HƯỚNG DẪN THỰC HÀNH BÀI 6

KHẢO SÁT PHẢN ỨNG KẾT TỦA PROTEIN

HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG MICROPIPETTE
HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG MICROPIPETTE
HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG MICROPIPETTE
NỘI DUNG THỰC HÀNH BÀI 6
 NỘI DUNG CHÍNH

1. KHẢO SÁT CÁC PHẢN ỨNG KẾT TỦA CỦA PROTEIN

2. KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ PROTEIN PHỨC TẠP
3. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TOÀN PHẦN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIURÊ
4. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU (KỸ THUẬT MESTREZAT)
KHẢO SÁT CÁC PHẢN ỨNG KẾT TỦA CỦA PROTEIN
 KHẢO SÁT CÁC PHẢN ỨNG KẾT TỦA CỦA PROTEIN

1. Tác nhân tủa protein không thuận nghịch

- Protein bị biến tính không trở lại cấu trúc ban đầu
- Acid mạnh
 Acid vô cơ: HNO3, H2SO4
 Acid hữu cơ: Acid sulfosalicylic, acid tricloacetic
- Kim loại nặng: CuSO4
2. Tác nhân tủa protein thuận nghịch
- Cấu trúc của protein không bị phá hủy, protein có thể trở lại tính chất ban đầu.
- Sử dụng để tinh chế protein, điều chế những sản phẩm enzym, hormon, kháng thể.
- Phương pháp muối kết (Salting out): NaCl, Amoni sulfate
- Dung môi hữu cơ: Ethanol/Aceton
 TỦA PROTEIN KHÔNG THUẬN NGHỊCH – ACID VÔ CƠ

- Nguyên tắc: protein bị biến tính do bị khử nước và trung hòa điện tích
- Thuốc thử: Dung dịch protein trứng, HNO3, H2SO4
- Tiến hành
 Lấy 2 ống nghiệm 1 & 2. Để ống nghiệm nghiêng 45°
 Thêm vào mỗi ống nghiệm 0,5 mL dung dịch protein khảo sát.
 Dùng ống hút cho từ từ vào thành ống nghiệm 1 (không lắc ống) 0,5 mL HNO 3 đậm đặc. Một
vòng tủa trắng tạo thành ở mặt ngăn cách giữa 2 chất lỏng. Lắc nhẹ ống nghiệm, thêm 1
lượng thừa HNO3, tủa protein không tan.

 Thực hiện tương tự với ống nghiệm 2, thay dung dịch HNO 3 đậm đặc bằng dung dịch H2SO4
đậm đặc. Khi thêm lượng thừa acid tủa sẽ tan.
 TỦA PROTEIN KHÔNG THUẬN NGHỊCH – ACID HỮU CƠ

- Nguyên tắc
 Phần lớn các protein bị kết tủa khi tác dụng với acid hữu cơ mạnh (acid tricloacetic và acid
sulfosalicylic) ở nhiệt độ thường.
 Ứng dụng:
 Dùng acid tricloacetic để loại protein khỏi mẫu máu trước khi tiến hành định lượng các thành
phần khác
 Dùng acid sulfosalicylic định tính và định lượng protein trong nước tiểu.
- Thuốc thử: Dung dịch protein trứng, acid sulfosalicylic 20%, acid tricloacetic 10%
- Tiến hành
 Cho vào 2 ống nghiệm: mỗi ống 0,5 mL dung dịch protein
 Thêm vào ống thứ I: 0,5 mL dung dịch acid sulfosalicylic 20%; ống thứ II: 0,5 mL dung dịch
acid tricloacetic 10%.
 Quan sát sự hình thành tủa và so sánh.
 TỦA PROTEIN KHÔNG THUẬN NGHỊCH – KIM LOẠI NẶNG

