Phần II.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu
a) Thiết bị
Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản
mỏng tráng sẵn silica gel (Merck, Đức) DC-
Alufolien 60 GF254 có độ dày 0,2 mm trên nền
nhôm.
Sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh (FC) và
sắc ký cột tinh chế (Mini-C) được thực hiện trên
silica gel (Merck, Đức), cỡ hạt 63-200, 63-100 và
40-63 (μm).
Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS) được ghi
trên thiết bị AutoSpec Premier, Waters, USA -
khoa Hóa học, trường đại học khoa học tự nhiên-
Đại học quốc gia Hà Nội. Phổ khối lượng phun mù
điện tử (ESI-MS) được ghi trên đo trên hệ thống
Aglient 1200 series LC-MSD ion trap hoặc hệ
thống sắc ký lỏng khối phổ LC-ESI/MS/MS-Xevo-
TQ của viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt
Nam; hệ thống Aglient 1260 series HPLC-MS của
khoa Y dược- Đại học Quốc gia Hà Nội.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR,
500 MHz), phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-
13 (13C-NMR, 125 MHz) với chương trình DEPT và
phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR)
được ghi trên thiết bị Bruker AV 500
spectrometer. Độ chuyển dịch hóa học (δ) được
biểu thị theo ppm. Tetrametylsilan (TMS) là chất
chuẩn nội zero (ppm) - Viện hóa học, viện Hàn lâm
Khoa học và công nghệ Việt Nam.
.Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích
Precisa 262SMA-FR, cân xác định độ ẩm Precisa
HA60- Viện Dược liệu
Máy UV-VIS 1800 dải đo 190nm-800nm, hãng
Shimadzu - Viện Dược liệu

b) Hóa chất, dung môi, dụng cụ

- Các dung môi dùng để định tính, chiết xuất và
phân lập: ete dầu hỏa, n-hexan, điclometan (DCM,
CH2Cl2), clorofom (CHCl3), etyl axetat (EtOAc),
axeton, metanol (CH3OH, MeOH), n-butanol,
etanol (EtOH) Trung Quốc hoặc công nghiệp, được
tinh chế lại.
- Hóa chất pha thuốc thử, triển khai sắc ký lớp
mỏng:H2SO4, FeCl3, acid acetic, acid formic,
ethylacetat các hóa chất cần thiết khác.
- Dụng cụ: Các loại dụng cụ phòng thí nghiệm như:
cồn kế, bình cầu, bình nón, ống nghiệm, pipet,
ống đong, nồi cất tinh dầu, các dụng cụ cần thiết
khác,...
c) Nguyên liệu thực vật
Cây Thủy Liễu (Polygonum odoratum Lour)
- Nguyên liệu:Toàn cây Rau răm còn tươi
- Nơi thu hái: Huyện Vũ Thư - Thái Bình
- Thời điểm: tháng 2 năm 2022
- Người thu mẫu: Đỗ Thị Thúy Ngân
- Người giám định tên khoa học:
- Tên bản lưu

2.2 Phương pháp thực nghiệm

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật học

a) Khảo sát hình thái
Quan sát đặc điểm hình thái của toàn cây Rau răm
tươi và mô tả bộ phận dùng bên ngoài của dược
liệu như màu sắc, kích thước, hình dáng,...
Làm tiêu bản mẫu khô theo phương pháp làm tiêu
bản cây khô.
b) Khảo sát vi phẫu
Chọn mẫu có tính đại diện, không quá già cũng
không quá non.
Cắt mẫu làm tiêu bản:
Tiêu bản vi phẫu thân được cắt ngang ở đoạn
thân.
Tiêu bản vi phẫu cuống lá được cắt ngang ở đoạn
giữa từ thân đến lá.
Tiêu bản vi phẫu lá được cắt ngang ở vị trí gân lá
trưởng thành.
Xử lý lát cắt: chọn những lát cắt mỏng, nguyên
vẹn,không vỡ nát, đem nhuộm và làm tiêu bản vi
phẫu theo quy trình chuẩn.
Quan sát, mô tả và chụp ảnh: quan sát các đặc
điểm vi phẫu, chụp ảnh
bằng hiển vi có gắn camera
 c)Đặc điểm bột dược liệu
Mẫu nghiên cứu được sấy khô, nghiền thành bột,
rây qua rây cỡ 32 ( rây mịn)
Quan sát trực tiếp, nếm, ngửi, xác định màu, mùi,
vị.
Làm tiêu bản bột dược liệu bằng phương pháp
giọt ép (Lấy một lượng nhỏ bột dược liệu khoảng
bằng đầu tăm cho lên phiến kính rồi nhỏ 1 giọt
nước ,trộn đều rồi đậy lamen lại và đem đi soi),
quan sát, mô tả và chụp ảnh những đặc điểm điển
hình của bột trên nền kính hiển vi có gắn camera.
Ảnh các đặc điểm bột được đưa vào máy tính sau
đó ghép thành ảnh hoàn chỉnh

