TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y - DƯỢC HUẾ

KHOA DƯỢC

GIÁO TRÌNH THỰC TẬP

ĐỘC CHẤT HỌC
(Dành cho lớp Dược Đại học chính quy)

Tài liệu lưu hành nội bộ

Huế, 2021
 MỤC LỤC
Trang
BÀI 1: PHƯƠNG PHÁP VÔ CƠ HÓA MẪU CHÌ TRONG DỊCH SINH
HỌC .................................................................................................................. 1

BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CHÌ TRONG NƯỚC TIỂU ................ 3

BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT METHANOL TRONG RUỢU ....... 6

BÀI 4: XÁC ĐỊNH METHANOL TRONG RƯỢU BẰNG PHƯƠNG PHÁP

ĐO QUANG...................................................................................................... 8

BÀI 5: XÁC ĐỊNH CYANUA TRONG THỰC PHẨM ............................... 11

BÀI 6: PHÁT HIỆN STRYCHNIN TRONG THỰC PHẨM ........................ 12

BÀI 7: XÁC ĐỊNH BARBITURIC TRONG DỊCH SINH HỌC .................. 14

PHỤ LỤC ........................................................................................................ 17

 BÀI 1: PHƯƠNG PHÁP VÔ CƠ HÓA MẪU CHÌ TRONG
DỊCH SINH HỌC

1.Nguyên tắc chung của các phương pháp vô cơ hóa mẫu thử:
Việc phá hủy chất hữu cơ trước khi xác định ion kim loại trong mẫu
thử là cần thiết, vì các muối kim loại nặng có khả năng kết hợp với protein
động vật và thực vật tạo ra những hợp chất bền vững kiểu albuminat. Người
ta gọi quá trình này là phương pháp vô cơ hóa. Vô cơ hóa là quá trình oxi hóa
đốt cháy hữu cơ để giải phóng kim loại dưới dạng ion.
Hai phương pháp vô cơ hóa thường được sử dụng trong kiểm nghiệm
độc chất là:
- Phương pháp đốt hay vô cơ hóa khô.
- Phương pháp dùng axit với các tác nhân oxi hóa khác gọi là phương
pháp vô cơ hóa ướt.
2.Phương pháp vô cơ hóa ướt:
Tùy theo đối tượng và phương pháp phân tích cũng như thiết bị và điều
kiện của phòng thị nghiệm để chọn phương pháp vô cơ hóa mẫu. Hiện này, có
nhiều hỗn hợp được sử dụng để vô cơ hóa mẫu thử. Trong bài thực hành
thuật này, sinh viên tiên tiến hành kỹ thuật vô cơ hóa ướt sau:
* Phương pháp vô cơ hóa bằng hỗn hợp 3 axit (HClO4 +HNO3 + H2SO4
đặc)
a.Nguyên tắc: Cơ sở của phương pháp này là các phản ứng sau:
2 HNO3 → 2 NO2 ↑ + H2O2
H2SO4 → SO2 ↑ + H2O2
2 HClO4 → Cl2O6 + H2O2
Tác dụng của axit percloric thể hiện chủ yếu ở giai đoạn cuối của quá
trình vô cơ hóa. Khi nhiệt độ lên cao (2300C) axit percloric làm tăng thế năng
oxi hóa để phá hủy chất hữu cơ.
b.Hóa chất và dụng cụ:
- Bình Kjeldahl, lưới amian, bếp điện ...
- Axit HClO4 , HNO3 , H2SO4 đậm đặc , nước cất hai lần.
c.Cách tiến hành:

