BÀI 8

DƯỢC LIỆU CHỨA COUMARIN

Mục tiêu
Sau khi thực hành bài “Dược liệu chứa coumarin”, sinh viên phải:
 Thực hiện được các phản ứng định tính coumarin trong dược liệu.
 Áp dụng được phương sắc ký lớp mỏng để định tính coumarin trong dược liệu.

I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
Coumarin là các hợp chất thuộc nhóm phenylpropanoid
(C6 – C3) với khung cơ bản là benzo--pyron, với một số tính chất sau:
 Thường tồn tại dưới dạng aglycon, dễ kết tinh, không màu, có mùi
thơm và đa số dễ thăng hoa.
 Dạng glycosid có thể tan trong nước, dạng aglycon thì dễ tan trong
dung môi kém phân cực.
 Phát huỳnh quang dưới UV 365 nm, cường độ huỳnh quang phụ
thuộc vào nhóm oxy của phân tử coumarin cũng như pH của dung dịch, mạnh nhất đối với
coumarin có nhóm OH ở C-7 (nhiều coumarin có OH ở vị trí này).
 Do có vòng lacton (ester nội) nên coumarin dễ bị mở vòng bởi kiềm tạo thành muối tan
trong nước, nếu acid hóa thì thường sẽ trở về dạng không phân ly và có sự đóng vòng trở
lại.
 Sau khi mở vòng lacton bằng dung dịch kiềm, các coumarin đơn giản sẽ tạo thành dẫn chất
hydroxy cinnamic ở dạng cis (muối của acid coumarinic), có huỳnh quang yếu trong UV
365 nm. Dưới tác dụng của tia UV 365 nm, chất này sẽ chuyển thành dạng trans (muối của
acid coumaric), có huỳnh quang mạnh hơn.