2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

2.2.2.1 Phương pháp định tính

2.5.1. Định tính
 Định tính Flavonoid
Cân khoảng 5 g dược liệu cho vào bình nón dung
tích 100 ml, thêm 50ml cồn 90°. Đun cách thuỷ 10
phút, lọc nóng, dùng dịch lọc làm các phản ứng
sau:
- Phản ứng với kiềm.
Chẩm dịch chiết lên giấy lọc, hơ khô, để trên
miệng lọ Amoniac đặc mở nút thấy màu vàng của
vết chấm đậm lên
Cho vào ống nghiệm nhỏ Iml dịch chiết, thêm
5giọt NaOH 10%, thấy xuấ thiện tủa màu vàng
- Phản ứng Cyanidin:
Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 1ml dịch
chiết,thêm một ít bột Mg kimloại và vài giọt HCl
đặc. Sau vài phút; màu dịchchiết chuyển từ vàng
sanghồng. (Phản ứng dương tính).
- Phản ứng với Pells: Cho 1 ml dịch chiết
vào ốngnghiệm, thêm 3 giọtFeCl3 5% thấy
màu dịch chiết chuyển từ xanh nhạtsang
xanh đen. (Phảnứng dương tính).
Nhận xét: Dược liệu có flavonoid
 Định tính Glycosid tim:
Cho vào bình nón l00ml khoảng 10g bột
dược40ml cồn 25°, ngâm24 giờ, lọc lấy dịch chiết.
Loại tạp bằng Chì acetat30% dư, lọc bỏ tủa.
Dịchlọc cho vào bình gan, lắc với Cloroform 2 lần,
mỗilần 10 ml. Lấy dịch chiếtCloroform. Chia đều
dịch chiết vào 4 ống nghiệmnhỏ, bốc hơi trên nồi
cáchthuỷ đến khô để làm các phản ứng sau:
- Phản ứng Libermann:
Hoà tan cắn bằng 1 ml Anhydrid acetic, lắc
đều.Đặt ống nghiệmnghiêng 45°, thêm từ từ 1 ml
H2SO4 đặc, chảynhẹ dọc theo thành ống
nghiệmđể có phần lớfp. Mặt tiếp xúc giữa 2 lớp
chất lỏngkhông xuất hiện vòng tímđỏ. (Phản ứng
âm tính).
- Phản ứng Baljet:
Hoà tan cắn bằng một ít Ethanol 90°, lắcỹ cho
tanhết cắn. Thêmthuốc thử Baljet mới pha (acid
Picric 1% : NaOH10% tỷ lệ 1:9), không thấyxuất
hiện màu vàng da cam. (Phản ứng âm tính)
- Phản ứng Legah:
Hoà tan cắn bằng 1 ml Ethanol 90°. Thêm một
giọtthuốc thử Natrinitroprusiat 0,5% và 2 giọt
dung dịch NaOH 10%,không thấy xuất hiện
màuđỏ. (Phản ứng âm tính).
- Phản ứng với thuốc thử Xanthydrol:
Hoà tan cân bằng 1 ml et 90°. Thêm vài giọt
thuốcthử Xanthydrol mớipha, không thấy xuất
hiện màu đỏ gạch. (Phản ứngâm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có Glycosid tim.
 Định tính đường khử
Cho vào ống nghiệm khoảng 2 ml dịch chiết
nướcdược liệu, thêm 0,5ml dung dịch thuốc thử
Fehling A và 0,5 ml thuốcthử Fehling B. Đun
cáchthuỷ vài phút không thấy xuất hiện màu đỏ
gạch.(Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có đường khử.
 Định tính Alcaloid:
Cho vào bình nút mài dung tích 100 ml khoảbột
dược liệu, thẩm ẩm bằng NH4OH 6N, sau 10 phút
cho thêm 40 mlCloroform, đậy kín ngâm 24
giờ.Cho dịch chiết Cloroform vào bình gạn lắc với
10ml H2SO 4 IN. Chia dịch chiếtacid vào 3 ống
nghiệm nhỏ (mỗi ổng 1ml).
 Ống nghiệm 1: Thêm 2-3 giọt thuốc
thửDragendorff, không thấy xuất hiệntủa da cam.
(Phản ứng âm tính).
Ống nghiệm 2: Thêm 2-3 giọt thuốc thử
Mayerkhông thấy xuất hiện tủatrắng. (Phản ứng
âm tính).
Ổng nghiệm 3:Thêm 2-3 giọt thuốc
thửBouchardat, không thấy xuất hiệntủa màu
nâu. (Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có Alcaloid.
 Định tính Coumarin:
Cần khoảng 5 g dược liệu cho vào bình nón dung
tích 100 ml, thêm 50ml cồn 90°. Đun cách thuỷ 10
phút, lọc nóng,dùngdịch lọc làm các phản ứng
sau:
- Phản ứng Diazo hoá:
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm 2
ml Na2CO3 2%. Đun cách thuỷ đến sôi. Để nguội,
thêm 2 giọt thuốc thử Diazo, không thấy xuất hiện
màu đỏ. (Phản ứng âm tính).
- Phản ứng mở vòng lacton:
Cho dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ, mỗi ổng
1ml.
Ổng 1: Thêm 0,5 ml NaOH 10%
Ống 2: Để nguyên
Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội, quan sát
thấy cả 2 ống đều trong. (Phản ứng âm tính).
Sau đó cho thêm vào mỗi ống 2 ml nước sôi, lắc
đều, quan sát thấy cả 2 ống đều trong. (Phản ứng
âm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có Coumarin.
 Định tính Tanin:
Cho vào ống nghiệm to 1 g bột dược liệu và 10
mlnước. Đun cáchthuỷ sôi 5 phút. Lọc nóng qua
giấy lọc lấy dịchlàm phản ứng sau:
- Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch lọc và vài
giọt dungdịch Gelatin 1%, khôngthấy xuất
hiện tủa bông trắng. (Phản ứng âm tính).
- Cho vào ống nghiệm 1ml dịch lọc và vài
giọtdung dịch thuốc thử PeCls 5%thấy
xuất hiện tủa xanh đen. (Phản ứng
dươngtính).
 - Cho vào ống nghiệm 1mlo dịch lọc và vài
giọtdung dịch thuốc thử Chì acetat10%
không thấy xuất hiện tủa bông. (Phản ứng
âmtính).
Nhận xét: Dược liệu không có Tanin.
 Định tính acid hữu cơ.
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết nước
vàvài tinh thể Na2CH3 , khôngthấy xuất hiện bọt
khí bay lên. (Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Dược liệu khôftư có acid hữu cơ.
> Định tính saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt:
Cho vào ống nghiệm to 5 ml dịch chiết nước,
lắcmạnh dọc theo thành ốngnghiệm 5 phút, quan
sát thấy không xuất hiện nhiều bọt và bọt cũng