1
Mẫu thử:
- Lấy chính xác 10 ml bệnh phẩm (nước tiểu), cho vào bình Kjeldahl.
Thêm vào 3ml H2SO4 đậm đặc, 2 ml HNO3 đậm đặc, 1 ml HClO4 đậm đặc.
Lắc đều hỗn hợp và đun nhẹ lúc đầu, sau đó tăng dần nhiệt độ lên cao bằng
bếp cách cát và đến khoảng 2300C thì dừng nhiệt độ. Sự vô cơ hóa hữu cơ
diễn ra khi tăng dần nhiệt độ.
- Khi dịch vô cơ hóa đã được vô cơ hóa hoàn toàn, thì để nguội dung
dịch và chuyển dần sang bình định mức, thêm nước cất cho vừa đủ 50 ml.
Mẫu trắng: tiến hành tương tự mẫu thử, chỉ thay 10 ml bệnh phẩm thành 10
ml nước cất.
Mẫu chuẩn: Lấy 1ml chì mẫu cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất
vừa đủ 100 ml được dung dịch có nồng độ 0,02 µg/ml. Hút 10 ml dung dịch
vừa pha, tiến hành tương tự như mẫu thử.

2
 BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CHÌ TRONG NƯỚC TIỂU

Có nhiều phương pháp phân tích để xác định kim loại. Trong kiểm
nghiệm độc chất thường sử dụng các phương pháp như: phổ hấp thụ nguyên
tử, phổ phát xạ ICP, cực phổ, phổ hấp thụ phân tử, chiết trắc quang, sắc ký ...
Trong bài thực hành này, sinh viên ứng dụng phương pháp dithizon để
xác định chì trong nước tiểu:
1. Nguyên tắc chung:
Dithizon là hóa chất cổ điển được sử dụng để xác định nhiều kim loại.
Trong môi trường kiềm pH=8-10 dithizon tạo phức bền (dithizonat) với chì.
Vì nhiều kim loại khác cũng tạo phức dithizonat trong môi trường kiềm nên
cần phải thêm cyanua (KCN) để gắn với đa số kim loại khác, chỉ còn lại sự
hình thành dithizonat với chì, Bi, Sn. Vì trong nước tiểu hàm lượng Bi, Sn
không đáng kể nên có thể sử dụng dithizon để xác định chì mà không cần phải
loại trừ Bi và Sn.
2. Lấy mẫu: Bình đựng mẫu phải rửa sạch bằng hỗn hợp sulfocromic, rửa lại
bằng nước sau đó tráng bằng HNO3 0,1M và nước cất hai lần. Cho vào bình 5
ml HNO3 và 1 ml thymol 10% để bảo quản mẫu.
3. Hóa chất:
- Dung dịch dithizon để chiết: hòa tan 16 mg dithizon trong 1 lít cloroform
- Dithizon chuẩn: pha loãng hai lần dung dịch trên bằng cloroform
- Natri citrat: hòa tan 125 g natri citrat trong 500ml nước cất hai lần. Thêm 1
giọt chỉ thị đỏ phenol và vài giọt dung dịch NH4OH đến khi xuất hiện màu đỏ
(pH=9-10). Chiết bằng dithizon đến khi thu được dịch chiết màu xanh lá cây.
Thêm một ít axit citric đến màu da cam (pH=7) và chiết dithizon dư bằng
cloroform cho đến khi dịch chiết không màu. Bỏ qua lớp cloroform.
- Hydroxilamin hydroclorua 20%: hòa tan 50g Hydroxilamin trong 150 ml
nước cất, thêm amoniac từng giọt một cho đên khi pH=8-9. Chuyển dung dịch
qua bình gạn và lắc với dung dịch dithizon trong cloroform 0,01% cho đến
khi không đổi màu dithizon. Rửa lại vài lần với 5-6ml cloroform rồi để yên
cho phân lớp sau đó loại bỏ cloroform. Thêm nước cất vừa đủ 250 ml.

