BÀI 4.

TINH CHẾ ENZYME AMYLASE BẰNG ALGINAT

quy trình thu enzyme thô

Khoai lang
Đệm phosphate (1:1)

Xay (1 min)

Lọc qua rây

Để yên cho tinh

bột lắng

Gạn lấy dịch

Lọc qua giấy lọc

Enzyme thô
quy trình tinh chế enzyme

Enzyme thô
(10ml)

sodium alginate 2% (trong đệm CH3COONa 0,2M) 1:3

Khuấy đều

Ủ 1h
cho từ từ 20ml CaCl2 0,7M

Khuấy đều

Lọc thu tủa

cho từ từ 20ml CaCl2

Thôi E.amylase

Ủ 4oC/12h

Lọc bỏ tủa thu

enzyme tinh chế

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

V enzyme tinh chế = Vtc = 30ml.
V enzyme thô = V = 10ml.
Kết quả đo OD xác định hàm lượng protein tổng
enzyme enzyme tinh
  thô chế
OD 280 (OD 280nm) 0.6705 0.8257
Thể tích enzyme (V) 10ml 30ml
Độ pha loãng (N) 20 1
Lương protein (A 280nm = OD280 x V x N) 134.1 24.771

Kết quả đo xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Heinkel
a) Xây dựng đồ thị đường chuẩn amylase

Ống 1 2 3 4 5
U/ml 0.2 0.4 0.6 0.8 1
OD 0.2677 0.4896 0.7018 0.9293 1.1112

Đường chuẩn xác định hoạt tính amylase

OD
1.2
1 f(x) = 1.06 x + 0.06
R² = 1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1

Ta được, phương trình OD = f(U/ml) là y = 1.063x + 0.061 (R 2 = 0.998).

Kết quả đo OD ống thử và ống chuẩn

  enzyme thô enzyme tinh chế

OD ống thử (ODT) 0.3622 0.7218
OD ống chứng (ODC) 1.1069 1.069
 OD = ODC - ODT 0.7447 0.3472
Độ pha loãng (0.1 1ml,
0.11ml) 100 100
Hoạt tính riêng enzyme (HTE) 64.32 26.92
 (U/ml)
suy ra từ đường chuẩn
Trước phép thử, eznyme thô được pha loãng 100 lần với đệm phosphate

Enzyme tinh chế được pha loãng 10 lần với đệm phosphate.

Tổng hoạt tính (U) enzyme thô = HTE x N x V enzyme thô = 64.32 x 100 x 10 = 64320 U

Tổng hoạt tính (U) enzyme tinh chế = HT E x N x V tinh chế = 26.92 x 10 x 30 = 8076 U

Thông số qui trình tinh chế Tổng protein Tổng hoạt tính Hoạt tính Hiệu suất Mức tính chế
(A280 nm) (U) riêng (%) (lần)
(U/A280nm)
Enzyme thô 134.1 64320 479.6
12.6 0.7
Enzyme tinh chế 24.771 8076 326.0

Nhận xét:

Hiệu suất sau quá trình tinh chế và mức tinh chế thấp.

BÀI 5: CỐ ĐỊNH CGTASE LÊN ALGINATE

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

1) Tính hàm lượng và hiệu suất protein cố định

Thông số đường chuẩn BSA

Thông số đường chuẩn BSA

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Nồng độ BSA (g/ml) 0 10 20 30 40 50
OD 595 0.5803 0.625 0.8061 0.923 1.0431 1.164
OD 595 0 0.0447 0.2258 0.3427 0.4628 0.5837
 OD Thông số đường chuẩn BSA
0.7
0.6
f(x) = 0.01 x − 0.06
0.5 R² = 0.99
0.4
0.3
0.2
0.1
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

BSA (g/ml)

Xác định hàm lượng protein của enzyme ban đầu

Hàm lượng protein ban đầu

OD 595 0.9360
 OD 595 0.3557
Độ pha loãng 10

V enzyme cố định = 1ml

V gộp bắt giữ = 39ml

V gộp hấp phụ = 41ml

Hàm lượng protein ban đầu suy ra từ đường chuẩn = (0.3557+0.0626)/0.0132 = 31.69 g/ml.

Với độ pha loãng 10 lần nên hàm lượng protein ban đầu là = 31.69 x 10 = 316.9 g/ml.

