TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

TÊN SV: Trần Chí Kiên MSSV: 61800954 MS NHÓM: S4N8

Hồ Bảo Trâm 61801010 S4N8

Lê Hải Đăng 61800491 S4N8

Bài số: 10 Điểm:

Tên bài: Khảo sát hoạt tính protease
bromelain
Ngày TN: 16/10/2019

A. DỤNG CỤ - HÓA CHẤT

I. Dụng cụ:

Ống nghiệm 18 Giá ống nghiệm 1 Pipett bầu 5mL 2

Pipett bầu 2mL 2 Pipett bầu 1mL 2 Cốc 50mL 5

Phễu thủy tinh 3 Bóp cao su + Đầu tip 1 Bình định mức 50mL 1

Cối + chày sứ 1 Giấy lọc 7 tờ Máy so màu

Giấy cuộn

II. Hóa chất:

Dd Casein 2% pha trong đệm photphat pH 8 Dd TCA 5%

Thuốc thử Folin-Ciocalteu Dd đệm photphat pH 8

Dd Na2CO3 0.5M

B. THỰC HÀNH

I. Nguyên tắc:

Bromelin là một enzyme protease có nhiều trong trái thơm (dứa). Để khảo
sát hoạy tính của enzyme bromelin ta cho enzyme này thủy phân các cơ chất
protein như casein, hemoglobin, albumin...

Enzyme protease cắt mối liên kết peptide với sự tham gia của H2O tạo ra
các sản phẩm hòa tan trong Trichloroacetic acid (TCA)

RCO-NHR1 + H2O <===> RCOOH + R1NH2

 Trong đó R và R1 là gốc của acid amin và peptide. Protein và peptide sẽ bị
phân hủy thành peptide ngắn hơn và acid amin có thể hòa tan trong TCA.

Do các sản phẩm thủy phân ra có chứa tyrosin, ta tiến hành so sánh lượng
tyrosin tạo ra với lượng tyrosin chuẩn thông qua phản ứng tạo màu với thuốc thử
Folin nhờ vào độ hấp thu của phức màu. Biết rằng lượng protein bị phân giải tỷ lệ
thuận với lượng Tyrosin có trong dịch lọc. Từ đó tính được hoạt tính của enzyme.

II.Tiến hành

1. Chuẩn bị dung dịch Enzyme (E)

Cân 5 g thịt trái thơm, nghiền trong cối sứ với một ít nước, gạn dịch lọc, bã
trích ly thêm 2 lần nữa bằng đệm photphat pH 8, thu tất cả dich trong vào
bình định mức 50ml, định mức bằng đệm pH 8. Dung dịch (E) chỉ pha ngay
trước khi tiến hành thí nghiệm.
2. Xác định hoạt lực của enzyme:
- Chuẩn bị 6 ống nghiệm, đánh dấu 3 mẫu thí nghiệm, 3 mẫu trắng rồi thực
hiện theo bảng sau:

Thêm các chất vào theo thứ tự Mẫu thí nghiệm Mẫu trắng
Dung dịch casein 2% trong đệm
2 2
photphat (ml)
Để yên ở 30oC trong 5 phút
Dung dịch TCA 5% (ml) 0 5
Lắc kỹ
Dung dịch nước thơm có chứa
2 2
enzyme bromelin (E) (ml)
Lắc đều. Để yên ở 30oC trong 10 phút
Dung dịch TCA 5% (ml) 5 0
 Mẫu thí nghiệm (3 ống bên trái): Enzyme bromelain thủy phân casein

Mẫu trắng (3 ống bên phải): Casein được tủa hết với TCA

- Lắc đều mỗi ống và để yên trong khoảng 10 phút, đem lọc vào 6 ống
nghiệm sạch.
- Hút 1ml dịch vừa lọc trên cho vào 6 ống nghiệm sạch khác, thêm 5ml
dung dịch Na2CO3 0.5M và 1ml thuốc thử Folin, lắc kỹ.
- Để yên khoảng 10 phút, đem đo độ hấp thụ (mật độ quang) ở bước sóng
690nm.
- Tính giá trị độ hấp thu trung bình của mẫu thí nghiệm và mẫu trắng.
 Mẫu thí nghiệm ( 3 ống bên trái): Casein được thủy phân thành tyrosin, tyrosin tạo phức
màu với Folin.

Mẫu trắng ( 3 ống bên trái): Casein bị tủa hết, vì vậy phức màu nhạt hơn.

III. Kết quả

Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme trong 1 phút ở 30 oC phân
giải được 1 lượng protein ra sản phẩm tương đươngvới 1 µmol tỷosin

Đường chuẩn Tyrosin khi tạo phức với Folin

 OD (A) OD trung bình (A)
Mẫu thí OD1 0.331
nghiệm OD2 0.450 0.375
OD3 0.345
Mẫu trắng OD4 0.303
OD5 0.266 0.278
OD6 0.265

- Tính ∆OD:
∆OD = ODtb mẫu thí nghiệm – ODtb mẫu trắng = 0.375 – 0278 = 0.097 (A)

- Tính số đơn vị hoạt độ của 1 ml dung dịch E (số đơn vị hoạt độ /ml dịch E)

y+ 0.0048 7 9 1 0.097+0.0048
X = 1.0114 x 1 x 2 x 10 = 1.0114
= 0.1007 (IU/ml)

- Tính hoạt độ proteolic của chế phẩm (số đơn vị hoạt độ / g thơm)

VĐM 50
Y = X x M thơm = 0.1007 x 5 = 1.007 (IU/g)

IV. Bàn luận

Như vậy, với nhiệt độ 30oC, đệm photphat pH 8, enzyme bromelain thủy giải 2ml
casein trong 10 phút có hoạt tính là 1.007 (IU/g)
Phuong pháp xác định hoạt tính của bromelain này đơn giản dễ thực hiện và ít tốn
kém.
Giống như các loại enzyme khác, enzyme bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các
yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại,
phương pháp trích ly, phương pháp tinh sạch,...
Ngày nay, enzyme bromelain được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như công
nghiệp, thực phẩm, y dược,...