3
- Kali cyanua: điều chế dung dịch bão hòa với khoảng 50 g KCN. Chiết bằng
dithizon tới khi thu được màu xanh rồi chiết dithizon thừa bằng cloroform.
Pha loãng với nước cất đủ 50 ml.
- Dung dịch Amoni cyanua: trộn 200 ml KCN với 150 ml NH 4OH, pha loãng
vừa đủ 1 lít bằng nước cất.
- HNO3 1:99
- Dung dịch chì chuẩn: hòa tan 1,5984 g chì nitrat trong 1 lít HNO3 1:99
- Dung dịch chì gốc: 1ml có chứa 1 mg Pb (1L/1g)
- Dung dịch chì mẫu: 1 ml chừa 2 µg chì (cũng pha loãng bằng HNO 3 1:99)
(1L/0,002g).
4.Dụng cụ: Bình gạn, Ống nghiệm, Ống hút kẻ độ: 5, 10 ml; Phễu lọc và giấy
lọc.
5.Cách tiến hành:
a.Mẫu thử:
- Hòa tan kết tủa: Trung hòa cẩn thận dung dịch mẫu thử bằng NaOH 2N
trong cốc cỏ mỏ 250 ml ( kiểm tra bằng chỉ thị vạn năng ). Thêm 5 ml dung
dịch natri citrat 25% vào dịch vô cơ hóa, lắc để hòa tan kết tủa.
- Điều chỉnh pH=89-10: Thêm 5 ml Hydroxylamin, và 2-3 giọt đỏ
phenol và thêm dần NaOH 1N để dung dịch đạt pH=9-10 (màu vàng: môi
trường acid yếu chuyển thành màu đỏ trong môi trường kiềm).
- Tạo phức dithizon-Chì: Chuyển dung dịch vào bình gạn dung tích 125
ml đã chứa sẵn 5 ml KCN 10%. Lắc 2 lần với dithizon, mỗi lần 5 ml dithizon
(dung dịch 16 mg/1lit cloroform) và đúng 3 phút, lấy lớp dịch chiết có màu
xanh lá cây.
- Tách chì ra khỏi phức dithizon-chì: Gộp tất cả dịch chiết vào bình gạn
thứ hai đã chứa sẵn 20 ml HNO3 1:99. Lắc đúng 3 phút, chì sẽ được tách ra
khỏi dithizon, bỏ lớp cloroform. Rửa lớp nước với 5 ml cloroform, gạn tiếp
bỏ lớp cloroform đi.
- Đo độ hấp thụ quang: Thêm vào lớp nước 5 ml hỗn hợp amoni
cyanua và 10 ml (chính xác) dung dịch dithizon chuẩn, lắc đúng 3 phút. Tách
riêng các lớp, lớp pha cloroform vào một ống nghiệm khô. Đo độ hấp thụ
quang ở bước sóng 520 nm. Tính kết quả dựa vào đồ thị chuẩn (đường chuẩn
được xây dựng với lượng chì từ 0-25 µg chì trong 30ml HNO3 1%).
4
b.Mẫu trắng: tiến hành tương tự mẫu thử
c.Mẫu chuẩn: tiến hành tương tự mẫu thử

5
 BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT METHANOL TRONG RUỢU

1. Nguyên tắc chung

-Chưng cất là quá trình tách một dung dịch bằng cách đun sôi nó, rồi ngưng tụ
hơi bay ra để được 2 phần: phần nhẹ có nhiệt độ sôi thấp, chứa nhiều chất dễ
sôi; còn phần nặng còn lại là cặn chưng cất.
2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
2.1. Thiết bị, dụng cụ
- Bình định mức 100 ml
- Bình định mức 50 ml
- Cốc có mỏ 100 ml
- Pipet chính xác các loại (1 ml, 2 ml, 5 ml).
- Bộ chưng cất
- Ống đong 100 ml
- Cồn kế, nhiệt kế
2.2. Hóa chất, thuốc thử
- Rượu trắng, rượu màu
3. Tiến hành
3.1. Chưng cất methanol từ rượu màu và rượu trắng và điều chỉnh độ cồn
1. Nhiệt độ 6. Nước vào
2. Bình cất dung tích 250 ml 7. Nước ra
3. Bầu bảo hiểm 8. Bình hứng 100 ml
4. Nhiệt kế 10. Ống sừng bò
5. Nước làm lạnh
* Quy trình chưng cất: Lấy 100 ml mẫu rượu cho vào bình cầu có dung tích
250 ml của dụng cụ cất (hình trên) và vài viên đá bọt. Tiến hành chưng cất
với tốc độ đều cho đến khi bình hứng được khoảng 70 ml trong thời gian 40 –
60 phút. Để cồn bay hơi ra không bị mất, cho đầu ống sừng bò cắm vào trong
20 ml nước cất và ống sinh hàn dài được làm lạnh bằng nước lạnh và đặt bình

