ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.

HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HỨA TRƯỜNG CHINH - MSHV: 20C61005

TỪ KHỞI THÀNH - MSHV: 20C61012

TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME

AMYLASE TÁI TỔ HỢP

BÁO CÁO THỰC TẬP HÓA SINH HỌC

Ngành: Hóa sinh học

Mã số ngành: 8420116

GVHD: TS. Trần Quốc Tuấn

TP. Hồ Chí Minh – Năm 2021

1
Mục lục
1. Tiến hành thí nghiệm ..................................................................................................... 3
2. Tinh sạch Amylase tái tổ hợp bằng sắc kí ái lực Ni2+-NTA agarose............................. 3
3. Kết quả ........................................................................................................................... 4
4. Kết luận ........................................................................................................................ 15

2
1. Tiến hành thí nghiệm
- Ly tâm 100 ml dịch khuẩn ở tốc độ 7000 vòng/phút, ở 100C trong 10 phút để thu dịch
enzyme ngoại bào bỏ sinh khối tế bào.
- Dịch sau ly tâm lấy 50ml tủa muối và 50ml tủa dung môi hữu cơ.
- Định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của dịch enzyme ban đầu (trước tủa).
- 2 mẫu tủa sẽ ly tâm, thu tủa và hòa thành 10ml (dịch enzyme sau tủa). Xác định hoạt tính
enzyme và hàm lượng protein của dịch enzyme sau tủa.
- Lấy mẫu tủa thích hợp tiếp tục tinh sạch bằng sắc ký ái lực.
2. Tinh sạch Amylase tái tổ hợp bằng sắc kí ái lực Ni2+-NTA agarose
Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị cột
- Nhồi 1 lớp bông thủy tinh có độ dày khoảng 2 mm vào ống tiêm 3 ml. (Lưu ý: bề mặt
lớp bông bằng phẳng).
- Đặt một lớp giấy lọc lên cột
- Cố định cột lên giá đỡ và nối dây truyền dịch với cột.
- Rửa cột với 1 ml đệm chiết tách, lặp lại 3 lần.
Cân bằng Ni2+-NTA agarose
- Cho 500 µl dịch Ni2+-NTA agarose vào tube 1,5 ml; ly tâm 13000 vòng/phút trong 2
phút ở 40C, loại bỏ dịch nổi.
- Huyền phù tủa trong 1 ml đệm chiết tách, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút ở 40C,
loại bỏ dịch nổi, thu nhận tủa, bước này được thực hiện 3 lần.
Tinh sạch protein
- Trộn 1 ml dịch enzyme sau tủa với Ni2+-NTA agarose cân bằng đã chuẩn bị ở bước trên,
lắc ở 40C trong 1 giờ.
- Sau 1 giờ, cho toàn bộ hỗn hợp protein và Ni2+-NTA agarose lên cột và thu dịch qua cột
(FT – flow-through), để ổn định cột trong 10 phút.
- Rửa phức hợp protein gắn với Ni2+-NTA agarose với 5 ml đệm rửa. Thu nhận dịch rửa
giải. Xác định hoạt tính và hàm lượng protein trong dịch rửa.
- Thôi giải protein mục tiêu với 1 ml đệm thôi giải, lặp lại 5 lần. Thu nhận các phân đoạn
protein thôi giải và bảo quản ở nhiệt độ lạnh. Xác định hoạt tính và hàm lượng protein
trong các phân đoạn.

