BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Bài 2: Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry

Họ và tên: Đào Thu Hiền - MSSV:      20201137

Lớp:          716633

I. Nguyên tắc xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry

Phương pháp Lowry dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa thuốc thử folin và protein. Trong
một phạm vi nhất định, nồng độ protein tỉ lệ thuận với cường độ màu của hỗn hợp phản
ứng. Xác định được mật độ quang của dung dịch protein với folin, dựa theo đồ thị được xây
dựng bằng dịch protein chuẩn với thuốc thử này, ta có thể dễ dàng tính được hàm lượng
protein của mẫu vật nghiên cứu.

Phương pháp này rất nhạy và chính xác, nó được sử dụng rộng dãi để xác định hàm lượng
protein có khả năng hòa tan.

Quá trình trải qua 2 giai đoạn:

 Giai đoạn 1: Phản ứng màu Biure 

Trong môi trường kiềm mạnh, phân tử protein ( chứa từ 2 liên kết peptide trở lên), liên kết
peptide sẽ phản ứng với CuSO 4 tạo thành phức có màu tím hoặc đỏ tím. Đây là phản ứng
đặc trưng của liên kết peptide, cường độ màu thay đổi phụ thuộc vào độ dài mạch liên kết
và dung dịch hấp bước sóng cực đại 540nm.

Protein  + Cu(OH)2 →     Phức Cu+ (Xanh Tím)

 Giai đoạn 2: Phản ứng với thuốc thử Folin

Thuốc thử Folin gồm phosphotungstate (H3PW12O40) và phosphomolybdate (H3Pmo12O40).

Phản ứng giữa Cu2+ trong axitamin thơm (Tyr, Trp) với dung dịch thuốc thử Folin trong
khoảng 20 – 30 phút tạo phức màu xanh lam. Dung dịch hấp thụ bước sóng cực đại 750nm.

  Cu+       +      Folin                   →                    Cu2+   +  {MO^x,W^y,x,y<6}        

 ( Có a.a mạch vòng)                   ( W+6,Mo+5)                                 (Xanh đậm)        

                                                        

 Định luật Lambert - Beer: 
Khi chiếu một chum sáng đơn sắc đi qua một môi trường vật chất thì
 cường độ của tia sáng ban đầu I0 sẽ giảm xuống là I 
A=OD=LƐC
   
 Trong đó
                   L: độ dày truyền ánh sáng (xét L=1cm) 
              Ɛ: hệ số hấp thụ phân tử 
              C: nồng độ dung dịch (mol/L) 
              A: độ hấp thụ quang 
 OD = f(C) có quan hệ tuyến tính trong 1 giới hạn đồ thị nhất định
Trên cơ sở đó ta xác định được lượng protein thông qua C 

II. Cách tiến hành

A. Phần 1: Xây dựng đường chuẩn

1. Hóa chất cần dùng

 Thuốc thử: Folin
 Hỗn hợp A: dung dịch Na2CO3 2% pha trong NaOH 0,1N
 Hỗn hợp B: dung dịch CuSO4.5H2O ( 0,5% pha trong dung dịch natri xitrat 1% hoặc
pha trong dung dịch kali-natri tartrat 1% ). Dung dịch pha trong natri xitrat sẽ bền
hơn pha trong kali-natri tartrat.
 Hỗn hợp C: hỗn hợp của hai dung dịch A và B pha theo tỷ lệ 50:1 trước khi dùng.

2. Tiến hành thí nghiệm

a. Mẫu thí nghiệm: Dung dịch albumin huyết thanh bò (BSA) gốc: 1mg/ml
Chuẩn bị 1 dãy ống falcon 15ml/ống nghiệm sạch như sau tạo dãy ống có nồng độ
BSA (Ci) (dãy ống 1)
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Dung dịch BSA gốc (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Nước cất (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Trộn đều bằng vortex thu được dãy ống BSA làm việc có nồng độ Ci
Thực hiện phản ứng (dãy ống 2)
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Dung dịch BSA Ci mg/ml 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
(ml) (lấy từ dãy ống 1)
Dung dịch C (ml) 3 3 3 3 3 3
Trộn đều để yên 10 phút
Dung dịch Folin (ml) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
Trộn đều bằng vortex, để yên 20-30 phút rồi đo độ hấp thụ tại bước sóng 750nm
(OD750nm) với mẫu đối sánh (mẫu kiểm chứng) là mẫu trong ống nghiệm số 7
Nồng độ BSA Ci (mg/ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
 OD750nm

b. Tiến hành
 Chuẩn bị một dãy gồm 6 ống nghiệm sạch

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Dung dịch BSA gốc (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Nước cất (ml) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0

 Lấy vào từng ống nghiệm (khô, sạch):

0,3ml dịch BSA đã pha ở trên và 3ml dung dịch C, trộn đều và để yên trong 10 phút

Cho tiếp 0,2ml Folin vào, trộn đều hỗn hợp bằng máy trộn Voltex và để hỗn hợp phản ứng
trong 20 phút.