6
hứng trong chậu thủy tinh chứa hỗn hợp nước và đá để làm lạnh. Để nguội về
nhiệt độ phòng và thêm nước vừa đủ 100 ml.
3.2. Đo độ cồn bằng cồn kế:
+ Cho lượng cồn cần đo vào ống đong.
+ Đo nhiệt độ của cồn bằng nhiệt kế.
+ Đo độ cồn của mẫu bằng cồn kế, ta được độ cồn biểu kiến.
Nếu độ cồn biểu kiến ≥ 560, tra bảng Gay Lussac để tìm ra độ cồn thực.
Nếu độ cồn biểu kiến < 560, áp dụng công thức sau:
Độ cồn thực = độ cồn biểu kiến – [0,4 (t – 150)]
t: nhiệt độ của cồn đo được
3.3. Điều chỉnh độ cồn (theo phụ lục 1 hoặc 2):
Các chế phẩm rượu trên thị trường thường có nồng độ cồn khác nhau. Do đó,
khi định lượng metanol trong rượu bằng phương pháp đo quang (có đối chiếu
với mẫu trắng) thì cần phải xác định một nồng độ cồn chung cho cả mẫu trắng
và mẫu định lượng. Nếu mẫu thử có độ cồn thấp hơn độ cồn mẫu trắng thì
thêm cồn tinh khiết vào mẫu thử và ngược lại, nếu mẫu thử có độ cồn cao hơn
độ cồn mẫu trắng thì thêm nước cất vào mẫu thử để điều chỉnh về độ cồn mẫu
trắng.

7
 BÀI 4: XÁC ĐỊNH METHANOL TRONG RƯỢU BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG
1. Nguyên tắc
Trong môi trường acid, dưới tác dụng của KMnO4, metanol sẽ bị oxy hóa
thành aldehyd formic, rồi cho tác dụng với acid cromotropic để tạo sản phẩm
có màu hồng tím. Đo độ hấp thụ quang của sản phẩm này trên máy UV – VIS
ở bước sóng 575 nm cùng với dãy chuẩn của metanol được chuẩn bị trong
cùng điều kiện. Độ nhạy của phương pháp là 0,00008%. Sai số của phương
pháp trong khoảng xác định là 2 – 6%.
2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và thuốc thử:
2.1. Thiết bị, dụng cụ
- Máy quang phổ UV – VIS
- Bình định mức 100 ml
- Bình định mức 50 ml
- Cốc có mỏ 100 ml
- Pipet chính xác các loại (1 ml, 2 ml, 5 ml).
- Bộ chưng cất
- Ống đong 100 ml
- Cồn kế, nhiệt kế
2.2. Hóa chất, thuốc thử
- Cồn tinh khiết 99,8%
- Metanol tinh khiết 99,8%
- Cồn 12,5o
- Acid sunfuric đậm đặc 98%
- Acid phosphoric đậm đặc
- Acid cromotropic 99%
- Dung dịch acid cromotropic 2%
- NaHSO3 khan 98%

8
 - Dung dịch kali permanganat 3%
3. Tiến hành
3.1. Quy trình định lượng metanol trong rượu:
- Chưng cất rượu.
- Điều chỉnh mẫu về độ cồn 12,50 (theo phụ lục 1 hoặc 2).
- Ghi nhận độ pha loãng (n)
- Tiến hành so màu:
Cho vào 8 bình định mức dung tích 50 ml, lần lượt như sau:
Bảng 1. Quy trình định lượng metanol trong rượu