II. THỰC HÀNH

1. Nguyên vật liệu thí nghiệm
1.1. Hóa chất, thuốc thử
-
Cồn 96 % - Thuốc thử diazo
-
HCl đậm đặc - Than hoạt
-
Dung dịch KOH 5 %/MeOH - Bản mỏng silica gel F254 (Merck)
-
Dung dịch NaOH 5 % - Hệ dung môi SKLM:
-
Dung dịch NaOH 10 % S1: n-hexan – ethyl acetat (9:1)
- Dung dịch FeCl3 1 % S2: n-hexan – aceton (9:1)
1.2. Dược liệu
 Ba dót (Folium Eupatorii) là lá của cây Ba dót (Eupatorium triplinerve Vahl., Asteraceae).
 Bạch chỉ (Radix Angelicae dahuricae) là rễ củ của cây Bạch chỉ (Angelica dahurica
(Fisch. ex Hoffm) Benth. et Hook. f. hoặc Angelica dahurica (Fisch. ex Hoffm) Benth. et
Hook. f. var. formosana (Boiss) Shan. et Yuan, Apiaceae).
 Tiền hồ (Radix Peucedani) là rễ của cây Tiền hồ (Peucedanum prearuptorum Dunn. hoặc
P. decursivum (Miq.) Maxim, Apiaceae).
37
 Rễ tranh (Rhizoma Imperatae) là thân ngầm của cây Cỏ tranh (Imperata cylindrica (L.) P.
Beauv. var major Ness. Hubb., Poaceae).
2. Nội dung thực tập
2.1. Chiết xuất
 Phương pháp 1 (áp dụng cho dược liệu là thân, rễ)
Lấy 2 g bột dược liệu (Bạch chỉ, Tiền hồ) cho vào 1 bình nón 100 ml, thêm 30 ml cồn 96 %
và đun sôi trên cách thủy 10-15 phút. Lọc lấy dịch chiết để thực hiện các phản ứng định tính.
 Phương pháp 2 (áp dụng cho dược liệu là lá)
Lấy 2 g bột dược liệu (lá Ba dót) cho vào 1 bình nón 100 ml, thêm 40 ml cồn 96 % và đun sôi
trên cách thủy trong 10-15 phút. Lọc lấy dịch chiết cho vào 1 bình nón khác. Thêm vào dịch
lọc này một ít than hoạt, lắc nhẹ và đun cách thủy trong 3 phút.
Lọc nóng qua giấy lọc, thu dịch lọc để thực hiện các phản ứng định tính (ở mục 2.2).
Lưu ý: Lượng than hoạt cho vừa đủ sao cho dịch chiết giảm màu xanh chlorophyll nhưng không mất
màu hoàn toàn.
2.2. Định tính coumarin
2.2.1. Phản ứng đóng mở vòng lacton
Cho vào 3 ống nghiệm bằng nhau (kích thước 1,6  16 cm), mỗi ống 2 ml dịch lọc ở 2.1:
- Ống 1: thêm 4 ml nước cất, dung dịch trở nên đục.
- Ống 2: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10 %. Đun cách thủy trong 2-3 phút. Bổ sung nước
cất cho đến khi thể tích bằng ống 1, quan sát sẽ thấy ống 2 trong hơn ống 1.
- Ống 3: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10 %. Đun cách thủy trong 2-3 phút. Tiếp tục acid
hóa ống 3 với vài giọt HCl đđ (thử bằng giấy pH), thêm nước cất cho đến thể tích bằng
ống 2 sẽ thấy ống này đục hơn ống 2.
2.2.2. Sự tăng huỳnh quang trong môi trường kiềm dưới tác dụng của tia UV
Lấy 2 ml dịch chiết cồn (từ mục 2.1), thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10 %, đun cách thủy
trong 3 phút rồi nhỏ vài giọt dịch chiết này lên 1 tờ giấy lọc, sấy khô dung môi và lặp lại như
trên 4 lần nữa. Sấy khô hoàn toàn. Che nửa vết dịch chiết bằng 1 miếng kim loại rồi đem soi
đèn UV 365 nm trong 1 phút.
Lấy miếng kim loại ra sẽ thấy nửa không bị che phát quang sáng hơn nửa bị che. Nếu tiếp tục
chiếu UV sau vài phút thì cường độ phát quang của 2 nửa sẽ như nhau.
Ghi chú: Nên làm thêm 1 mẫu chứng (chỉ có dịch chiết, sấy khô) để so sánh.
2.2.3. Thử nghiệm vi thăng hoa
Cho 1-2 g bột dược liệu được xay mịn vào 1 chén nung nhỏ. Đun cách cát, đảo đều dược liệu
cho bay hết hơi nước rồi đậy chén bằng 1 phiến kính trên có đặt sẵn 1 miếng bông gòn thấm
nước lạnh, tiếp tục đun khoảng 5-10 phút nữa (thỉnh thoảng thay bông lạnh). Lấy phiến kính
ra, để nguội rồi quan sát dưới kính hiển vi (10) sẽ thấy nhiều tinh thể không màu.
Chú ý: Phân biệt với tinh thể của anthraquinon bằng cách nhỏ vài giọt NaOH 5% lên bông gòn, quét
bông gòn này lên trên mặt phiến kính có chứa tinh thể. Nếu là coumarin thì bông gòn không được có
màu hồng đến đỏ.
2.2.4. Phản ứng với thuốc thử diazonium
38
Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết cồn (từ mục 2.1), thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 5 %.
Đun cách thủy trong 2 phút rồi để nguội hoặc làm lạnh bằng vòi nước, thêm từ từ từng giọt
thuốc thử diazonium cho đến khi xuất hiện màu đỏ hoặc đỏ cam.
Chú ý:
- Phản ứng xảy ra ở pH kiềm yếu, kiểm tra pH của dịch lọc trước khi làm phản ứng.
- Thuốc thử diazo được pha trong dung dịch acid, do đó nếu cho quá nhiều thuốc thử thì dung dịch
sẽ có pH acid và phản ứng không xảy ra được.
- Thuốc thử diazo không bền ở nhiệt độ cao.
2.3. Định tính coumarin bằng sắc ký lớp mỏng
Chuẩn bị: Chuẩn bị tương tự như mục 2.4.1 bài Dược liệu chứa saponin.
Dịch chấm sắc ký
Dịch chiết cồn của dược liệu (Tiền hồ, Bạch chỉ, Ba dót) được bốc hơi trên bếp cách thủy đến
cắn. Hoà tan cắn với CHCl3, dùng dung dịch này làm dịch chấm sắc ký.
Chuẩn bị bản mỏng
Sử dụng các bản mỏng silica gel tráng sẵn với kích thước thích hợp (thường là 2,5  10 cm).
Dung môi sắc ký
- Hệ S1 = n-hexan – EtOAc (9:1) hoặc S2 = n-hexan – aceton (9:1).
Cho dung môi vào 1 bình sắc ký (đã lót sẵn giấy lọc) sao cho lớp dung môi trong bình cao
khoảng 0,5 cm. Đậy nắp bình sắc ký, để bão hòa bình trong 30 phút.
Khai triển:
Dùng mao quản lấy dịch chiết, chấm lên bản mỏng thành từng vết gọn (chấm 2-3 lần), hoặc
thành từng vạch 1  3 mm, cách mép dưới bản 1-1,5 cm (vết cách vết khoảng 1 cm và ở vị trí
cao hơn mực dung môi trong bình sắc ký).
Đặt bản mỏng vào bình sắc ký ở tư thế đứng nghiêng rồi đậy nắp bình. Khi dung môi còn
cách mép trên khoảng 0,5 cm thì lấy bản mỏng ra, đánh dấu mực dung môi và để bay hơi
dung môi trong tủ hốt ở nhiệt độ phòng, có thể sấy nhẹ cho khô.
Phát hiện vết và tính giá trị Rf
Quan sát bản mỏng dưới đèn UV 365 nm, 254 nm; đánh dấu các vết (bằng bút chì) rồi tính Rf.
Sau khi quan sát vết dưới đèn UV, có thể phun dung dịch KOH 5% trong cồn (làm trong tủ
hốt) rồi sấy nhẹ trong 5 phút. Phun tiếp thuốc thử diazo lên bản trên, các dẫn chất coumarin sẽ
cho các vết có màu cam đến đỏ.
Chụp hình và vẽ lại sắc ký đồ.

III. GỢI Ý THẢO LUẬN

1. Điều kiện thực hiện phản ứng diazo khi định tính coumarin? Nếu không mở vòng lacton,
phản ứng có xảy ra không?
2. Giải thích thử nghiệm đóng mở vòng lacton của coumarin.
3. Giải thích sự tăng huỳnh quang của coumarin trong môi trường kiềm khi chiếu tia UV 365
nm, các yếu tố ảnh hưởng tới thử nghiệm này.
4. Trong các phản ứng định tính, phản ứng nào là phản ứng đặc hiệu để kết luận có coumarin
trong dược liệu?
39