3
 3. Kết quả

Đường chuẩn Bradford

Nồng độ (µg/ml) 0 10 20 30 40 50
OD1 0.075 0.086 0.099 0.107 0.117 0.128

0.075 0.087 0.097 0.107 0.119 0.126

OD2
OD3 0.076 0.087 0.099 0.109 0.116 0.129
Từ kết quả thu nhận được, ta nhận thấy ở nồng độ 0 µg/ml protein vẫn ghi nhận được giá
trị OD, điều này không đúng với lý thuyết. Nên giá trị OD ở nồng độ 0 µg/ml protein sẽ
được hiệu chỉnh về 0, và giá trị OD ở các nồng độ khác cũng được hiệu chỉnh tương ứng
(giá trị OD1, OD2 được trừ cho 0.075 ở các nồng độ khảo sát; giá trị OD3 được trừ cho
0.076 ở các nồng độ khảo sát). Từ đó tính toán ∆OD giữa 3 lần lập lại, ta được kết quả như
bảng sau:

Nồng độ (µg/ml) 0 10 20 30 40 50

OD1 0 0.011 0.024 0.032 0.042 0.053

OD2 0 0.012 0.022 0.032 0.044 0.051
OD3 0 0.011 0.023 0.033 0.040 0.053
∆OD 0 0.011 0.023 0.032 0.042 0.052

Xây dựng đường chuẩn protein

4
 Đường chuẩn tinh bột
Nồng độ (mg/ml) 0 2 4 6 8 10
OD1 0.053 0.119 0.161 0.207 0.227 0.302
OD2 0.054 0.112 0.161 0.206 0.228 0.305
OD3 0.055 0.111 0.160 0.203 0.221 0.300

Tương tự như trên, từ các giá trị OD ghi nhận được, ta nhận thấy ở nồng độ 0 µg/ml tinh
bột vẫn ghi nhận được giá trị OD, điều này không đúng với lý thuyết. Nên giá trị OD ở
nồng độ 0 µg/ml tinh bột sẽ được hiệu chỉnh về 0, và giá trị OD ở các nồng độ khác cũng
được hiệu chỉnh tương ứng (giá trị OD1, OD2, OD3 được trừ cho các giá trị tương ứng là
0.053, 0.054 và 0.055 ở các nồng độ khảo sát). Từ đó tính toán ∆OD giữa 3 lần lập lại, ta
được kết quả như bảng sau:

Nồng độ (mg/ml) 0 2 4 6 8 10

OD1 0 0.066 0.108 0.154 0.174 0.249

OD2 0 0.058 0.107 0.152 0.174 0.251
OD3 0 0.056 0.105 0.148 0.166 0.245
∆OD 0 0.060 0.107 0.151 0.171 0.248

Xây dựng đường chuẩn tinh bột

5
Nồng độ protein

Dịch OD 595nm
Enzyme thô trước tủa 0.118 0.12 0.121 Pha loãng 20 lần đo protein
Enzyme tủa cồn 0.118 0.112 0.111 Pha loãng 100 lần đo protein
Enzyme tủa muối 0.108 0.11 0.106 Pha loãng 100 lần đo protein

Dựa vào phương trình đường chuẩn của protein: y = 0.001x + 0.0008 (phương trình 1) với
R2 = 0.9983, ta lần lượt tính nồng độ protein có trong:
❖ Protein trong dịch nuôi cấy (enzyme thô trước tủa)
Cách tính: Giá trị OD tương ứng với hệ số y trong phương trình 1. Từ đó ta suy ra được giá
trị x tương ứng với nồng độ protein có trong mẫu thử. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, nên
nồng độ protein có trong mẫu thử tương đương với giá trị trung bình của 3 lần lặp lại trên.
+ Với OD = 0.118 ➔ x = 117.2 µg/ml
+ Với OD = 0.120 ➔ x = 119.2 µg/ml
+ Với OD = 0.121 ➔ x = 120.2 µg/ml
117.2+119.2+120.2
Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lặp lại: 𝑥̅ = = 118.87 µg/ml
3

Vì mẫu được pha loãng 20 lần trước khi đo OD, nên [protein] = 𝑥̅ × 20 = 2377.4 µg/ml =
2.3734 mg/ml. Vậy trong 100 ml dịch nuôi cấy có: [protein]dịch enzyme thô = 2.3774 × 100 =
237.34 mg.
❖ Protein sau tủa cồn
Cách tính nồng độ protein của dịch enzyme sau tủa cồn tương tự như phần dịch nuôi cấy,
thế các giá trị OD vào phương trình 1 ta được:
+ Với OD = 0.118 ➔ x = 117.2 µg/ml
+ Với OD = 0.112 ➔ x = 111.2 µg/ml
+ Với OD = 0.111 ➔ x = 110.2 µg/ml
117.2+111.2+110.2
Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: 𝑥̅ = = 112.87 µg/ml
3