Bình 1 Bình 8
(Mẫu Bình 2 Bình 3 Bình 4 Bình 5 Bình 6 Bình 7 (Mẫu
trắng) đo)
KMnO4 3%
2 2 2 2 2 2 2 2
(ml)
Thêm 0,3 ml H3PO4 đậm đặc
Cồn 12,50 1 0 0 0 0 0 0 0
CH3OH
0,002% 0 1 0 0 0 0 0 0
0,003% 0 0 1 0 0 0 0 0
0,005% 0 0 0 1 0 0 0 0
0,010% 0 0 0 0 1 0 0 0
0,015% 0 0 0 0 0 1 0 0
0,020% 0 0 0 0 0 0 1 0
Rượu thử
điều chỉnh 0 0 0 0 0 0 0 1
o
12,5
Lắc đều, làm lạnh 30 phút bằng nước đá có muối
Cho 0,2g NaHSO3 khan và lắc đều khi dung dịch mất mầu hoàn toàn
Acid
cromotropic 1 1 1 1 1 1 1 1
2% (ml)
H2SO4 đđ
10 10 10 10 10 10 10 10
(ml)
Lắc đều và đặt trong nước ấm (60 – 750C) trong 15 phút
Để nguội về nhiệt độ phòng, thêm nước cất vừa đủ 50 ml

Để yên 15 phút, đem đo quang ở bước sóng 575 nm. Ghi độ hấp thu của từng
bình.

9
3.2. Tính kết quả
- Lập đường chuẩn: dựng đồ thị mối liên hệ giữa nồng độ và độ hấp thu A
= Achuẩn - Atrắng. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính.
- Xác định nồng độ % metanol trong mẫu rượu thử Cx ở 12,50 từ phương
trình hồi quy tuyến tính (hoặc đồ thị chuẩn).
- Xác định nồng độ % metanol trong mẫu rượu thử theo hiệu suất thu hồi:
CA(%) = CX . n . R
Trong đó:
R: hiệu suất thu hồi của quá trình chưng cất mẫu (chí áp dụng với rượu chưa
qua chưng cất). (Cho biết R= 86%).
n : độ pha loãng
CX: % metanol trong mẫu rượu thử ở 12,50
- Nồng độ % metanol trong mẫu rượu được quy về độ cồn 1000 theo công
thức: CA(%) = (CA .100)/12,5

3.3. Biện luận kết quả

Hàm lượng metanol trong 1 lít etanol 1000, tính bằng % (V/V), không được
lớn hơn 0,1% (TCVN 7043: 2002).

10
 BÀI 5: XÁC ĐỊNH CYANUA TRONG THỰC PHẨM

1. Định lượng HCN trong măng bằng phương pháp iod

a. Chuẩn bị mẫu:
Cân 50g măng khô (ngâm nước nóng để nở đều), cắt nhỏ cho vào bình
cầu có nhánh dung tích 250ml, thêm 50ml nước cất và 5ml HNO 3 1N, đậy
bình lại. Cho tiếp vào bình hứng 5ml KOH 10% tiến hành cất HCN trong
vòng 50 phút.
b. Định lượng HCN trong măng bằng phương pháp iod
Ta dựa vào phản ứng:
HCN + I2 = ICN + HI
Lấy 10ml mẫu (dịch chiết HCN từ măng) vào 1 bình nón dung tích
100ml, thêm 1g NaHCO3 để trung hòa mẫu và 2 giọt hồ tinh bột thêm vào lúc
cuối định lượng. Cho dd I2 vào buret rồi tiến hành chuẩn độ cho đến khi xuất
hiện màu xanh.
Cách tính hàm lượng HCN trong mẫu:
mgHCN=Vml dd I2 0.1N x 0.00185g
Chú ý: Thể tích dịch cất HCN trong các loại măng (tươi, muối và luộc)
phải ghi thể tích và khối lượng măng nghiên cứu để so sánh với hàm lượng
HCN trong các loại măng như sau:
- Măng tươi 0,035%
- Măng luộc: 0,027%
- Măng ngâm: 0,0020%
- Măng khô: 0,027%
Kết luận và giải thích.