Vậy hàm lượng protein ban đầu (đem cố định) là 1 ml nên: 316.9 g = 0.3169 mg.

- Kết quả đo hàm lượng protein trong dịch gộp phương pháp CĐ theo bắt giữ

Hàm lượng protein trong dịch gộp phương

Pháp CĐ theo bắt giữ
OD 595 0.6101
 OD 595 0.0298
Độ pha loãng 1

Hàm lượng protein trong dịch gộp phương pháp CĐ theo bắt giữ suy ra từ đường chuẩn là =
(0.0298+0.0626)/0.0132 = 7 g/ml.
Với độ pha loãng là 1 và V gộp bắt giữ = 39ml, nên hàm lượng protein trong dịch gộp theo phương pháp CĐ
theo bắt giữ là = 7 x 1 x 39 = 275 g = 0.273 mg.

Khối lượng protein cố định = khối lượng protein ban đầu – khối lượng protein không cố định

Khối lượng protein cố định phương pháp bắt giữ = 0.3169 – 0.273 = 0.0439 mg.

- Kết quả đo hàm lượng protein trong dịch gộp phương pháp CĐ theo hấp phụ.

Hàm lượng protein trong dịch gộp phương

Pháp CĐ theo hấp phụ
OD 595 0.6094
 OD 595 0.0291
Độ pha loãng 1
Hàm lượng protein trong dịch gộp phương pháp CĐ theo hấp phụ suy ra từ đường chuẩn là =
(0.0291+0.0626)/0.0132 = 6.9487 g/ml.

Với độ pha loãng là 1 và V gộp hấp phụ = 41ml, nên hàm lượng protein trong dịch gộp theo phương pháp CĐ
theo bắt giữ là = 6.9487 x 1 x 41 = 284.90 g = 0.2849 mg.

Khối lượng protein cố định = khối lượng protein ban đầu – khối lượng protein không cố định

Khối lượng protein cố định phương pháp hấp phụ= 0.3169 – 0.2849 = 0.032 mg.

Bảng tổng kết hàm lượng protein của enzyme thô và tinh chế.

MẪU OD 595  OD 595 Thể tích (ml) Hàm lượng protein

(mg)
enzyme ban đầu 0.9360 0.3557 1 0.3169
enzyme không CĐ theo bắt giữ 0.6103 0.0298 39 0.273
enzyme CĐ theo bắt giữ 0.0439
enzyme không CĐ theo hấp phụ 0.6188 0.0385 41 0.2849
enzyme CĐ theo hấp phụ 0.032

2) Xác định hoạt tính CGtase cố định

thông số đường chuẩn CĐ

Số thứ tự 1 2 3 4 5 6
Nồng độ CD (mg) 0 2 4 6 8 10
OD 550 1.3446 1.131 1.0504 0.9597 0.8906 0.7896
 OD 550 - 0.2136 0.2942 0.3849 0.454 0.555
 OD
Đường chuẩn beta-cyclodextriin
0.6

0.5 f(x) = 0.04 x + 0.13

R² = 1
0.4

0.3

0.2

0.1

0 CD (mg)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Phương trình đường chuẩn OD = f(CD) là y = 0.421x + 0.127 (R2 = 0.997)

- Xác định hoạt tính enzyme ban đầu

Độ pha loãng enzyme ban đầu là 30 lần.

xác định hoạt tính enzyme ban đầu

OD chứng 1.7215
OD thử 1.4473
 OD 0.2742
Lượng mg cyclodextrin tương ứng được tạo ra do enzyme GGTase ban đầu là:

= (0.2742 – 0.127)/0.042 = 3.504 mg/ml.

3.505 (mg/ml) = 3505 (g/ml)

Hoạt tính enzyme CGtase ban đầu được tính theo công thức:

Lượng CD x 10 x n
HT = (U/ml)
Mxt
Trong đó:

n: hệ số pha loãng

a: hệ số góc của đường chuẩn nồng độ CD theo mật độ quang

t: thời gian phản ứng

M: khối lượng riêng của CD (M= 1135)

10: tỉ lệ enzyme phản ứng: 1ml/0,1 ml = 10.