không bền sau 15 phút. (Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có saponin
 Định tỉnh Anthraglycosid.
Lấy khoảng 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm
to, thêm 10 ml nước cất, đun sôi 10 phút, để
nguội, lọc, lấy dịch lọc đem làm phản ứng
Bomtrager:
Lấy 1 ml dịch lọc + 1 ml dung dịch NaOH
10%,không thấy xuất hiện màu hồng. (Phản ứng
âm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có Anthraglycosid.
 Định tính chất béo
Lấy khoảng 5 g dược liệu cho vào bình nón có nút
mài dung tích 50 ml,đổ ngập ether dầu hoá, đun
cách thuỷ 15 phút, lọc lấy dịch lọc để làm phản
ứng. Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên miếng giấy lọc, hơ
nóng cho bay hết hơi dung môi, thấy để lại vết mờ
trên giấy lọc. (Phản ứng dương tính)
Nhận xét: Dược liệu có chất béo.
 Định tính Caroten:
Cho vào ống nghiệm to 2 ml dịch chiết ether dầu
hoả, bốc hơi trên nồi cách thuỷ đến cắn, thêm vài
giọt H2SO4 đặc vào cắn, không thấy dịch lọc
chuyên màu xanh. (Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có Caroten.
  Định tính Sterol:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ether dầu
hoá, bốc hơi trên nồi cách thuỷ đến cắn. Thêm
vào ống nghiệm 1 ml anhydric acetic, lắc kỹ cho
tan hết cắn. Để ổng nghiệm nghiêng 45°, thêm từ
từ 1ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm, không
thấy mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng có màu
xanh. (Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có Sterol.
 Đinh tính acid Amin:
Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết nước,
thêm 3 giọt thuốc thử Nihydrin 3%. Đun cách thuỷ
5-10 phút không thấy xuất hiện màu xanh tím.
(Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có acidAmin.
2.5.2. Chiết xuất tinh dầu:
 Quy trình chiết xuất tinh dầu trong trong
dược liệu.
-Nguyên tắc: Tinh dầu được tách ra khỏi dược
liệubằng phương pháp cắt kéohơi nước. Sử dụng
dụng cụ chia vạch để đọc đượcthể tích tinh dầu
sau khi cất.
- Nguyên liệu: cây Rau răm tươi.
- Dụng cụ: Nồi cất tinh dầu thủ công dung tích 5
lít,ống sinh hàn, bình gạn hứng tinh dầu, ống hứng
tinh dầu.Bộ nồi cất
(Hình 2,3. Sơ đồ nồi cất tinh dầu thủ công)
- Phương pháp tiến hành:
Cân tổng cộng 3,2 kg dược liệu tươi đã được
chianhỏ thích hợp, chialàm 3 lần để cất kéo hơi
nước. Cho dược liệu vàonồi cất tinh dầu dung tích
5lít. Thêm nước ngang bề mặt dược liệu. Lặp
dụngcụ.
Đun trực tiếp qua bếp điện trong 6 giờ. Sau 6
giờ,ngừng cất, tháo dỡ dụng cụ.
Lấy tinh dầu ra. Thể tích tinh dầu thu được ...ml
- Tính chất tinh dầu:
Tinh dầu thu được có màu vàng rơm, lỏng, sánh,
mùithơm hắc.Tỷ trọng tinh dầu nhỏ hơn 1 (d<l).
 Định lượng tinh dầu trong dược liệu
2.2.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất
2.2.1. Phương pháp sắc ký
Sắc ký (Chromatography) là phương pháp phân
tách các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của
chúng giữa hai pha động và tĩnh. Có nhiều nguyên
nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất,
nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ -
giải hấp phụ của các chất khi dòng pha động
chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu
của việc tách sắc ký [3].
Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Tính chất hấp phụ của hệ sắc ký lớp mỏng (sắc ký
bản mỏng, TLC, SKLM),
đặc trưng bằng độ linh động Rf : Rf được xác định
bằng phương trình:
Rf =a/b
a: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết
mẫu thử (cm)
b: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung
môi đo trên cùng đường đi của vết (cm)
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l
Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng rộng
rãi trong các ngành hoá học, sinh học, hoá dược
với nhiều mục đích khác nhau do các đặc tính ưu
việt của nó: độ nhạy cao, lượng mẫu phân tích
nhỏ (thường từ 1 đến 100 x10ˉ6 g), tốc độ phân
tích nhanh, dễ thực hiện. Phương pháp TLC với
chất hấp phụ silica gel được dùng để phân tích
định tính hay định lượng hoặc kiểm tra độ tinh
khiết của các hợp chất cũng như hỗ trợ cho các
phương pháp sắc ký cột để kiểm soát điều kiện
phân tách
Phương pháp sắc ký cột
Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng
lực của dung môi trên pha tĩnh theo cơ chế hấp
phụ và được sử dụng để phân tách các phần chiết,
phân lập và tinh chế các hợp chất. Sắc ký cột
nhanh (FC) được thực hiện dưới áp lực không khí
nén để dung môi rửa giải đi qua cột nhanh hơn.
Cột sắc ký là những ống thủy tinh đường kính d =
0,5-5 cm và có độ dài l = 20-100 cm nạp đầy chất
hấp phụ và pha động. Pha tĩnh rắn thường dùng
là: silica gel, nhôm oxit, chất hấp phụ biến tính.
(Hình ảnh)
2.2.2. Phương pháp kết tinh lại
Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên sự khác
nhau về độ tan của hợp chất mục tiêu và của tạp
chất trong dung môi hoặc một hệ dung môi đã
chọn. Phương pháp này được sử dụng để tách và
làm sạch chất rắn.