11
 BÀI 6: PHÁT HIỆN STRYCHNIN TRONG THỰC PHẨM
1.Công thức hóa học:
Strychnin (C21H22N2O2) (Strychnidin-10-one)

Là alcoloid của hạt cây Mã tiền (Strychnos nux vomica, Loganiaceae)

có nhân indol. Ở Việt Nam còn có cây Hoàng Nàn (một loài cây dây leo
bóc lấy vỏ) có Strychnin.
Liều chết của hạt Mã tiền là 0,05g ở người lớn. liều tử vong của
Strychnin 0,2mg/kg. Người thì nhạy cảm với strychnin hơn súc vật.
2.Triệu chứng ngộ độc:
Khi ngộ độc Strychnin có biểu hiện co thắt các cơ như uốn ván, mắt lồi,
giãn đồng tử, nôn mửa, nếu triệu chứng độc kéo dài gây co thắt cơ ngực dẫn
tới không thở được và chết trong vòng từ 5 phút đến 5 giờ.
3.Nguyên tắc:
Chiết xuất Strychnin theo phương pháp chung của chiết xuất alkaloid,
làm phản ứng định tính bởi các thuốc thử chung của alkaloid, phản ứng đặc
trưng của strychnine, phổ UV có pick cực đại tại 268 nm.
4.Cách tiến hành:
- Cân 5,0 g bệnh phẩm
- Hòa tan strychnin sulfat bằng 25 ml nước cất, lọc qua giấy lọc thu được
dung dịch A.
- Lấy một ít dung dịch A trên làm phản ứng định tính alkaloid với các thuốc
thử:
+ Thuốc thử Valser-Mayer
+ Thuốc thử Bouchardat
+ Thuốc thử Dragendoff
12
- Dung dịch A còn lại, thêm từ từ NaOH 1N cho đến phản ứng trung tính
(kiểm tra bằng quì tím).
- Chiết strychnine base bằng 15 ml chloroform (chiết 2 lần: lần đầu 10 ml,
lần tiếp theo 5 ml) dùng bình gạn. Tách lấy phần dung dịch chloroform (dịch
trong phía dưới), cách thủy đến khô được cắn B.
- Lấy một ít cắn B, thêm vào 0,1ml H2SO4 đậm đặc và 1 tinh thể K2Cr2O7,
xung quanh tinh thể có màu tím, màu đỏ, màu vàng, khi lắc nếu có strychnin
có sự chuyển màu rất đặc biệt trên bề mặt tinh thể.
- Hòa tan cắn B còn lại trong 5ml ethanol tuyệt đối và quét phổ tử ngoại từ
190 đến 350 ml để xác định pick đặc trưng của strychnin tại bước sóng
268nm.

13
 BÀI 7: XÁC ĐỊNH BARBITURIC TRONG DỊCH SINH HỌC

1. Nguyên tắc:

Các phương pháp quang phổ xác định barbituric trong môi trường sinh
học dựa trên liên quang mật thiết giữa độ hấp thu UV và pH của dung dịch
barbituric. Tùy theo pH môi trường, có 3 dạng barbituric trong các dung dịch:
- Dạng không ion hóa trong dung dịch acid không có độ hấp thu trong khoảng
bước sóng 230 – 270 nm.
- Dạng ion hóa đầu tiên ở pH 9,8-10,5 cho độ hấp thu tối đa tại bước sóng
238-240 nm.
- Dạng ion hóa thứ hai ở pH 13-14 cho độ hấp thu tối đa tại bước sóng khoảng
260 nm và một đỉnh hấp thu nhỏ ở bước sóng 234-237 nm.
2. Dụng cụ, hóa chất, thuốc thử:
2.1. Dụng cụ:
- Chai đựng dung dịch đệm borat; dung dịch NaOH 0,45 N; dung dịch acid
barbituric 2g/L.
- 12 ống nghiệm falcon có nặp để chiết barbiturics.
- 24 ống nghiệm nhỏ (pha mẫu đo quang).
- 03 pipette chính xác 1ml, 06 pipette thẳng 10 ml.
-01 micropipette 100-1000 µl để hút chính xác 0,5 ml và 1 ml.
-Đầu cone xanh (30 cái).
2.2. Hóa chất:
-Acid hydroclorid đậm đặc.
-Diclorometan hoặc cloroform.
-Natri sulfat khan
-NaOH 0,45N
-Đệm borat 0,6 M