Đo độ hấp thụ của dung dịch màu ở bước sóng 750nm với dung dịch đối sánh là mẫu trong
ống nghiệm 1.

B. Phân tích mẫu: 0,3g đậu phụ

1. Chuẩn bị dung dịch cần phân tích

Dùng ống đong xác định chính xác 20ml NaOH 0,1N và trong cốc dung tích 100ml.

Cân chính xác 0,3g mẫu, chuyển toàn bộ lượng mẫu vào cối, thêm 1-2 giọt NaOH 0,1N từ cốc
vào cối nghiền để làm ẩm.

Nghiền nhuyễn mẫu, chuyển toàn bộ lượng mẫu vào bình tam giác dung tích 100ml.

Tráng sạch chày, cối bằng lượng NaOH 0,1N còn lại trong  bình.

Đặt bình vào nồi đun cách thủy để chiết protein trong 15 phút.

Lẫy mẫu ra, làm nguội, trung hòa dịch mẫu (pH=7) bằng HCl 0,1N (dùng đũa thủy tinh chấm
dịch lên miếng giấy thử pH và so sánh với dải màu chuẩn).

Chuyển toàn bộ lượng mẫu sang bình địn mức 100ml, định mức bằng nước cất tới vạch.
Trộn đều.

Lọc trong, thu dịch lọc protein phân tích.

2. Tiến hành
 a. Mẫu thí nghiệm

Lấy vào ống nghiệm (khô, sạch):

 0,2ml dịch lọc protein và 2ml dung dịch C. Trộn đều và để yên trong 10 phút.
 Cho tiếp 0,2 ml Folin vào ống nghiệm, trộn đều bằng máy trộn Voltex và để yên phản
ứng trong 20 phút.
b. Mẫu kiểm chứng

Lấy vào ống nghiệm (khô, sạch):

 0,2ml H2O và 2ml dung dịch C. Trộn đều và để yên trong 10 phút.
 Cho tiếp 0,2 ml Folin vào ống nghiệm, trộn đều bằng máy trộn Voltex và để yên phản
ứng trong 20 phút
c. Đo độ hấp thụ ánh sáng

Đo độ hấp thụ của dd màu của các ống thí nghiệm ở bước sóng 750 nm, với dd đối sánh là
mẫu kiểm chứng. 

Sử dụng đường chuẩn protein để tinh hàm lượng protein nghiên cứu.

Đo 2 lần và ghi kết quả đo được vào bảng số liệu

III. Tính toán kết quả

 Phần 1:

Nồng độ BSA(mg/ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

OD 750nm 0 0,12 0,212 0,287 0,381 0,484

Đồ thị đường chuẩn protein

 Đườn g c h u ẩ n Al b u mi n e
0.6

0.5
f(x) = 0.468285714285714 x + 0.0131904761904761
0.4 R² = 0.99621463894625
OD 750nm

0.3

0.2

0.1

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Nồng độ protein (mg/ml)

 Phần 2:
a. OD mẫu kiểm chứng: 0,000
b. Hàm lượng protein trong mẫu đem phân tích:

Mẫu phân tích Y= OD 750nm y−0,0132

X= (mg/ml)
0,4683
1 0,233 0469
2 0,235 0,473
xTB= 0,471

Kết luận:

Cứ 1ml dd I có 0,471mg protein

100ml ddI có 47,1 mg protein

Trong 0,3g mẫu có 47,1 mg protein hay 0,0471g protein

0,0471
➙ % protein= x100% = 15,7%
0,3
Có nhiều bước có thể làm sai số như :
- Các ống nghiệm được sử dụng có thể chưa sạch hoàn toàn hóa chất của các lần sử
dụng trước. Việc trung hòa dung dịch cũng có thể gây sai số .
- Việc sử dụng pipet có thể sảy ra sai sót do : chưa thành thạo việc sử dụng hút và nhả dung
dịch => thể tích lấy ra ko chuẩn xác. Đầu pipet vào quá sâu, đầu côn có thể dịch các hóa
chất, gây sai lệch, cần thay đầu côn mới sau khi hút từng loại hóa chất và hạn chế cho pipet
vào quá sâu.
- Khi đo trong máy đo quang, nếu để cuvet không đúng chiều ánh sáng đi qua, đổ
tràn dung dịch, dùng tay cầm vào 2 mặt trong của cuvet mà không dùng giấy lau sạch 2 mặt
trong sẽ ảnh hưởng đến đường truyền của ánh sáng => sai số

