Bài thực hành số 5: Phương pháp sắc ký-Sắc ký cột

Mục Đích:
 Về kiến thức, sinh viên cần nắm được lý thuyết về các phương pháp:
a. Sắc ký cột silica gel pha thường.
b. Chiết lỏng-lỏng.
 Về kĩ năng, sinh viên có thể thực hiện được một số kĩ thuật gồm:
a. Sắc ký cột (chuẩn bị cột, chuẩn bị mẫu, nạp cột, và giải ly).
b. Sử dụng dung môi có độ phân cực khác nhau.
Thực Nghiệm:
Hóa chất:
 Silicagel pha thường
 Petroleum ether 60-90
 Ethyl acetate
 Acetone
 Na2SO4 khan
Dụng Cụ:
 Becher 100ml (5 cái)
 Becher 250ml (2 cái)
 Erlen 100ml (2 cái)
 Bình lóng 100ml (1 cái)
 Phễu lọc (2 cái)
 Cối và chày (1 bộ)
 Ống đong 10ml (2 cái)
 Ống đong 50ml (1 cái)
 Đũa thủy tinh(2 cây)
 Ống hút pasteur, bông gòn
 Thìa
 Bình thu hồi sản phẩm
Tiến Hành:
Điều chế sắc tố màu lá cây xanh:
 Chuẩn bị 5g lá cây lau sạch, cắt và cho vào cối nghiền nát.
 Cho vào erlen có chứa sẵn 5g lá cây đã nghiền nát 30ml hỗn hợp
dung môi acetone - petroleum ether (được pha trước với tỉ lệ 1:1).
 Sau đó lắc đều trong 10 phút rồi lọc qua một becher khác bằng
phễu và giấy lọc. Rửa bả trên phễu bằng 10ml hỗn hợp dung môi
trên.( Hình 1)
 Cho dung dịch đã lọc trên vào một phễu chiết, rửa dung dịch 3 lần,
mỗi lần 30ml nước. Tách riêng lớp hữu cơ và làm khan nước
trong lớp hữu cơ này bằng Na2S04 khan. Lọc lại bằng phễu và giấy
lọc để lấy dung dịch trong đựng trong lọ “sắc tố màu”.( Hình 2)
 Đun nóng lọ “sắc tố màu” để loại bỏ bớt dung môi thu dung dịch
đậm đặc hơn.( lưu ý, nếu lỡ tay đun bay hơi hết dung môi thì có
thể cho vào erlen này 3ml dd hỗn hợp dung môi aceton-petroleum
ether). (Hình 3)

Hình 1 Hình 2 Hình 3

 Chuẩn bị cột sắc ký:
 Lắp cột thẳng đứng vào giá nhờ cây kẹp, dùng đũa thuỷ tinh dài
để nhồi một lớp mỏng bông gòn dày chừng 1 - 2 mm vào dưới đáy
cột (không nhồi quá chặt). Cho trước vào cột 5ml petroleum ether.
 Cho từ từ silica gel pha thường vào cột đã có sẵn petroleum ether
(cho từ từ để hạt lắng đều và tránh dính lên thành cột), cho đến
 khi cột đạt chiều cao khoảng 5cm thì dừng lại (chú ý là lớp dung
môi trong cột phải luôn cao hơn mức silica gel). 
 Mở khoá cho dung môi từ từ chảy xuống cho đến khi lớp dung môi
cách lớp silicagel khoảng 1 - 2 cm thì ngừng lại. Dùng đũa thuỷ
tinh lớp lót bông gòn trên mặt này, tiếp tục mở khoá cho dung môi
chảy từ từ xuống cho đến khi lớp dung môi cách lớp silicagel
khoảng 1 mm thì ngừng lại. Để yên cột chuẩn bị nạp mẫu. (hình 4)