Do đó:

Lượng CD x 10 x n 3505 x 10 x 30
HT enzyme ban đầu = = = 61.76 (U/ml)
Mxt 1135 x 15
a) Xác định hoạt tính enzyme cố định bằng phương pháp bắt giữ

xác định hoạt tính enzyme cố định

bằng phương pháp bắt giữ
OD chứng 1.6226
OD thử 1.0589
 OD 0.5637
Lượng CD ban đầu (mg/ml) 10.398
10.398 (mg/ml) = 10398 (g/ml)

Lượng CD x 10000 x n 10398 x 10000 x 1

Hoạt tính enzyme cố định phương pháp bắt giữ = = = 10.18
M x t x 600 1135 x 15 x 600
(U/ml)

b) Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp hấp phụ

xác định hoạt tính enzyme cố định

bằng phương pháp hấp phụ
OD chứng 1.3658
OD thử 1.1719
 OD 0.1939
Lượng CD ban đầu (mg/ml) 1.593
1.593 (mg/ml) = 1593 (g/ml)

Lượng CD x 10000 x n 1593 x 10000 x 1

Hoạt tính enzyme cố định phương pháp hấp phụ = = = 1.54
M x t x 600 1135 x 15 x 600
(U/ml)

- Xác định hoạt tính riêng enzyme

Hoạt tính riêng enzyme tự do
HTC enz yme tự do 61.76
HTR enzyme ban đầu = = = 194.89 (U/mgprotein)
HL protein 0.3169
- Hoạt tính riêng của enzyme cố định:
HTC enzyme CĐ bắt giữ 10.18
- HTR enzyme CĐ phương pháp bắt giữ = = = 231.89 (U/mg
HL proteinCĐ bắt giữ 0.0439
protein)
HTC enzyme CĐ hấp phụ 1.54
- HTR enzyme CĐ phương pháp hấp phụ = = = 48.13 (U/mg
HL proteinCĐ hấp phụ 0.032
protein)
Bảng số liệu hoạt tính enzyme

hoạt tính enzyme

OD 550 OD 550 Hoạt tính chung
Mẫu chứng thử (U) Hoạt tính riêng (U/mg protein)
Enzyme ban đầu 1.7215 1.4473 61.76  192.22
Enzyme CĐ theo bắt giữ 1.6226 1.0589 10.18 231.89
Enzyme CĐ theo hấp phụ 1.3658 1.1719 1.54  48.13

Tỉ lệ hoạt tính enzyme cố định so với enzyme tự do:

HTR enzyme CĐ
TLHT =
HTR enzyme tự do

231.89
TLHT phương pháp bắt giữ = = 1.21
192.22
48.13
TLHT phương pháp bắt giữ = = 0.25
192.22
Nhận xét: Hoạt tính enzyme bằng phương pháp CĐ bắt giữ lớn hơn hoạt tính enzyme bằng phương pháp
CĐ hấp phụ

BÀI 10: TINH CHẾ LYSOZYME BẰNG SẮC KÝ ION

Đường chuẩn Bradford

Thông số đường chuẩn BSA

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Nồng độ BSA (g/ml) 0 10 20 30 40 50
0.580 0.62 0.806 0.92 1.043 1.16
OD 595 3 5 1 3 1 4
0.62 0.806 0.92 1.043 1.16
OD 595 0 5 1 3 1 4
 Thông số đường chuẩn BSA
0.7
0.6
f(x) = 0.01 x − 0.06
0.5 R² = 0.99
0.4
0.3
0.2
0.1
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Kết quả tinh chế lysozym bằng sắc ký trao đổi ion

Mẫu thử chứa lysozym

Mẫu A B C1 C2 C3 D1 D2 D3 Mẫu gộp D
Độ pha loãng 20 10   10 10 1 1 1  
A280 0.8722 1.1415   0.5844 0.463 0.9789 0.6791 0.5103  
 OD 0.2919 0.5612   0.0041 -0.1173 0.3986 0.0988 -0.07  
2.
Thể tích (ml) 1 1 5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5  
Lượng (mg) 544.46 479.38   25.42 0.00 17.72 6.18 0.00 23.90
hiệu suất = (mẫu gộp D)/Mẫu A *100 4.39

Nhận xét: Hiệu suất tinh chế enzyme lysozyme bằng sắc ký ion thấp.

có thể do các nguyên nhân như: