BÀI 4: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

KUNITZ CẢI TIẾN

I. MỤC TIÊU VÀ NGUYÊN TẮC

- Mục tiêu: Xác định hoạt tính enzyme
- Nguyên tắc: Phương pháp đo dựa vào phản ứng thuỷ phân cơ chất protein bởi
enzyme. Phản ứng dừng lại nhờ acid trichloroacetic (TCA). Sau đó sản phẩm tạo
thành được xác định dựa vào độ hấp thụ ánh sáng của sản phẩm acid amin sinh ra ở
bước sóng 275 - 280 nm.
II. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ. HÓA CHẤT
-Thiết bị: Máy đo quang phổ, máy lắc ủ, máy ly tâm tốc độ (1400 v/p), cân,…
-Dụng cụ: Micropipet 20, 1000, 5000 µL; ống eppendorf 1.5mL…
-Hóa chất: Dung dịch đệm Na-phosphate, casein 1% (m/v), dung dịch acid
trichloroacetic 15% (w/v), tyrosine 1µmol/mL…
III. TIẾN HÀNH THÍ NGIỆM
1. Xây dựng đường chuẩn Tyrosine
-Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
-Dựng đường chuẩn theo bản sau:
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
[Tyrosine] (µmol/mL 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
VTyrosine 0 300 600 900 1200 1500
Pha loãng (µL) 1500 1200 900 600 300 0
-Tính giá trị trung bình ba lần lặp lại.
-Vẽ đường tuyến tính nồng độ Tyrosine với độ hấp thụ tại bước sóng 280nm
Bảng 4.1: báo cáo nhập liệu kết quả thí nghiệm đường chuẩn Tyrosin

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Tyrosin 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
(µmol/mL)
Giá trị OD1 0.141 0.356 0.654 0.887 1.094 1.286
Giá trị OD2 0.143 0.397 0.654 0.888 1.109 1.285
Giá trị OD3 0.139 0.398 0.649 0.887 1.109 1.31
ODTB 0.141 0.384 0.652 0.887 1.104 1.294
ODTB-ODĐC 0 0.243 0.511 0.746 0.963 1.153
2. Xác định hoạt tính enzym bằng phương pháp Kunitz cải tiến
- Thí nghiệm 3 lần lặp lại
- Thí nghiệm được tiến hành trong các ống eppendoft. Tương ứng mỗi mẫu emzyme,
ta thực hiện một mẫu đối chứng để khi đo độ hấp thụ t chuyển giá trị mẫu đối chứng
về 0. Dựa vào hàm lượng protein chọn độ pha loãng thích hợp.
 Các bước đo hoạt tính mẫu đối chứng:

20 μL Cystine + 160 μL dung dịch đệm pH 7.5 + 20 μL enzyme

Ủ 37OC, 20 phút
Bổ sung 600 μL TCA 15%
Lắc ủ 10 phút, 37OC
Bổ sung 600 μL Casein 1%
Ổn định 4OC
Ly tâm 13.000 v/p, 10 phút, 4OC

Đo độ hấp thụ ở 280 nm                                  

 Các bước đo hoạt tính enzyme:

20 μL Cystine + 160 μL đệm  phosphat pH 7.5 + 20 μL enzyme

Ủ 37OC, 20 phút
Bổ sung 600 μL Casein 1%
Lắc ủ 10 phút, 37OC
Bổ sung 600 μL TCA 15%
Ổn định 4OC
Ly tâm 13.000 v/p, 10 phút, 4OC

Đo độ hấp thụ ở 280 nm

3. Tính toán kết quả

* Hoạt tính enzyme trong 1 mL được tính theo công thức sau:

axVt
U =( )∗k
TxVE

Trong đó: U: Hoạt tính trong 1mL dung dịch enzyme (U/mL)
 a: Nồng độ tyrosine sinh ra trong dung dịch thủy phân ( μM/mL)

Vt: Thể tích nồng độ của dung dich phản ứng (1400 μL)
T: Thời gian phản ứng (10 phút), k*: Hệ số pha loãng