2.2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

2.3.1. Phổ khối lượng (MS)
Mỗi hợp chất hữu cơ có phân tử lượng xác định,
khi dùng năng lượng bẻ gẫy phân tử sẽ cho phổ
khối là tập hợp nhiều mảnh có tỷ số khối m/z xác
định đặc trưng cho các hợp chất hữu cơ. Vì vậy,
phổ khối là một trong những kỹ thuật phân tích
cấu trúc và sử dụng để định tính mang tính khẳng
định. Có thể so sánh phổ khối của hợp chất hữu
cơ với phổ chuẩn trong thư viện hoặc đo song
song với 1 mẫu chuẩn.
Phổ khối sử dụng kỹ thuật ion hóa và bẻ gãy phân
tử bằng va chạm điện tử (EI-MS) hoặc bằng phun
điện tử (ESI-MS) kết hợp đo thời gian bay qua tứ
cực Quadrupole/Time of Flight (Q/TOF).
Kết hợp sắc ký lỏng với detector khối phổ (LC-MS)
cho phép phân tích định tính nhiều hợp chất hữu
cơ một cách thuận lợi. Sử dụng kỹ thuật phun
điện tử (ESI) hoặc ion hóa bằng hóa học ở áp suất
thường (APCI). Cũng thường được sử dụng phân
tích định tính nhiều hợp chất tự nhiên. Thời gian
lưu trên sắc ký đồ và các mảnh khối đặc trưng
trên phổ đồ là đặc trưng cho mỗi chất. Kỹ thuật có
độ nhạy và đặc hiệu cao.
2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phương pháp phổ NMR nghiên cứu cấu trúc phân
tử bằng sự tương tác của bức xạ điện từ tần số
radio với tập hợp hạt nhân được đặt trong từ
trường mạnh. Các hạt nhân này là một phần
nguyên tử và các nguyên tử lại được tập hợp lại
thành phân tử. Do đó phổ NMR là phương pháp
hữu hiệu có thể cung cấp thông tin chi tiết về cấu
trúc phân tử.
Phổ cộng hưởng từ proton 1H-NMR (500 MHz) và
phổ cộng hưởng từ cacbon13C-NMR (125 MHz),
DEPT 90, DEPT 135 cho biết số nguyên tử hidro và
số nguyên tử cacbon (CH, CH2, CH3 và C)... Các
phổ 2 chiều: phổ COSY, HSQC, HMBC... cho biết
các cấu trúc không gian, dị tố...Từ các thông tin
cộng hưởng từ, phân tích bằng nhiều kỹ thuật, kết
hợp với các phương pháp mô phỏng (phần mềm),
có thể dựng lại cấu trúc khung phân tử hữu cơ
một cách chính xác.
Ngoài hai phương pháp trên, luận án còn sử dụng
phương pháp xác định năng suất quay cực, điểm
nóng chảy để dự đoán cấu trúc của các chất quen
thuộc đã được công bố. Mỗi một chất thường có
năng suất quay cực và điểm chảy xác định, do đó2
chỉ tiêu này thường được sử dụng để định tính.
Ngoài ra, năng suất quay cực và điểm chảy cũng
cho biết độ tinh khiết của hợp chất hữu cơ. Điểm
chảy càng gọn và càng gần với giá trị ấn định, hợp
chất càng tinh khiết.