Vì mẫu được pha loãng 100 lần trước khi đo OD, nên nồng độ protein thực sự có trong 1 ml
mẫu sau khi tủa cồn là: [protein]sau tủa cồn = 𝑥̅ × 100 = 11287 µg = 11.287 mg.
Suy ra trong 10 ml dịch sau tủa cồn có: [protein]sau tủa cồn = 11.287 × 10 = 112.87 mg.

6
❖ Protein sau tủa muối
Cách tính nồng độ protein của dịch enzyme sau tủa muối tương tự như phần dịch nuôi cấy,
thế các giá trị OD vào phương trình 1 ta được:
+ Với OD = 0.108 ➔ x = 107.2 µg/ml
+ Với OD = 0.110 ➔ x = 109.2 µg/ml
+ Với OD = 0.106 ➔ x = 105.2 µg/ml
107.2+109.2+105.2
Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: 𝑥̅ = = 107.2 µg/ml
3

Vì mẫu được pha loãng 100 lần trước khi đo OD, nên nồng độ protein thực sự có trong 1
ml mẫu sau khi tủa cồn là: [protein]sau tủa muối = 𝑥̅ × 100 = 10720 µg = 10.72 mg.
Suy ra trong 10 ml dịch sau tủa cồn có: [protein]sau tủa muối = 10.72 × 10 = 107.2 mg.
Tinh sạch enzyme

Dịch OD 595nm OD thử không - thử thật

TG1 0.118 0.12 0.121 0.218 0.321 0.221
TG2 0.113 0.115 0.111 0.193 0.195 0.191
TG3 0.139 0.131 0.129 0.254 0.131 0.129
TG4 0.127 0.127 0.123 0.157 0.167 0.143
TG5 0.099 0.091 0.091 0.069 0.071 0.061
Dịch rửa (5 ml) 0.098 0.09 0.089 pha loãng
0.008
30 lần (dịch0.01
rửa) 0.009

❖ Protein có trong dịch thôi giải 1 (TG1)

Cách tính nồng độ protein có trong TG1 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị
OD vào phương trình 1 ta được:
+ Với OD = 0.118 ➔ x = 117.2 (µg/ml)
+ Với OD = 0.120 ➔ x = 119.2 (µg/ml)
+ Với OD = 0.121 ➔ x = 120.2 (µg/ml)
117.2+119.2+120.2
Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: 𝑥̅ = = 118.87 (µg/ml)
3

 0.119 mg/ml.

7
❖ Protein có trong dịch thôi giải 2 (TG2)
Cách tính nồng độ protein có trong TG2 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị
OD vào phương trình 1 ta được:
+ Với OD = 0.113 ➔ x = 112.2 µg/ml
+ Với OD = 0.115 ➔ x = 114.2 µg/ml)
+ Với OD = 0.111 ➔ x = 110.2 µg/ml
112.2+114.2+110.2
Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: 𝑥̅ = = 112.2 µg/ml
3

 0.112 mg/ml.

❖ Protein có trong dịch thôi giải 3 (TG3)

Cách tính nồng độ protein có trong TG3 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị
OD vào phương trình 1 ta được:
+ Với OD = 0.139 ➔ x = 138.2 µg/ml
+ Với OD = 0.131 ➔ x = 130.2 µg/ml
+ Với OD = 0.129 ➔ x = 128.2 µg/ml
138.2+130.2+128.2
Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: 𝑥̅ = = 132.2 µg/ml
3

 0.132 mg/ml.