VE: Thể tích dung dịch enzyme sử dụng phản ứng (20 μL)
3.1 Kết quả thí nghiệm

Ống nghiệm K=1 K=2 K=5

E thô Lần 1 0.998
Lần 2 0.986
Lần 3 0.998
Trung bình 0.994
Đối chứng 0.626
∆ OD 0.368
HL protein ( μg/mL) 0.337
Kết luận: Hoạt tính mẫu E thô cao nhất trong 3 mẫu vì lượng protein
trong mẫu lớn hơn các mẫu còn lại. Tuy nhiên số liệu còn chênh lệch
nhỏ giữa mẫu pha loãng do thao tác pha loãng và đo OD không chính
xác. Đồng thời cho thấy enzym vẫn chưa được tinh sạch tốt dẫn đến
sai lệch trong việc xác định hoạt tính.
UB Lần 1 0.744
Lần 2 0.780
Lần3 0.604
Trung bình 0.709
Đối chứng 0.629
∆ OD 0.08
HL protein ( μg/mL) 0.063
Kết luận: Không có sự khác biệt đáng kể giữa các giá trị OD ở 3 lần
lặp lại. Hoạt tính enzyme ở mẫu UB thấp nhất có thể do quá trình ly
trích, tinh sạch làm cho hoạt tính enzyme bị mất đi và enzyme chưa
được tinh sạch tốt, có sai sót trong thao tác thí nghiệm.
F1 Lần 1 0.910
Lần 2 0.900
Lần 3 1.000
Trung bình 0.937
Đối chứng 0.604
∆ OD 0.333
HL protein ( μg/mL) 0.304
Kết luận: Không có sự khác biệt giữa các giá trị OD ở 3 lần lặp lại.
 Bảng: hàm lượng protein của mẫu
Tên Thể Hàm Hoạt Hoạt HL Hoạt tính
mẫu tích lượng tính tính protein đặc hiệu
(mL) Tyrosin (U/ml) tổng tổng (mg) (U/mg)
( μg/ml) (U)
E thô 20 0.337 2.359 47.18
UB 25 0.063 0.441 11.025
F1 12 0.304 2.128 25.536

Hoạt tính tổng = hoạt tính (U/mL)/thể tích (mL)

Hàm lượng protein tổng : hàm lượng prtein trung bình từ bài 3
Hoạt tính đặc hiệu = hoạt tính tổng (U)/hàm lượng protein tổng (mg)
3.2. Trình bày cơ chế thủy phân casein của bromelain
Cơ chế tác động của bromelain: các nhóm –SH của cystine, nhóm imidazole
của histidine và nhóm disulfure có vai trò quan trọng trong hoạt động thủy phân của
bromelain.
Nhóm –SH: tham gia cấu tạo nên acyl-thioester trung gian cùng nhóm carboxyl
của cơ chất (nơi các liên kết peptide bị cắt).
Nhóm imidazole: chất trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhóm anion của
chất nhận khác.
Cầu nối S-S: duy trì cấu trúc không gian của bromelain.
Casein và hemoglobin là 2 cơ chất tự nhiên được dùng nhiều nhất.
Bromelain kết hợp với protein thủy phân sơ bộ cho ra polypeptide và acid
amine.
Protein kết hợp với nhóm –SH của enzyme bị ester hóa, sau đó nhóm imidazole
khử ester để giải phóng enzyme, acid amine và peptide.
Zn2+ kết hợp với nhóm –SH của tâm hoạt động làm hình thành mercaptid phân
ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo lên kết phối trí với các nhóm chức năng khác của
phân tử protein, amin, carboxul...)
Enzyme –S + Zn2+ enzyme              enzyme-S-Zn + H+
=> Do vậy nhóm –SH ở tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc không
gian được bảo vệ ổn định.
3.3 Kết quả thủy phân dự kiến thu được những sản phẩm nào?
Sản phẩm thu được: enzyme bromelain và một số sản phẩm phụ khác.