Hình 4
Nạp mẫu và giải ly cột sắc ký:
 Dùng ống nhỏ giọt để đưa mẫu chất vào đầu cột. Ngưng 2 phút để
mẫu có thời gian tạo cân bằng với chất hấp phụ và dung môi giải
ly.
 Tiến hành giải ly: cho dung môi petroleum ether vào cột (phải cho
dung môi thường xuyên để giải ly) và mở khoá cho dung môi chảy
ra và hứng vào becher hoặc erlen nhỏ.
 Sắc tố 𝛽-carotene màu vàng( Hình 5) di chuyển nhanh ra khỏi cột
trước tiên. Sau khi dãy màu vàng đã ra khỏi cột, thay hệ dung môi
đang giải ly là petroleum ether bằng hỗn hợp petroleum ether -
ethyl acetate (được pha trước với tỷ lệ 7:3). Diệp lục tố màu xanh
lục bắt đầu di chuyển xuống dưới cột. Kết quả thu được hai mẫu
là “𝛽-carotene” và “diệp lục tố”.
 Hình 5
Kết quả:
 Các chất không phân cực sẽ tan tốt trong dung môi không phân
cực, tương tự chất phân cực sẽ tan tốt trong dung môi phân cực
( các chất không phân cực sẽ giải ly trước, di chuyển nhanh hơn
và ngược lại).
 Từ kiến thức: Sắc tố 𝛽-carotene di chuyển nhanh ra khỏi cột
trước. Sau khi dãy màu vàng ra khỏi cột và thay hệ dung môi thì
dãy màu xanh bắt đầu di chuyển xuống cột. Kết quả thu được sắc
tố 𝛽-carotene màu vàng và Chlorophyll màu xanh lục. Ta có lập
luận như sau:
 Lúc đầu ta dùng dung môi petroleum ether (không phân cực) để
giải ly thì thu được sắc tố 𝛽-carotene màu vàng. Sau khi dãy màu
vàng đã ra khỏi cột và thay hệ dung môi trước đó bằng hỗn hợp
petroleum ether - ethyl acetate 7:3 (phân cực) thì thu được sắc tố
Chlorophyll màu xanh lục.
 Với các dung môi giải ly trên cho thấy 𝛽-carotene là một chất
không phân cực, còn Chlorophyll là chất phân cực. Do hợp chất
không phân cực sẽ di chuyển nhanh hơn và được giải ly ra khỏi
cột trước, chất phân cực di chuyển chậm hơn.
 Kết quả là thu được 𝛽-carotene trước Chlorophyll.
Câu hỏi?
1/ Sắc ký cột là gì. Có những yếu tố nào ảnh hưởng đến khả năng
tách của các chất trong sắc ký?
 Sắc ký cột là phương pháp sắc ký phân tách và định lượng sinh chất dưới
áp suất cao, giúp giảm đáng kể thời gian và hiệu quả, chất lượng phân
tích
 Có nhiều yếu tố ảnh hưởng: 
1. Sự lựa chọn chất hấp phụ .
 2. Sự lựa chọn dung môi giải ly. 
3. Kích thước cột sắc ký, số lượng chất hấp phụ, lượng mẫu
chất được dùng. 
4. Vận tốc giải ly.
2/ Chất hấp phụ dùng trong bài là gì? Cấu trúc của nó như thế nào?
Với loại chất hấp phụ này thì chất phân cực hay kém phân cực sẽ
bị rửa giải ra trước? 
 Chất hấp phụ dùng trong bài là silicagel.
 Silicagel tồn tại ở dạng các hạt có cấu trúc rỗng của silica được
tổng hợp từ H2SiO3. Silicagel là chất rắn có lỗ xốp nhỏ có dạng cục
hoặc viên hình cầu, có loại trong suốt như thuỷ tinh hoặc đục.
 Với silicagel là chất hấp phụ phân cực nên các cấu tử phân cực
hơn trong hỗn hợp sẽ bị giữ lại mạnh hơn trong pha tĩnh và do đó
sẽ đi ra khỏi cột sau cùng. 
3/ Trong bài sử dụng petroleum ether để rửa giải carotene và
petroleum ether:ethyl acetate 7:3 để rửa giải chlorophyll. Cho biết
petroleum ether và ethyl acetate, dung môi nào có độ phân cực lớn
hơn. Từ đó so sánh độ phân cực của carotene và chlorophyll?
 Trong bài sử dụng petroleum ether để rửa giải carotene và
petroleum ether:ethyl acetate 7:3 để rửa giải chlorophyll: ethyl
acetae phân cực lớn hơn petroleum ether.
 Do đó để giải ly thì thu được sắc tố 𝛽-carotene màu vàng dùng
dung môi petroleum ether (không phân cực). Sau khi dãy màu
vàng đã ra khỏi cột và thì thu được sắc tố Chlorophyll màu xanh
lục phải thay hệ dung môi trước đó bằng hỗn hợp petroleum ether
- ethyl acetate 7:3 (phân cực).
---------> chlorophyll phân cực hơn carotene.
4/ Để theo dõi quá trình rửa giải cột, ta có thể dùng những phương
pháp nào?
 Để theo dõi quá trình rửa giải cột, ta có thể dùng những phương pháp: 
 Với mẫu nguyên liệu có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể
được theo dõi bằng mắt thường nhờ nhìn thấy các dãy lớp có màu
sắc khác nhau, đang tách ra xa nhau trong cột.
Đa số trường hợp các chất hữu cơ không có màu, nên phải theo dõi
bằng nhiều cách khác nhau:
 1. Có thể theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký bản mỏng, áp
dụng cho những phân đoạn dung dịch hứng được trong quá
trình giải ly.
2. Dung dịch được giải ly ra khỏi cột trước được hứng vào erlen
nhỏ, được đánh số thứ tự và cân khối lượng, mỗi erlen sẽ
hứng một thể tích bằng nhau của dung dịch giải ly, sau đó làm
bay hơi dung môi trong mỗi erlen sẽ thu được cặn, cân cặn.
Vẽ đường biểu diễn trọng lượng chất cặn trong mỗi becher,
theo số thứ tự của becher trong quá trình giải ly.

5/ Trên chai petroleum ether sử dụng trong bài có ghi “Petroleum

ether 60-90”. Cho biết thành phần petroleum ether là gì, ý nghĩa của
chữ số 60-90 là gì. Chữ ether ở đây có phải là nhóm chức ether hay
không?
 Thành phần petroleum ether chủ yếu là pentan và isohexan.
 Ý nghĩa của chữ số 60-90 là điểm sôi dao động trong khoảng 60 oC
đến 90oC.
 Ether ở đây không phải là nhóm chức ether, vì petroleum ether
không chứa bất kỳ liên kết alkoxy R - O - R’ nào.
6, Sắp xếp các dung môi sau theo thứ tự tăng dần độ phân cực của
chúng: methanol, nước, petroleum ether, chloroform, ethyl acetate,
acid acetic?
Thứ tự tăng dần độ phân cực: petroleum ether < chloroform < ethyl
acetate < methanol < nước < acid acetic.