IV. Những lưu ý khi làm thí nghiệm

1. Khi chuẩn bị dịch protein phân tích:

- Dùng NaOH để nghiền mẫu, chiết vì NaOH giúp phá vỡ cấu trúc màng tế bào( bằng
photpholipit)nhờ phản ứng este hóa,giải phóng toàn bộ protein
- Khi đun thì ổn định ở 70-80 độ🡺giúp tránh biến tính của protein, nếu nhiệt độ dưới 60 độ
C sẽ làm giả hiệu suất của protein.
- Trung hòa mẫu sau khi chiết bằng HCl vì phản ứng biure diễn ra( mạnh trong môi trường
kiềm, phụ thuộc vào pH)
+ pH ảnh hưởng tới phản ứng của thuốc thử Folin(pH=9-10)
+ pH=7 sẽ không thể phản ứng
+ pH của dung dịch đo cũng ảnh hưởng đến giá trị đo
+ đồ thị đường chuẩn  ở pH=7=> mẫu cũng ở  pH=7
+ đưa pH của dung dịch chiết cách xa điểm đẳng diện. Đa số Protein có pH ở vùng
kiềm

2 .Làm phản ứng tạo màu:

-dung dịch A:Na2CO3  2% pha trong NaOH   0,1N

-dung dịch B:  CuSO4.5H2O  0,5% pha trong dung dịch natri xitrat  1%

Bền vững hơn CuSO4.5H2O  0,5% pha trong dung dịch kali-natri xitrat  1%

-dung dịch C: hỗn hợp của A:B=50:1( mới pha)

Dung dịch A có Na2CO3, dùng làm dung dịch đệm duy trì pH, nếu không có Na2CO3 thì tiêu
chuẩn sẽ thay đổi

Dung dịch B làm Cu2+ kết tủa,hòa tan tốt hơn.

3. Đo độ hấp phụ

Mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng phải được tiến hành trong cùng 1 điều kiện, dùng cùng
1 máy đo quang , đo cùng lúc.

Do độ hấp thụ phụ thuộc vào C theo quan hệ tuyến tính trong một giới hạn nhất định nên
giá trị mật độ quay ngoài khoảng đường chuẩn nằm ngoài khoảng tuyến tính ➙ giảm nồng
độ bằng cách pha loãng dung dịch

-Độ nhạy của phản ứng phụ thuộc vào máy đo quang

-dung dịch phải trong (vì nếu đục sẽ có hạt lơ lửng) ➙ ánh sáng gặp hạt sẽ bị phản xạ, tán xạ
➙ I1 giảm ➙A tăng ➙ sai số ➙phải lọc hoặc li tâm
-phản ứng biure là phản ứng đặc trưng cho liên kết peptit với ion Cu2+; do có nguyên tử N
tạo liên kết phối trí với Cu2+tạp phức. Cu2+ oxi hóa các gốc an Tyr,Tryp=> Cu2+ có màu xanh
đặc trưng.

-Ánh sáng phải là đơn sắc, độ tan nhỏ nhất khi pH=pI

4. Phương pháp cần phải được thực hiện với albumin huyết thanh bò ( protein tinh khiết
( 99,999%) ) vì nếu không tinh khiết có thể trong đó còn có những chất có thể phản ứng
được với Cu2+ hay phản ứng với những chất có trong phương pháp, do vậy có thể ảnh hưởng
đến kết quả thí nghiệm. Mà albumin lại nằm ở vị trí giữa trong nhóm protein sẽ dễ xác định
và nhận thấy hơn.

V. Phạm vi áp dụng của phương pháp

• Phương pháp Lowry chỉ sử dụng để phân tích mẫu có chưa hàm lượng protein
thấp
và là protein hòa tan
• Phương pháp này cho kết quả chính xác khi xác định protein đã được tinh sạch.
Nếu trong mẫu có các thành phần khác như K+, Mg2+, NH4+, EDTA, Tris-HCl,
cacbohydrate và tác nhân khử có gây ảnh hưởng đến kết quả. Ngoài ra một khi đã
nhuộm, mẫu protein không thể được sử dụng cho các phương pháp xét nghiệm
khác.
• Cường độ màu của phản ứng cũng phụ thuộc nhiều vào loại protein