2.2.2.4 Định tính định lượng một số hợp chất

tinh khiết
2. Phương pháp nghiên cứu

2.1. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CÁC CHẤT TỪ NGUYÊN

LIỆU THỰC VẬT
Chiết là phương pháp chuyển một chất ở trạng
thái hòa tan hay huyền phù từ pha lỏng (hoặc rắn)
này sang pha lỏng khác. Cơ sở vật lí của phương
pháp này là dựa vào định luật phân bố Nernst. Có
nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi
thực vật. Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương
pháp chính là chiết lỏng –lỏng và chiết rắn – lỏng
[3].
Nguyên liệu mẫu thực vật được chiết với EtOH
90% ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết EtOH 90% được
phân bố giữa H2O và các dung môi hữu cơ khác
nhau n-hexan, etyl axetat, n-butanol nhằm làm
giàu các lớp chất theo độ phân cực tăng dần.
2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ PHÂN TÁCH
2.2.1. Phương pháp sắc ký
Sắc ký (Chromatography) là phương pháp phân
tách các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của
chúng giữa hai pha động và tĩnh. Có nhiều nguyên
nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất,
nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ -
giải hấp phụ của các chất khi dòng pha động
chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu
của việc tách sắc ký [3].
Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Tính chất hấp phụ của hệ sắc ký lớp mỏng (sắc ký
bản mỏng, TLC, SKLM),
đặc trưng bằng độ linh động Rf : Rf được xác định
bằng phương trình:
Rf =a/b
a: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết
mẫu thử (cm)
b: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung
môi đo trên cùng đường đi của vết (cm)
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l
Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng rộng
rãi trong các ngành hoá học, sinh học, hoá dược
với nhiều mục đích khác nhau do các đặc tính ưu
việt của nó: độ nhạy cao, lượng mẫu phân tích
nhỏ (thường từ 1 đến 100 x10ˉ6 g), tốc độ phân
tích nhanh, dễ thực hiện. Phương pháp TLC với
chất hấp phụ silica gel được dùng để phân tích
định tính hay định lượng hoặc kiểm tra độ tinh
khiết của các hợp chất cũng như hỗ trợ cho các
phương pháp sắc ký cột để kiểm soát điều kiện
phân tách
Phương pháp sắc ký cột
Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng
lực của dung môi trên pha tĩnh theo cơ chế hấp
phụ và được sử dụng để phân tách các phần chiết,
phân lập và tinh chế các hợp chất. Sắc ký cột
nhanh (FC) được thực hiện dưới áp lực không khí
nén để dung môi rửa giải đi qua cột nhanh hơn.
Cột sắc ký là những ống thủy tinh đường kính d =
0,5-5 cm và có độ dài l = 20-100 cm nạp đầy chất
hấp phụ và pha động. Pha tĩnh rắn thường dùng
là: silica gel, nhôm oxit, chất hấp phụ biến tính.
(Hình ảnh)