14
Cách pha:
H3BO3 ………………………..37,2 g
KCl …………………………….4,3 g
Nước cất vừa đủ ……………1000ml
-Dung dịch acid barbiturics 2 g/L.
3. Quy trình chiết xuất barbiturics trong dịch sinh học:

1ml dịch sinh học

Chiết với 12 ml cloroform

Bỏ lớp dịch sinh học 10 ml dịch chiết cloroform. Làm khan

Chiết với 3 ml NaOH 0,45 N

Dịch chiết NaOH Bỏ lớp cloroform

0,5 ml dịch chiết NaOH + 0,5 ml dịch chiết NaOH +

0,5 ml đệm borat 0,5 ml NaOH 0,45N

Ghi nhận sự khác biệt phổ hấp

thu ở 260 nm

Hình 1. Tóm tắt quy trình chiết xuất barbituric trong dịch sinh học
Cách tiến hành:
-Pha mẫu chuẩn từ dung dịch baribituric 2 g/L như sau:
Dung dịch Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5
Barbituric 2 g/L (ml) 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9
Dịch sinh học 0,9 0,7 0,5 0,3 0,1
Cloroform (ml) 12,0 12,0 12,0 12,0 12,0
HCl đ (giọt) 1 1 1 1 1

15
- Ống 6 ( ống thử ): Hút 1,0ml dung dịch thử + 12,0ml cloroform + 1 giọt
HCl đậm đặc.
- Ly tâm ở 4000 rpm trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, chuyển toàn bộ qua bình
gạn 60 ml.
- Lấy 10 ml dịch chiết cloroform vào ống nghiệm có chứa sẵn 2 g natri sulfat
khan. Trộn đều.
- Sau đó, lọc dịch cloroform đã được làm khan bằng giấy lọc vào 1 ống
nghiệm khác, thêm 3 ml dung dịch NaOH 0,45N. Ly tâm ở 4000 rpm trong 5
phút ở nhiệt độ phòng. Lấy lớp dịch phía trên (dịch chiết NaOH).
-Với mỗi nồng độ ở pH khác nhau, chuẩn bị các dung dịch sau theo quy trình
dưới đây:
pH 10: 1 ml dịch chiết NaOH + 1ml đệm borat
pH 13: 1 ml dịch chiết NaOH + 1ml NaOH 0,45 N
-Đo độ hấp thu của dung dịch pH 10 (AB) (với mẫu trắng là đệm borat +
NaOH 0,45N) và của dung dịch pH 13 (AN) (với mẫu trắng là NaOH 0,45N)
ở bước sóng 260 nm.
4. Cách tính kết quả:
-Vẽ đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu số (AN – AB) ở bước sóng
260 nm theo nồng độ barbituric.
-Xác định nồng độ mẫu thử.

16
 PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1
BẢNG ĐIỀU CHỈNH ĐỘ CỒN
(số ml cồn 99,8 cần thêm vào 100 ml mẫu để quy về độ cồn 12,5 độ)
Độ cồn đo
12.0 11.5 11.0 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5
được
Cồn 99,8
0.6 1.1 1.7 2.3 2.9 3.4 4.0 4.6 5.2 5.7 6.3 6.9 7.4 8.0
thêm vào

PHỤ LỤC 2
BẢNG ĐIỀU CHỈNH ĐỘ CỒN
(số ml nước cần thêm vào 10 ml mẫu để quy về độ cồn 12,5 độ)
Độ cồn đo được 99.8 99.5 99.0 98.5 98.0 97.5 97.0 96.5 96.0 95.5 95.0 94.5 94.0 93.5