❖ Protein có trong dịch thôi giải 4 (TG4)

Cách tính nồng độ protein có trong TG4 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị
OD vào phương trình 1 ta được:
+ Với OD = 0.127 ➔ x = 126.2 µg/ml
+ Với OD = 0.127 ➔ x = 126.2 µg/ml
+ Với OD = 0.123 ➔ x = 122.2 µg/ml
126.2+126.2+122.2
Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: 𝑥̅ = = 125.2 µg/ml
3

 0.125 mg/ml.

❖ Protein có trong dịch thôi giải 5 (TG5)

Cách tính nồng độ protein có trong TG5 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị
OD vào phương trình 1 ta được:
+ Với OD = 0.099 ➔ x = 98.2 µg/ml
8
+ Với OD = 0.091 ➔ x = 90.2 µg/ml
+ Với OD = 0.091 ➔ x = 90.2 µg/ml
98.2+90.2+90.2
Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: 𝑥̅ = = 92.87 (µg/ml)
3

 0.093 mg/ml.

❖ Nồng độ protein trung bình có trong 5 phân đoạn thôi giải

𝑇𝐺1+𝑇𝐺2+𝑇𝐺3+𝑇𝐺4+𝑇𝐺5 118.87+112.2+132.2+125.2+92.87
[protein TB]thôi giải = = = 116.27µg/ml
5 5

 0.116 mg/ml.

Vậy trong 5 ml dịch thôi giải có [protein] = 0.016 x 5 = 0.58 mg

❖ Protein có trong dịch rửa (Flow-through)
Cách tính nồng độ protein có trong dịch rửa tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá
trị OD vào phương trình 1 ta được:
+ Với OD = 0.098 ➔ x = 97.2 (µg/ml)
+ Với OD = 0.090 ➔ x = 89.2 (µg/ml)
+ Với OD = 0.089 ➔ x = 88.2 (µg/ml)
97.2+89.2+88.2
Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: 𝑥̅ = = 91.53 (µg/ml)
3

Vì mẫu được pha loãng 30 lần trước khi đo OD, nên nồng độ protein thực sự có trong 1 ml
dịch rửa là: [protein]dịch rửa = 𝑥̅ × 30 = 2746 (µg/ml) = 2.746 (mg/ml).
Vậy trong 5 ml dịch rửa có [protein] = 2.746 x 5 = 13.73 mg
Hoạt tính enzyme

Dịch OD thử không - thử

OD thật
thử không - thử thật
Enzyme thô trước tủa 0.157 0.167 0.218
0.143 0.219
Pha loãng0.221
15 lần đo hoạt tính
Enzyme tủa cồn 0.118 0.119 0.148
0.121 0.149
Pha loãng0.141
50 lần đo hoạt tính
Enzyme tủa muối 0.226 0.225 0.216
0.226 0.215
Pha loãng0.216
50 lần đo hoạt tính

9
Công thức tính hoạt tính enzyme
𝐗 ×𝐊
(Công thức 1)
𝐭 ×𝐕
Trong đó :
X : Số mg tinh bột suy ra từ đường chuẩn.
v : Thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng enzyme
t : Thời gian enzyme phản ứng
K : Hệ số pha loãng
Giả sử thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng là 1 ml, thời gian phản ứng là 10 phút.
Dựa vào phương trình đường chuẩn của tinh bột: y = 0.0231x + 0.0073 (phương trình 2) với
R2 = 0.9812, ta lần lượt tính hoạt tính enzyme có trong:
❖ Enzyme trong dịch nuôi cấy (enzyme thô trước tủa)
Cách tính: Giá trị OD tương ứng với hệ số y trong phương trình 2. Từ đó ta suy ra được giá
trị x tương ứng với lượng tinh bột có trong mẫu thử. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, nên
lượng tinh bột có trong mẫu thử tương đương với giá trị trung bình của 3 lần lặp lại trên.
+ Với OD = 0.157 ➔ x = 6.481 mg
+ Với OD = 0.167 ➔ x = 6.913 mg
+ Với OD = 0.143 ➔ x = 5.874 mg
6.481+6.913+5.874
Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lặp lại: 𝑥̅ = = 6.423 mg
3