2.2.2. Phương pháp kết tinh lại

Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên sự khác
nhau về độ tan của hợp chất mục tiêu và của tạp
chất trong dung môi hoặc một hệ dung môi đã
chọn. Phương pháp này được sử dụng để tách và
làm sạch chất rắn.
2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT CẤU TRÚC
HỢP CHẤT HỮU CƠ
Hiện nay, các phương pháp phổ là công cụ hiện
đại và hữu hiệu nhất để xác định cấu trúc của các
hợp chất hữu cơ. Các phương pháp phổ được sử
dụng để xác định cấu trúc các hợp chất trong luận
án bao gồm: phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ
hạt nhân [10], [11].
c
2.5. Định tính, định lượng một số hợp chất tinh
khiết.
2.5.1. Định tính
 Định tính Flavonoid
Cần khoảng 5 g dược liệu cho vào bình nón dung
tích 100 ml, thêm 50ml cồn 90°. Đun cách thuỷ 10
phút, lọc nóng, dùngdịch lọc làm các phản ứng
sau:
- Phản ứng với kiềm.
Chẩm dịch chiết lên giấy lọc, hơ khô, để trên
miệnglọ Amoniac đặc mởnút thấy màu vàng của
vết chấm đậm lên. (Phảnứng dương tính).
Cho vào ống nghiệm nhỏ Iml dịch chiết, thêm
5giọt NaOH 10%, thấy xuấthiện tủa màu vàng.
(Phản ứng dương tính).
- Phản ứng Cyanidin:
Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 1ml dịch
chiết,thêm một ít bột Mg kimloại và vài giọt HCl
đặc. Sau vài phút; màu dịchchiết chuyển từ vàng
sanghồng. (Phản ứng dương tính).
- Phản ứng với Pells: Cho 1 ml dịch chiết
vào ốngnghiệm, thêm 3 giọtFeCl3 5% thấy
 màu dịch chiết chuyển từ xanh nhạtsang
xanh đen. (Phảnứng dương tính).
Nhận xét: Dược liệu có flavonoid
 Định tính Glycosid tim:
Cho vào bình nón l00ml khoảng 10g bột
dược40ml cồn 25°, ngâm24 giờ, lọc lấy dịch chiết.
Loại tạp bằng Chì acetat30% dư, lọc bỏ tủa.
Dịchlọc cho vào bình gan, lắc với Cloroform 2 lần,
mỗilần 10 ml. Lấy dịch chiếtCloroform. Chia đều
dịch chiết vào 4 ống nghiệmnhỏ, bốc hơi trên nồi
cáchthuỷ đến khô để làm các phản ứng sau:
- Phản ứng Libermann:
Hoà tan cắn bằng 1 ml Anhydrid acetic, lắc
đều.Đặt ống nghiệmnghiêng 45°, thêm từ từ 1 ml
H2SO4 đặc, chảynhẹ dọc theo thành ống
nghiệmđể có phần lớfp. Mặt tiếp xúc giữa 2 lớp
chất lỏngkhông xuất hiện vòng tímđỏ. (Phản ứng
âm tính).
- Phản ứng Baljet:
Hoà tan cắn bằng một ít Ethanol 90°, lắcỹ cho
tanhết cắn. Thêmthuốc thử Baljet mới pha (acid
Picric 1% : NaOH10% tỷ lệ 1:9), không thấyxuất
hiện màu vàng da cam. (Phản ứng âm tính)
- Phản ứng Legah:
Hoà tan cắn bằng 1 ml Ethanol 90°. Thêm một
giọtthuốc thử Natrinitroprusiat 0,5% và 2 giọt
dung dịch NaOH 10%,không thấy xuất hiện
màuđỏ. (Phản ứng âm tính).
- Phản ứng với thuốc thử Xanthydrol:
Hoà tan cân bằng 1 ml et 90°. Thêm vài giọt
thuốcthử Xanthydrol mớipha, không thấy xuất
hiện màu đỏ gạch. (Phản ứngâm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có Glycosid tim.
 Định tính đường khử
Cho vào ống nghiệm khoảng 2 ml dịch chiết
nướcdược liệu, thêm 0,5ml dung dịch thuốc thử
Fehling A và 0,5 ml thuốcthử Fehling B. Đun
cáchthuỷ vài phút không thấy xuất hiện màu đỏ
gạch.(Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có đường khử.
 Định tính Alcaloid:
Cho vào bình nút mài dung tích 100 ml khoảbột
dược liệu, thẩm ẩm bằng NH4OH 6N, sau 10 phút
cho thêm 40 mlCloroform, đậy kín ngâm 24
giờ.Cho dịch chiết Cloroform vào bình gạn lắc với
10ml H2SO 4 IN. Chia dịch chiếtacid vào 3 ống
nghiệm nhỏ (mỗi ổng 1ml).
Ống nghiệm 1: Thêm 2-3 giọt thuốc
thửDragendorff, không thấy xuất hiệntủa da cam.
(Phản ứng âm tính).
Ống nghiệm 2: Thêm 2-3 giọt thuốc thử
Mayerkhông thấy xuất hiện tủatrắng. (Phản ứng
âm tính).
Ổng nghiệm 3:Thêm 2-3 giọt thuốc
thửBouchardat, không thấy xuất hiệntủa màu
nâu. (Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có Alcaloid.
 Định tính Coumarin:
Cần khoảng 5 g dược liệu cho vào bình nón dung
tích 100 ml, thêm 50ml cồn 90°. Đun cách thuỷ 10
phút, lọc nóng,dùngdịch lọc làm các phản ứng
sau:
- Phản ứng Diazo hoá:
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm 2
ml Na2CO3 2%. Đun cách thuỷ đến sôi. Để nguội,
thêm 2 giọt thuốc thử Diazo, không thấy xuất hiện
màu đỏ. (Phản ứng âm tính).
- Phản ứng mở vòng lacton:
Cho dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ, mỗi ổng
1ml.
Ổng 1: Thêm 0,5 ml NaOH 10%
Ống 2: Để nguyên
Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội, quan sát
thấy cả 2 ống đều trong. (Phản ứng âm tính).
Sau đó cho thêm vào mỗi ống 2 ml nước sôi, lắc
đều, quan sát thấy cả 2 ống đều trong. (Phản ứng
âm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có Coumarin.
 Định tính Tanin:
Cho vào ống nghiệm to 1 g bột dược liệu và 10
mlnước. Đun cáchthuỷ sôi 5 phút. Lọc nóng qua
giấy lọc lấy dịchlàm phản ứng sau:
 - Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch lọc và vài
giọt dungdịch Gelatin 1%, khôngthấy xuất
hiện tủa bông trắng. (Phản ứng âm tính).
- Cho vào ống nghiệm 1ml dịch lọc và vài