- Nguyên tắc
 Protein bị biến tính do sự hấp phụ kim loại nặng trên bề mặt phân tử và tạo ra các phức chất
không tan ở nhiệt độ thường.
 Lượng dư các muối này hòa tan trở lại tủa do sự hấp phụ kim loại nặng trên bề mặt các hạt
keo và làm xuất hiện điện tích dương trên phân tử protein. Với các muối bạc và thủy ngân thì
điều này không xảy ra.
 Ứng dụng để giải độc khi ngộ độc kim loại nặng
- Thuốc thử: Dung dịch protein trứng, dung dịch CuSO4 1%
- Tiến hành
 Cho vào ống nghiệm 0,5 mL dung dịch protein trứng.
 Thêm 0,2 mL dung dịch CuSO4 1%.
 Quan sát sự hình thành tủa.
 TỦA PROTEIN THUẬN NGHỊCH – SALTING OUT

- Nguyên tắc
 Protein bị kết tủa ở nhiệt độ thường do các muối này khử những phân tử nước bao quanh
phân tử protein, làm giảm sự hòa tan của protein.
 Sự kết tủa này phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tính chất và nồng độ các loại muối, tính chất của
protein và pH của dung dịch.
 Khi giảm nồng độ muối bằng cách pha loãng với nước hay thẩm tách, protein có thể tan trở
lại.
- Tiến hành kết tủa protein bằng NaCl
 Cho vào ống nghiệm 5 mL dung dịch protein trứng (Albumin & Globulin)
 Thêm vào ống nghiệm bột NaCl đến bão hòa. Sau vài phút globulin sẽ tủa.
 Lọc bỏ tủa globulin, trong dịch lọc có chứa albumin.
 Thêm vào dịch lọc 1 giọt dung dịch acid acetic 1% và đun sôi, albumin sẽ tủa.
 TỦA PROTEIN THUẬN NGHỊCH – SALTING OUT

- Nguyên tắc
 Protein bị kết tủa ở nhiệt độ thường do các muối này khử những phân tử nước bao quanh
phân tử protein, làm giảm sự hòa tan của protein.
 Sự kết tủa này phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tính chất và nồng độ các loại muối, tính chất của
protein và pH của dung dịch.
 Khi giảm nồng độ muối bằng cách pha loãng với nước hay thẩm tách, protein có thể tan trở
lại.
- Tiến hành kết tủa protein bằng Amoni sulfate
 Cho vào ống nghiệm 15 giọt protein trứng và 15 giọt dung dịch amoni sulfat bão hòa.
 Lắc đều, Globulin sẽ tủa. Sau 5 phút lọc bỏ tủa glubulin, trong dịch lọc có chứa albumin.
 Thêm vào dịch lọc bột amoni sulfat đến bão hòa. Tủa albumin sẽ nổi lên trên vì tỉ trọng chất
lỏng cao.
 TỦA PROTEIN THUẬN NGHỊCH – DUNG MÔI HỮU CƠ

- Nguyên tắc
 Protein sẽ tủa bông trong những dung môi hữu cơ do phân tử protein bị mất nước trở nên
kém bền vững trong dung dịch.
 Điều kiện: dung dịch protein phải trung tính, hơi acid và nên có chất điện giải (NaCl)
 Phản ứng của protein với alcol có thể thuận nghịch khi cho tác dụng ở nhiệt độ thấp (từ 0–15
°C) và thời gian ngắn. Khi cho tác dụng trong thời gian dài, protein sẽ bị biến tính.
- Tiến hành
 Cho vào 1 ống nghiệm 5 giọt dung dịch protein trứng.
 Thêm vào ống nghiệm 15–20 giọt ethanol (aceton), dung dịch hơi vẩn đục.
 Thêm 1 giọt dung dịch bão hòa NaCl, tủa sẽ xuất hiện.
KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA MỘT SỐ PROTEIN PHỨC TẠP
 TÍNH CHẤT PROTEIN PHỨC TẠP – CROMOPROTEIN (HEMOGLOBIN)