Vì mẫu enzyme thô được pha loãng 15 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính amylase
6.423 ×15
trong dịch nuôi cấy = = 9.635 U
10 ×1

❖ Enzyme tủa cồn

Cách tính hoạt tính enzyme trong mẫu sau khi tủa cồn tương tự như cách tính hoạt tính
enzyme có trong dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh
bột tương ứng sau:
+ Với OD = 0.118 ➔ x = 4.792 mg
+ Với OD = 0.119 ➔ x = 4.835 mg
+ Với OD = 0.121 ➔ x = 4.922 mg

10
 4.792+4.835+4.922
Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lặp lại: 𝑥̅ = = 4.850 mg
3

Vì mẫu enzyme sau tủa cồn được pha loãng 50 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính
4.850×50
enzyme sau tủa cồn = = 24.25 U
10 ×1

❖ Enzyme tủa muối

Cách tính hoạt tính enzyme trong mẫu sau tủa muối tương tự như cách tính hoạt tính enzyme
có trong dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương
ứng sau:
+ Với OD = 0.226 ➔ x = 9.468 mg
+ Với OD = 0.225 ➔ x = 9.424 mg
+ Với OD = 0.226 ➔ x = 9.468 mg
9.468+9.424+9.468
Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lặp lại: 𝑥̅ = = 9.453 mg
3

Vì mẫu enzyme sau tủa muối được pha loãng 50 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt
9.453×50
tính amylase sau tủa muối = = 47.265 U
10 ×1

Hoạt tính enzyme sau khi được tinh sạch bằng sắc ký ái lực

Dịch OD thử không - thử

OD thử
thậtkhông - thử thật
TG1 0.161 0.161 0.2180.1690.321
Pha loãng 0.221
30 lần đo hoạt tính
TG2 0.173 0.175 0.1930.1710.195
Pha loãng 0.191
20 lần đo hoạt tính
TG3 0.121 0.121 0.2540.1290.131
Pha loãng 0.129
10 lần đo hoạt tính
TG4 0.157 0.167 0.1570.1430.167
Pha loãng 0.143
5 lần đo hoạt tính
TG5 0.069 0.071 0.0690.0610.071 0.061
Dịch rửa (5 ml) 0.008 0.01 0.0080.009 0.01 0.009

❖ Hoạt tính amylase trong dịch thôi giải 1 (TG1)

Cách tính hoạt tính enzyme trong TG1 tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong
dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:
+ Với OD = 0.161 ➔ x = 6.654 mg
+ Với OD = 0.161 ➔ x = 6.654 mg
11
+ Với OD = 0.169 ➔ x = 7.0 mg
6.654+6.654+7.0
Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: 𝑥̅ = = 6.769 mg
3

Vì mẫu enzyme trong TG1 được pha loãng 30 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính
6.769×30
amylase trong TG1 = = 20.307 U
10 ×1

❖ Hoạt tính amylase trong dịch thôi giải 2 (TG2)

Cách tính hoạt tính enzyme trong TG2 tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong
dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:
+ Với OD = 0.173 ➔ x = 7.173 mg
+ Với OD = 0.175 ➔ x = 7.260 mg
+ Với OD = 0.171 ➔ x = 7.090 mg
7.173+7.260+7.090
Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: 𝑥̅ = = 7.174 mg
3

Vì mẫu enzyme trong TG1 được pha loãng 20 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính
7.171×20
amylase trong TG2 = = 14.384 U
10 ×1

❖ Hoạt tính amylase trong dịch thôi giải 3 (TG3)

Cách tính hoạt tính enzyme trong TG3 tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong
dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:
+ Với OD = 0.121 ➔ x = 4.922 mg
+ Với OD = 0.121 ➔ x = 4.922 mg
+ Với OD = 0.129 ➔ x = 5.268 mg
4.922+4.922+5.268
Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: 𝑥̅ = = 5.037 mg
3

Vì mẫu enzyme trong TG1 được pha loãng 10 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính
5.037×10
amylase trong TG3 = = 5.037 U
10 ×1