giọtdung dịch thuốc thử PeCls 5%thấy
xuất hiện tủa xanh đen. (Phản ứng
dươngtính).
- Cho vào ống nghiệm 1mlo dịch lọc và vài
giọtdung dịch thuốc thử Chì acetat10%
không thấy xuất hiện tủa bông. (Phản ứng
âmtính).
Nhận xét: Dược liệu không có Tanin.
 Định tính acid hữu cơ.
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết nước
vàvài tinh thể Na2CH3 , khôngthấy xuất hiện bọt
khí bay lên. (Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Dược liệu khôftư có acid hữu cơ.
> Định tính saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt:
Cho vào ống nghiệm to 5 ml dịch chiết nước,
lắcmạnh dọc theo thành ốngnghiệm 5 phút, quan
sát thấy không xuất hiện nhiều bọt và bọt cũng
không bền sau 15 phút. (Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có saponin
 Định tỉnh Anthraglycosid.
Lấy khoảng 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm
to, thêm 10 ml nước cất, đun sôi 10 phút, để
nguội, lọc, lấy dịch lọc đem làm phản ứng
Bomtrager:
Lấy 1 ml dịch lọc + 1 ml dung dịch NaOH
10%,không thấy xuất hiện màu hồng. (Phản ứng
âm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có Anthraglycosid.
 Định tính chất béo
Lấy khoảng 5 g dược liệu cho vào bình nón có nút
mài dung tích 50 ml,đổ ngập ether dầu hoá, đun
cách thuỷ 15 phút, lọc lấy dịch lọc để làm phản
ứng. Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên miếng giấy lọc, hơ
nóng cho bay hết hơi dung môi, thấy để lại vết mờ
trên giấy lọc. (Phản ứng dương tính)
Nhận xét: Dược liệu có chất béo.
 Định tính Caroten:
Cho vào ống nghiệm to 2 ml dịch chiết ether dầu
hoả, bốc hơi trên nồi cách thuỷ đến cắn, thêm vài
giọt H2SO4 đặc vào cắn, không thấy dịch lọc
chuyên màu xanh. (Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có Caroten.
 Định tính Sterol:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ether dầu
hoá, bốc hơi trên nồi cách thuỷ đến cắn. Thêm
vào ống nghiệm 1 ml anhydric acetic, lắc kỹ cho
tan hết cắn. Để ổng nghiệm nghiêng 45°, thêm từ
từ 1ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm, không
thấy mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng có màu
xanh. (Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có Sterol.
 Đinh tính acid Amin:
Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết nước,
thêm 3 giọt thuốc thử Nihydrin 3%. Đun cách thuỷ
5-10 phút không thấy xuất hiện màu xanh tím.
(Phản ứng âm tính).
Nhận xét: Dược liệu không có acidAmin.
2.5.2. Chiết xuất tinh dầu:
  Quy trình chiết xuất tinh dầu trong trong
dược liệu.
-Nguyên tắc: Tinh dầu được tách ra khỏi dược
liệubằng phương pháp cắt kéohơi nước. Sử dụng
dụng cụ chia vạch để đọc đượcthể tích tinh dầu
sau khi cất.
- Nguyên liệu: cây Rau răm tươi.
- Dụng cụ: Nồi cất tinh dầu thủ công dung tích 5
lít,ống sinh hàn, bình gạn hứng tinh dầu, ống hứng
tinh dầu.Bộ nồi cất
(Hình 2,3. Sơ đồ nồi cất tinh dầu thủ công)
- Phương pháp tiến hành:
Cân tổng cộng 3,2 kg dược liệu tươi đã được
chianhỏ thích hợp, chialàm 3 lần để cất kéo hơi
nước. Cho dược liệu vàonồi cất tinh dầu dung tích
5lít. Thêm nước ngang bề mặt dược liệu. Lặp
dụngcụ.
Đun trực tiếp qua bếp điện trong 6 giờ. Sau 6
giờ,ngừng cất, tháo dỡ dụng cụ.
Lấy tinh dầu ra. Thể tích tinh dầu thu được ...ml
- Tính chất tinh dầu:
Tinh dầu thu được có màu vàng rơm, lỏng, sánh,
mùithơm hắc.Tỷ trọng tinh dầu nhỏ hơn 1 (d<l).
 Định lượng tinh dầu trong dược liệu
-Xác định độ ẩm của dược liệu:
Dược liệu để khô tự nhiên trong vòng 2 giờ. Lấy
1lượng dược liệu đãcắt nhỏ để xác định độ ẩm.
Bật máy đo độ ẩmSatorius, điều chỉnh nhiệt
độ130°c. Đổ dược liệu lên đĩa cân và trải đều, đậy
nắpcân và đợi máy tự độnghiện kết quả lên màn
hình. Làm tương tự 3 lần. Kếtquả .....
- Hàm lượng tinh dầu (d<l) được tính theo công
thức:
x% = (a X 100) /b
X: hàm lượng phần trăm tinh dầu (ml/g)
a: thể tích tinh dầu đọc được sau khi cất (ml)
b: khối lượng dược liệu đã trừ độ ẩm (g)
- Áp dụng công thức trên, ta được: % Hàm lượng
tinh dầu trong dược liệu là ..... tính theo trọng
lượng khô tuyệt đối.
 Định tính các thành phần chính trong tinh
dầubằng SKLM
- Chuẩn bị:
+ Dịch chấm sắc ký : hoà tinh dầu thu được ở
trêntrongCloroform làmdịch chấm sắc ký.
+ Dùng bản móng Silicagel GF254 (Merck)
trángsẵn đã hoạt hoá ở110°c trong 60 phút.
+ Hệ dung môi khai triển:
Hệ l: Toluen; Ethylacetat (93:7)
Hệ II: Cloroform
Hệ III: Toluen
Hệ IV: n-Hexan Ethylacetat (55)
+ Thuốc thử hiện màu: dung dịch Vanillin 5%
/H2SO4. Saukhi phun,nung bản mỏng ở 110°
trong 1-2 phút.
- Tiến hành: Bình sắc ký được bão hoà dung
môi,Bán mỏng đã hoạthoá, sau khi chấm mẫu
được triển khai theo chiều từ dưới lên.
- Kết quả: Các hệ dung môi đều tách tốt trong đó
hệ dung môi I tách tốt nhất. Quan sát bản mỏng
dưới ánh sángthường, ánh sáng tử ngoại ở
bướcsóng X = 254 nm và bước sóng A, = 365 nm,
sau đóphun thuốc thử hiện màuVanilin 5%/
H2SO4.