- Nguyên tắc
 Hemoglobin có phần protein và nhóm ngoại là hem. Cấu tạo của hem gồm nhân
protoporphyrin kết hợp với ion sắt hóa trị 2. Khi oxy hóa, ion sắt trong hem nếu kết hợp với
hydroxyd thì tạo thành hematin, còn kết hợp với clorid thì tạo nên hemin.
- Tiến hành
 Chuẩn bị 1 lame máu mỏng. Để khô lame kính ngoài không khí.
 Nhỏ lên vệt máu vừa khô 2 giọt acid acetic đậm đặc, đậy hỗn hợp bằng lamelle và đun nóng
từ từ tới khi bắt đầu sôi (lúc xuất hiện những bọt khí).
 Để nguội,
 Quan sát dưới kính hiển vi tinh thể hình bình thành tạo thành.
 TÍNH CHẤT PROTEIN PHỨC TẠP – PHOPHOPROTEIN (CASEIN)

- Nguyên tắc
 Casein trong sữa tươi ở dưới dạng muối calci hòa tan, khi acid hóa dung dịch bằng acid acetic
1%, muối calci bị phân ly và casein bị tủa dưới dạng tủa bông.
 Nếu thừa acid, pH môi trường thấp hơn điểm đẳng điện của casein (pI = 4,7) thì phân tử
protein lại tích điện nên casein có thể hòa tan trở lại.
 Thủy phân tủa Casein bởi nhiệt trong môi trường kiềm từ ½ giờ đến 1 giờ sẽ giải phóng acid
phosphoric (dưới dạng phosphat)
 Định tính acid phosphoric bằng phản ứng với thuốc thử ANSA và acid molypdic.
 TÍNH CHẤT PROTEIN PHỨC TẠP – CROMOPROTEIN (HEMOGLOBIN)

- Tiến hành
 Chiết xuất casein từ sữa
 Cho vào ống nghiệm 2 mL sữa và 2 mL nước cất, nhỏ từng giọt acid acetic 1% đến khi
casein xuất hiện dưới dạng tủa bông thì ngưng.
 Lọc lấy tủa, rửa tủa 3–5 lần bằng nước cất.
 Lấy một ít tủa làm phản ứng màu tìm protein (như phản ứng biurê, Adamkiewicz,…).
 TÍNH CHẤT PROTEIN PHỨC TẠP – CROMOPROTEIN (HEMOGLOBIN)

 Thủy phân casein

 Hòa tan phần tủa casein trong một ống nghiệm với 3 ml NaOH hay KOH 10%.
 Đậy kín ống nghiệm, gắn sinh hàn khí.
 Đun cách thủy sôi từ ½ –1 giờ.
 Để nguội, trung hòa dịch thủy phân bằng acid nitric đậm đặc (2–5 giọt) đến khi dịch này
phản ứng acid yếu với giấy quỳ xanh.
 Lọc bỏ tủa.
 Định tính acid phosphoric
 Cho vào ống nghiệm 1 mL dịch thủy phân.
 Thêm vào 0,4 mL thuốc thử ANSA, 1 mL acid molypdic và 2 mL nước cất. Lắc đều
 Quan sát: dung dịch chuyển sang màu xanh.
 TÍNH CHẤT PROTEIN PHỨC TẠP – PHOSPHOPROTEIN (CASEIN)

- Nguyên tắc
 Hemoglobin có phần protein và nhóm ngoại là hem. Cấu tạo của hem gồm nhân
protoporphyrin kết hợp với ion sắt hóa trị 2.
 Khi oxy hóa, ion sắt trong hem nếu kết hợp với hydroxyd thì tạo thành hematin, còn kết hợp
với clorid thì tạo nên hemin.
- Tiến hành
 Tạo 1 làn máu mỏng từ máu tươi (BM chuẩn bị) trên lame kính, để khô ngoài không khí.
 Nhỏ lên vệt máu vừa khô 2 giọt acid acetic đậm đặc, đậy hỗn hợp bằng lamelle.
 Đun nóng từ từ tới khi bắt đầu sôi (lúc xuất hiện những bọt khí).
 Để nguội, quan sát sự tạo thành tinh thể dưới kính hiển vi.
ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU (KỸ THUẬT MESTREZAT)
 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU – PHƯƠNG PHÁP MESTREZAT

