Tinh chế enzyme amylase bằng alginate

Giới thiệu

Amylase là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân tinh bột. Ở người, enzyme được tiết từ tuyến
nước bọt.

Gồm 3 loại:

 α -amylase: enzyme có thể cắt ở bất cứ liên kết nào của cấu trúc tinh bột
 β -amylase: enzyme chỉ có thể cắt được liên kết của 2 đơn phân ở dạng đường đôi
 Glucose amylase: enzyme có thể cắt được liên kết 1,6-glycosid và đơn phân nhỏ nhất có
thể cắt được là glucose

Dễ dàng hơn ta có thể chia enzyme amylase thành 2 loại:

 Exo-glucanase: cắt ở đầu mạch

 Edo-glucanase: cắt ở giữa mạch

Enzyme amylase có ứng dụng quan trọng trong công nghiệp, thực phẩm, y học. Đối với y học,
amylase được dùng để sản xuất glucose làm dịch tiêm truyền, chuyển hóa tinh bột thành dextrin,
tinh bột tan làm tá dược sản xuất một số thuốc.

Trong bài thực tập này, chúng ta sẽ chiết enzyme amylase từ khoai lang. Ở đây lượng amylase
thô chứa rất nhiều thành phần gồm protein, lipid, carbohydrate và DNA. Mục tiêu của chúng ta
là protein amylase nên phải thực hiện bước tinh chế enzyme thô, xác định hàm lượng protein
bằng OD280 và hoạt tính enzyme bằng phương pháp Heinkel.

Quy trình

Vật liệu

 Khoai lang
 Cối, chày
 Máy li tâm – Máy đo UV/Vis
 Rây lọc
  Eppendorf và micropipet

 Dung dịch: đệm phosphat, sodium alginate 2%, CaCl2 0.7M, glucose 2%

Tiến hành

Thu enzyme thô

Lấy 30g khoai lang->cắt nhỏ->nghiền trong cối chày với 30ml dung dịch PBS -> Lấy 20ml dịch
trong cối đi li tâm->Lọc và thu được dịch lọc chứa enzyme thô.

Tinh chế enzyme thô

Lấy 10ml enzyme thô vào trong becher có sẵn sodium alginate 2% với tỉ lệ 1:3->Khuấy bằng
máy khuấy từ trong 1h->Cho vào becher 20ml CaCl2 0.7M, khuấy đều-> Li tâm và thu cắn->cho
20ml glucose 2% để ở 4oC trong 12 giờ-> li tâm ta thu được dịch chứa enzyme tinh.

Xác định hàm lượng protein bằng OD280

Lấy 1,5 ml lượng enzyme thô và 1,5 ml lượng enzyme tinh vào 2 eppendorf-> li tâm 10000
vòng/1 phút

 Với enzyme thô thì mình sẽ pha loãng bằng cách lấy 50 μlenzyme thô +950 μl nước cất
 Với enzyme tinh thì ta sẽ không pha loãng mà lấy 1000 μl enzyme tinh
 Đo độ hấp thu ở bức sóng 280nm

Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Heinkel

 Enzyme thô Enzyme tinh Đường chuẩn
Dung dịch ống ống ống ống 0 1 2 3 4 5
thử chứng thử chứng
Nước cất 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
Tinh bột 1% (mL) 0.1 0.1 0.1 0.1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Hút 0.1mL từ các ống sang
Eppendorf mới
Acid sulfosalicylic 0 0.5 0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
20%
Đệm phosphate 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
(mL)
Enzyme 0.1 0.1 0.1 0.1
Ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút
Acid sulfosalicylic 0.5 0 0.5 0
20%
Hút 0.1mL từ các ống sang Eppendorf mới
Thuốc thử iode 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9
Đo OD 560nm

Dùng dung dịch đệm phosphate làm ống trắng để chỉnh máy về 0.

Công thức hoạt tính enzyme.

HTE (U/ml) = (Achứng-Athử) / (A/mgStarch x 15 phút x 0.1 ml)

Hoạt tính chung của enzyme thô: HTCenzyme thô = HTE x N x Venzyme thô

Hoạt tính chung của enzyme tinh: HTCenzyme tinh = HTE x N x Vtinh chế (N: hệ số pha loãng của
enzyme).

Hoạt tính riêng của enzyme: HTR = HTC/lượng protein (U/A280nm)

Hiệu suất cố định: HS = HTCenzyme tinh/HTCenzyme thô

Mức tinh chế: HTRenzyme tinh/HTRenzyme thô

III.KẾT QUẢ.

1. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN BẰNG OD280.

Ta có:

ODthô = 0.209 Vthô = 15.8 mL

ODtinh = 0.464 Vtinh = 5 mL

Nthô (hệ số pha loãng của enzyme thô) = 20

Lượng protein trong enzyme thô:

A280nm (thô) = ODthô x N x V = 0.209 x 20 x 15.8 = 66.04 mg.