3. Thực nghiệm
3.1. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
3.1.1. Thiết bị
Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản
mỏng tráng sẵn silica gel (Merck, Đức) DC-
Alufolien 60 F254 có độ dày 0,2 mm trên nền
nhôm.
Sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh (FC) và
sắc ký cột tinh chế (Mini-C) được thực hiện trên
silica gel (Merck, Đức), cỡ hạt 63-200, 63-100 và
40-63 (μm).
Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS) được ghi
trên thiết bị AutoSpec Premier, Waters, USA -
khoa Hóa học, trường đại học khoa học tự nhiên-
Đại học quốc gia Hà Nội. Phổ khối lượng phun mù
điện tử (ESI-MS) được ghi trên đo trên hệ thống
Aglient 1200 series LC-MSD ion trap hoặc hệ
thống sắc ký lỏng khối phổ LC-ESI/MS/MS-Xevo-
TQ của viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt
Nam; hệ thống Aglient 1260 series HPLC-MS của
khoa Y dược- Đại học Quốc gia Hà Nội.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR,
500 MHz), phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-
13 (13C-NMR, 125 MHz) với chương trình DEPT và
phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR)
được ghi trên thiết bị Bruker AV 500
spectrometer. Độ chuyển dịch hóa học (δ) được
biểu thị theo ppm. Tetrametylsilan (TMS) là chất
chuẩn nội zero (ppm) - Viện hóa học, viện Hàn lâm
Khoa học và công nghệ Việt Nam.
Điểm nóng chảy đo trên máy SMP3 (Stuart) - Viện
Dược liệu.
Độ quay cực được đo trên máy phân cực kế
Electronic Polarimeter- P3001 -Viện Dược liệu.
Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích
Precisa 262SMA-FR, cân xác định độ ẩm Precisa
HA60- Viện Dược liệu
Máy UV-VIS 1800 dải đo 190nm-800nm, hãng
Shimadzu - Viện Dược liệu
3.1.2. Hóa chất, dung môi, dụng cụ
Các dung môi dùng để định tính, chiết xuất và
phân lập: ete dầu hỏa, n-hexan, điclometan (DCM,
CH2Cl2), clorofom (CHCl3), etyl axetat (EtOAc),
axeton, metanol (CH3OH, MeOH), n-butanol,
etanol (EtOH) Trung Quốc hoặc công nghiệp, được
tinh chế lại.
Hóa chất dùng trong phép thử độc tế bào:
Dulbecco's modified Eagle’s medium (DMEM),
RPMI-1640 medium, huyết thanh phôi bò (FBS) và
trypsin của GIBCO-BRL (Grand Island, NY, USA); 3-
(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide, một tetrazole) (MTT) của Sigma
Chemical Company (St Louis, MO, USA),
Tamoxifen của Sigma Aldrich.
Dòng tế bào ung thư: tế bào khối u trung mô ác
tính (HT 1080), tế bào ung thư tuyến vú xâm lấn ở
người (MDA-MB 231), tế bào ung thư vú người
kháng adriamycin (MCF-7/adr), tế bào ung thư vú
người kháng tamoxifen (MCF 7/TAMR) và tế bào
ung thư cổ tử cung ở người (Hela) được cung cấp
bởi American Type Culture Collection (ATCC,
Manassas, Virginia, USA).
Hóa chất dùng trong phép thử chống oxy hóa:
DPPH, ABTS, kali persulphate, trolox, acid
ascorbic, quercetin.
Hóa chất pha thuốc thử, triển khai sắc ký lớp
mỏng:H2SO4, FeCl3, acid acetic, acid formic, các
hóa chất cần thiết khác.
Dụng cụ: Các loại dụng cụ phòng thí nghiệm như:
cồn kế, bình cầu, bình nón, ống nghiệm, pipet,
ống đong, các dụng cụ cần thiết khác.
3.2. Nguyên liệu thực vật
* Cây Thủy Liễu (Polygonum odoratum Lour)
- Nơi thu hái:
- Người thu mẫu:
- Người giám định tên khoa học:
- Tên bản lưu:

Tài liệu tham khảo

[3] Hoàng Minh Châu (chủ biên), Từ Văn Mặc, Từ
Vọng Nghi (2006), Cơ sở hóa học phân tích, NXB
Khoa học và kĩ thuật.
[10]. Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở các
phương pháp phổ ứng dụng trong hóa học, NXB
Khoa học và kỹ thuật.
[11]. Nguyễn Đình Triệu (1999), Các phương
pháp vật lý ứng dụng trong hóa học, NXB Đại học
quốc gia Hà Nội.
27. Burits M and Bucar F (2000), “Antioxidant
activity of Nigella sativa essential oil”,
Phytotherapy Research 14
38. Cuendet M, Hostettmann K and Potterat O
(1997), “Iridoid glucosides with free radical
scavenging properties from Fagraea blumei”,
Helvetica Chimica Acta80
107. Moon JK and Shibamoto T (2009),
“Antioxidant assays for plant and food
components: Reviews”, J. Agric. Food Chem. 57
108. Mosmann T (1983), “Rapid colorimetric
assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity
assays”, Journal of Immunological Methods 65