở 370C, trong 24 giờ

B15. Quan sát và đếm số khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa.

III. Kết quả thí nghiệm

Hình 2: Hình ảnh đĩa thạch chứa canh trường E.Coli đã được biến nạp DNA plasmid
trong môi trường LB có bổ sung Ampicillin (100𝜇𝑔/𝜇𝐿) sau 24h ở 370C
Nhận xét:
Kết quả ta đếm được 348 khuẩn lạc .
Khuẩn lạc đồng nhất về hình dáng (hình tròn), màu sắc (trắng), rời nhau và
trải dài trên đĩa thạch.
 Hình 3: Hình ảnh đĩa thạch petri có chứa canh trường E.Coli đã được biến nạp
plasmid trong môi trường LB không bổ sung Ampicillin sau 24h ở 370C
Nhận xét:
Trên đĩa có quá nhiều khuẩn lạc mọc lên màu trắng, dày đặc tạo thành một lớp màng
mỏng trên mặt thạch, không thể phân biệt rõ các khuẩn lạc bằng mắt thường.

Hình 3: Hình ảnh đĩa thạch chứa canh trường E.Coli chưa được biến nạp DNA
plasmid trong môi trường LB có bổ sung Ampicillin (100𝜇𝑔/𝜇𝐿) sau 24h ở 370
 Nhận xét: Đĩa thạch không có khuẩn lạc nào mọc lên.
III. Kết luận
Đã hoàn thành mục đích thí nghiệm.
Đĩa 2 (hình 2) do không bổ sung kháng sinh Ampicillin, canh trường vi khuẩn
E.Coli phát triển mạnh ( cả tế bào đã biến nạp và chưa biến nạp đều phát triển), nên
số lượng khuẩn lạc mọc lên quá nhiều, dày đặc tạo thành 1 lớp màng mỏng.
Đĩa 3 (hình 3) do môi trường có bổ sung kháng sinh Ampicillin, vi khuẩn
E.Coli không được biến nạp DNA plasmid nên không có gen kháng kháng sinh =>
vì vậy mà không có khuẩn lạc nào mọc lên ( đã kiểm chứng được chủng E.Coli và
môi trường )
Đĩa 1 (Hình 1) do môi trường có kháng sinh Ampicillin nên chỉ có những tế
bào vi khuẩn E.Coli đã được biến nạp DNA plasmid (có mang gen kháng kháng
sinh) mới có thể phát triển thành khuẩn lạc.
Số lượng khuẩn lạc trên đĩa tương đối nhiều, đồng đều, màu sắc, hình dạng và
kích thước tương đối đồng nhất => quá trình cấy lên đĩa thạch tương đối tốt, thao tác
chang khá đều nên các khuẩn lạc không bị tụ lại, chủng E.Coli đã biến nạp có khả
năng sinh trưởng tốt, khuẩn lạc mọc lên nhanh và mạnh.