Lượng protein trong enzyme tinh:

A280nm (tinh) = ODtinh x N x V = 0.464 x 1 x 5= 2.32 mg.

2. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME BẰNG PHƯƠNG PHÁP HEINKEL

Mẫu OD560
Enzyme thô Ống thử 2.705
Ống chứng 3.074
Enzyme tinh Ống thử 2.764
Ống chứng 2.939
Bảng 1: Kết quả đo OD560 của ống thử và ống chứng từ enzyme thô và enzyme tinh

Ống Khối lượng tinh bột OD560

 0 0 1.956
1 2 2.172
2 4 2.328
3 6 2.566
4 8 2.805
5 10 3.051
Bảng 2: Kết quả đo mẫu OD560 để xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel

3.5

3
f(x) = 0.108742857142857 x + 1.93595238095238
R² = 0.995364742616003
2.5

2
OD 560nm

1.5

0.5

0
0 2 4 6 8 10 12
Tinh bột(mg)

Hình: Đồ thị biểu diễn đường chuẩn tính hoạt độ amylase

Theo đồ thị ta có, y = 0.1087x+1.936 -> A/mgStarch = 2.044

HTEthô = (Achứng-Athử) / (A/mgStarch x 15 phút x 0.1 ml) = (3.074 - 2.705) / (2.04 x 15 x 0.1) =
0.12 (U/ml)

HTEtinh = (Achứng-Athử) / (A/mgStarch x 15 phút x 0.1 ml) = (2.939- 2.764) / (2.04 x 15 x 0.1) =
0.05 (U/ml)

HTCenzyme thô = HTE x N x Venzyme thô=0.12 x 100 x 15,8 = 189.6

HTCenzyme tinh = HTE x N x Vtinh chế=0.05 x 10 x 5 = 2.5

HTRenzyme thô = HTCenzyme thô x N / lượng protein (U/A280nm) = 189.6 x 20/0.209 = 18143.54

HTRenzyme tinh = HTCenzyme tinh x N / lượng protein (U/A280nm) = 2.5 x 1/0.464 = 5.38

HS = HTCenzyme tinh / HTCenzyme thô = 2.5/189.6 = 0.013

MTC = HTRenzyme tinh / HTRenzyme thô = 5.38/18143.54= 2.96 x 10-4

BÀN LUẬN.
1. Thu enzyme thô.
Sau khi ly tâm, tế bào sẽ bị phá vỡ cấu trúc để thu phân tử enzyme nội bào
bằng phương pháp nghiền cơ học. Tiếp tục ly tâm lần nữa, enzyme sẽ hòa tan
vào trong phần dịch lỏng, sau đó thu được enzyme thô trong dịch lọc.
2. Tinh chế enzyme thô.
Mục đích sử dụng các chất như sau:
✓ Sodium alginate 2%: hấp phụ các phân tử protein.

✓ CaCl2: Tạo tủa với sodium alginate 2%, kéo theo các phân tử protein
bám lên tủa.
✓ Dung dịch Glucose 2%: có ái lực với enzyme lớn hơn ái lực của tủa đối
với enzyme nên khi cho glucose vào, enzyme sẽ được giải phóng vào
lớp dịch lọc ở trên.
Từ các chất trên chúng ta tinh chế để thu được enzyme tinh.

3. Xác định hàm lượng protein bằng OD280nm.

Ở ống thử, ban đầu không thêm acid sulfosalicylic, enzyme amylase sẽ không
bị bất hoạt nên tinh bột bị thủy phân một phần. Tinh bột tác dụng với dung
dịch Iode thông qua phản ứng tạo màu, dựa trên mức độ giảm cường độ màu,
ta xác định được số mg tinh bột bị thủy phân tương ứng.
Do đó, OD ở ống tinh sẽ thấp hơn ống thô do khả năng thủy phân tinh bột cao
hơn.
4.Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Heinkel.
Enzyme tinh chế được loại bỏ các tạp chất, còn emzyne thô vẫn chứa các tạp
chất nên hoạt tính của enzyme tinh chế sẽ cao hơn hoạt tính của enzyme thô.
Trong quá trình thực nghiệm, do các thao tác thí nghiệm, nên các số liệu khi
đo OD không được chính xác dẫn đến sai số trong phương trình đường chuẩn,
dẫn đến sai số trong khi tính hoạt tính.
V. KẾT LUẬN.
Từ kết quả và quá trình thí nghiệm trên, chúng em đã rút ra một số bài học để
khắc phục những lỗi nhỏ như sau:
✓ Trong quá trình pha ống thử và ống chứng của enzyme thô và enzyme
tinh, cần tập trung và cẩn thận để pha chính xác để tránh ra kết quả kém
chính xác khi đo OD.
✓ Trong quá trình pha giai mẫu xây dựng đường chuẩn cũng phải chính
xác để cho kết quả đường chuẩn với độ chuẩn xác cao hơn. Cần nắm rõ
thao tác thực hiện của máy đo quang phổ UV/Vis.