Nước thêm vào 69.8 69.6 69.2 68.8 68.4 68.0 67.6 67.2 66.8 66.4 66.0 65.6 65.2 64.8

Độ cồn đo được 93.0 92.5 92.0 91.5 91.0 90.5 90.0 89.5 89.0 88.5 88.0 87.5 87.0 86.5

Nước thêm vào 64.4 64.0 63.6 63.2 62.8 62.4 62.0 61.6 61.2 60.8 60.4 60.0 59.6 59.2

Độ cồn đo được 86.0 85.5 85.0 84.5 84.0 83.5 83.0 82.5 82.0 81.5 81.0 80.5 80.0 79.5

Nước thêm vào 58.8 58.4 58.0 57.6 57.2 56.8 56.4 56.0 55.6 55.2 54.8 54.4 54.0 53.6

Độ cồn đo được 78.0 77.5 77.0 76.5 76.0 75.5 75.0 74.5 74.0 73.5 73.0 72.5 72.0 71.5

Nước thêm vào 52.2 51.8 51.4 51.0 50.6 50.2 49.8 49.4 49.0 48.6 48.2 47.8 47.4 47.0

Độ cồn đo được 70.0 69.5 69.0 68.5 68.0 67.5 67.0 66.5 66.0 65.5 65.0 64.5 64.0 63.5

Nước thêm vào 46.0 45.6 45.2 44.8 44.4 44.0 43.6 43.2 42.8 42.4 42.0 41.6 41.2 40.8

Độ cồn đo được 63.0 62.5 62.0 61.5 61.0 60.5 60.0 59.5 59.0 58.5 58.0 57.5 57.0 56.5

Nước thêm vào 40.4 40.0 39.6 39.2 38.8 38.4 38.0 37.6 37.2 36.8 36.4 36.0 35.6 35.2

Độ cồn đo được 56.0 55.5 55.0 54.5 54.0 53.5 53.0 52.5 52.0 51.5 51.0 50.5 50.0 49.5

Nước thêm vào 34.8 34.4 34.0 33.6 33.2 32.8 32.4 32.0 31.6 31.2 30.8 30.4 30.0 29.6

Độ cồn đo được 49.0 48.5 48.0 47.5 47.0 46.5 46.0 45.5 45.0 44.5 44.0 43.5 43.0 42.5

17
Nước thêm vào 29.2 28.8 28.4 28.0 27.6 27.2 26.8 26.4 26.0 25.6 25.2 24.8 24.4 24.0

Độ cồn đo được 42.0 41.5 41.0 40.5 40.0 39.5 39.0 38.5 38.0 37.5 37.0 36.5 36.0 35.5

Nước thêm vào 23.6 23.2 22.8 22.4 22.0 21.6 21.2 20.8 20.4 20.0 19.6 19.2 18.8 18.4

Độ cồn đo được 35.0 34.5 34.0 33.5 33.0 32.5 32.0 31.5 31.0 30.5 30.0 29.5 29.0 28.5

Nước thêm vào 18.0 17.6 17.2 16.8 16.4 16.0 15.6 15.2 14.8 14.4 14.0 13.6 13.2 12.8

Độ cồn đo được 28.0 27.5 27.0 26.5 26.0 25.5 25.0 24.5 24.0 23.5 23.0 22.5 22.0 21.5

Nước thêm vào 12.4 12.0 11.6 11.2 10.8 10.4 10.0 9.6 9.2 8.8 8.4 8.0 7.6 7.2

Độ cồn đo được 21.0 20.5 20.0 19.5 19.0 18.5 18.0 17.5 17.0 16.5 16.0 15.5 15.0 14.5

Nước thêm vào 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6

Độ cồn đo được 14.0 13.5 13.0 12.5

Nước thêm vào 1.2 0.8 0.4 0.0

18