❖ Hoạt tính amylase trong dịch thôi giải 4 (TG4)

Cách tính hoạt tính enzyme trong TG4 tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong
dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:
+ Với OD = 0.157 ➔ x = 6.481 mg
+ Với OD = 0.167 ➔ x = 6.913 mg

12
+ Với OD = 0.143 ➔ x = 5.874 mg
6.481+6.913+5.874
Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: 𝑥̅ = = 6.422 mg
3

Vì mẫu enzyme trong TG1 được pha loãng 5 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính
6.422×5
amylase trong TG4 = = 3.211 U
10 ×1

❖ Hoạt tính amylase trong dịch thôi giải 5 (TG5)

Cách tính hoạt tính enzyme trong TG5 tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong
dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:
+ Với OD = 0.069 ➔ x = 2.671 mg
+ Với OD = 0.071 ➔ x = 2.758 mg
+ Với OD = 0.009 ➔ x = 0.074 mg
2.671+2.758+0.074
Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: 𝑥̅ = = 1.834 mg
3
1.834×1
Dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính amylase trong TG5 = = 0.183 U
10 ×1

𝑡ổ𝑛𝑔 ℎ𝑜ạ𝑡 𝑡í𝑛ℎ 𝑐ủ𝑎 5 𝑝ℎâ𝑛 đ𝑜ạ𝑛 𝑡ℎô𝑖 𝑔𝑖ả𝑖

Hoạt tính chung trong phân đoạn thôi giải =
5
20.307 + 14.384 + 5.037 + 3.211 + 0.183
=
5
= 8.624 U

❖ Hoạt tính amylase trong dịch rửa (Flow-through)

Cách tính hoạt tính enzyme trong dịch rửa tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong
dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:
+ Với OD = 0.008 ➔ x = 0.030 mg
+ Với OD = 0.01 ➔ x = 0.117 mg
+ Với OD = 0.009 ➔ x = 0.074 mg
0.030+0.117+0.074
Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lập lại: 𝑥̅ = = 0.074 mg
3
0.074×1
Dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính amylase trong dịch rửa = = 0.007 U
10 ×1

13
 Thể tích Nồng độ protein Hàm lượng protein Hoạt tính
Fraction
(ml) (mg/ml) (mg) enzyme (U)
Dịch enzyme thô 100 2.3774 237.4 9.635
Enzyme sau tủa
10 11.287 112.87 24.25
cồn
Enzyme sau tủa
10 10.72 107.2 47.265
muối
Enzyme thôi giải 5 0.58 0.116 8.624
Enzyme trong
5 13.73 2.746 0.007
dịch rửa

❖ Tính hoạt tính riêng

Tổng hoạt tính enzyme
Hoạt tính riêng =
Tổng hàm lượng protein
9.635
+ Hoạt tính riêng của dịch enzyme thô = = 0.04 U/mg
237.74
24.25
+ Hoạt tính riêng của enzyme sau tủa cồn = = 0.215 U/mg
112.87
47.265
+ Hoạt tính riêng của enzyme sau tủa muối = = 0.44 U/mg
107.2
8.624
+ Hoạt tính riêng của enzyme thôi giải = = 14.87 U/mg
0.58
0.007
+ Hoạt tính riêng của enzyme dịch rửa = = 0.0005 U/mg
13.73

❖ Tính độ tinh sạch

Hoạt tính riêng của enzyme sau tinh sạch
Độ tinh sạch =
Hoạt tính riêng ban đầu

+ Độ tinh sạch của enzyme thô = 1

0.215
+ Độ tinh sạch của enzyme sau tủa cồn = = 5.375
0.04
0.44
+ Độ tinh sạch của enzyme sau tủa muối = = 11
0.04
14.87
+ Độ tinh sạch của enzyme thôi giải = = 371.75
0.04
0.0005
+ Độ tinh sạch của enzyme dịch rửa = = 0.0125
0.04

14
 ❖ Tính hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme
Tổng hoạt tính enzyme có trong phân đoạn
Hiệu suất thu hồi hoạt tính = x 100
Tổng hoạt tính enzyme thô

+ Hiệu xuất thu hồi hoạt tính của enzyme thô = 100%
24.25
+ Hiệu xuất thu hồi hoạt tính enzyme sau phân đoạn tủa cồn = x 100 = 251.7%
9.635
47.265
+ Hiệu xuất thu hồi hoạt tính enzyme sau phân đoạn tủa muối = x 100 = 490.6%
9.635
8.624
+ Hiệu xuất thu hồi hoạt tính enzyme sau phân đoạn thôi giải = x 100 = 89.5%
9.635
0.007
+ Hiệu xuất thu hồi hoạt tính enzyme sau phân đoạn dịch rửa= x 100 = 0.07%
9.635

❖ Tính hiệu suất thu hồi protein

Tổng protein có trong phân đoạn
Hiệu suất thu hồi protein = x 100
Tổng protein trong dịch thô

+ Hiệu xuất thu hồi protein của dịch enzyme thô = 100%
112.87
+ Hiệu xuất thu hồi protein trong phân đoạn tủa cồn = x 100 = 47.47%
237.74
107.2
+ Hiệu xuất thu hồi protein trong phân đoạn tủa muối = x 100 = 45.1%
237.74
0.58
+ Hiệu xuất thu hồi protein trong phân đoạn thôi giải = x 100 = 0.24%
237.74
13.73
+ Hiệu xuất thu hồi protein trong phân đoạn dịch rửa = x 100 = 5.78%
237.74

4. Kết luận
Thể Nồng độ Hàm lượng Hoạt tính Hoạt tính Hiệu suất thu Hiệu suất Độ tinh
Fraction tích protein protein enzyme riêng hồi protein thu hồi hoạt sạch
(ml) (mg/ml) (mg) (U) (U/mg) (%) tính (%)
Dịch enzyme
100 2.3774 237.4 9.635 0.04 100 100 1
thô
Enzyme sau
10 11.287 112.87 24.25 0.215 47.47 251.7 5.375
tủa cồn
Enzyme sau
10 10.72 107.2 47.265 0.44 45.1 490.6 11
tủa muối
Enzyme thôi
5 0.58 0.116 8.624 14.87 0.24 89.5 371.75
giải
Enzyme
trong dịch 5 13.73 2.746 0.007 0.0005 5.78 0.07 0.0125
rửa

15
Từ những kết quả trên, ta có thể thấy được rằng hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme ở phân
đoạn sau khi tủa muối (đạt 490.6%) đạt cao nhất trong các phân đoạn khảo sát. Trong khi
đó, hiệu suất thu hồi protein ở trong hai phân đoạn tủa muối và cồn tương đương nhau, lần
lượt là 45.1% và 47.47%. Hoạt tính enzyme sau tủa cồn thấp hơn sau tủa muối có thể do sự
có mặt của dung môi hữu cơ (cồn) làm ảnh hưởng đến việc phục hồi hoạt tính sinh học hoặc
tác động lên cấu trúc bậc ba của enzyme làm chúng mất hoạt tính. Điểm đáng chú ý nữa là,
hoạt tính riêng của enzyme trong phân đoạn thôi giải đạt cao nhất trong các phân đoạn khảo
sát (14.86 U/mg), và độ tinh sạch của enzyme trong phân đoạn này gấp gần 372 lần so với
enzyme thô. Điều này chứng tỏ rằng, phân đoạn thôi giải cho enzyme có hoạt tính riêng và
độ tinh sạch cao.

Ngoài ra, đề xuất của nhóm em sau thí nghiệm này là nên khảo sát về nồng độ cồn trong
giai đoạn tủa enzyme. Thực hiện thêm thí nghiệm chạy SDS-PAGE để khẳng định chính
xác hoạt tính riêng cũng như hiệu suất thu hồi enzyme, protein tinh sạch hoàn toàn, không
lẫn các hợp chất khác.

16