- Nguyên tắc
 Protein tác dụng với acid tricloacetic cho tủa trắng.
 So độ đục với gam mẫu có những nồng độ protein khác nhau đã biết trước và được tiến hành
trong điều kiện tương tự.
- Thuốc thử
 Acid tricloacetic 1/3
 Dung dịch protein chuẩn 1‰
 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TOÀN PHẦN – PHƯƠNG PHÁP BIURET

- Tiến hành
 Lấy 11 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 10 và ống đo, cho theo thứ tự các thuốc thử theo bảng sau
đây:

Ống
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Đo
Thuốc thử
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 0
Dd protein chuẩn (mL) 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 0
Nước cất (mL) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5,0
Nước tiểu trong (mL) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
Cl3CCOOH 1/3 (mL) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 ?
Lượng protein (g/L)

 Lắc đều, để nghỉ 15 phút. Sau đó lắc kỹ và so sánh độ đục của ống đo với gam mẫu.
 Nếu độ đục của ống đo đậm đặc hơn giai mẫu, pha loãng ống đo theo tỷ lệ 1/2, 1/5, 1/10,…
ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TOÀN PHẦN BẰNG PHƯƠNG
PHÁP BIURÊ
 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TOÀN PHẦN – PHƯƠNG PHÁP BIURET

- Nguyên tắc
 Protein huyết thanh tạo phức có màu với muối đồng trong môi trường kiềm (phản ứng biurê)
 Độ hấp thu của phức này tỉ lệ với lượng protein toàn phần trong huyết thanh.
- Giá trị tham khảo: 6,2–8,0 g/100 mL (62–80 g/L)
- Thuốc thử
 Kali iodid 30 mmol/L
 Kali natri tartrat 32 mmol/L
 Đồng sulfat 12 mmol/L
 Natri hydroxid 200 mmol/L
 Dung dịch chuẩn albumin bò 6 g/100 mL (60 g/L)
 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TOÀN PHẦN – PHƯƠNG PHÁP BIURET
 
- Tiến hành
 Cho vào 3 ống nghiệm các thuốc thử theo bảng sau:
  Trắng Chuẩn Thử
Thuốc thử (mL) 1 1 1
Nước cất (l) 10    
10  
Dung dịch chuẩn (l)
10
Huyết thanh (l)
 Trộn đều, ủ khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng.
 Đọ độ hấp thu (A).
 Tính toán kết quả theo công thức:
ĐỊNH LƯỢNG CALCI TRONG MÁU BẰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐO QUANG
 ĐỊNH LƯỢNG CALCI TRONG MÁU

- Nguyên tắc
 Ở môi trường pH trung tính, ion Ca2+ phản ứng với Arsenazo (III) một phức hợp mãu có độ háp
thu cực đại ở bước sóng 650 nm.
 Độ hấp thu của phức chất tỷ lệ với nồng độ của calci trong mẫu thử.
- Giá trị tham khảo: 8,8–10,2 mg/dL (88–102 mg/L; 2,2–2,55 mmol/L)
- Khoảng tuyến tính:  16mg/dL (160 mg/L; 4 mmol/L)
- Thuốc thử
 Dung dịch đệm MES pH 6,50 100 mmol/L
 Arsenazo 200 mol/L
 Dung dịch chuẩn calci 10 mg/dL (100 mg/L; 2,5 mmol/L)
 ĐỊNH LƯỢNG CALCI TRONG MÁU
 
- Tiến hành
 Cho vào 3 ống nghiệm các thuốc thử theo bảng sau:
  Trắng Chuẩn Thử
Thuốc thử (mL) 1 1 1
Nước cất (l) 10    
10  
Dung dịch chuẩn (l)
10
Huyết thanh (l)

 Trộn đều, ủ khoảng 5 phút ở nhiệt độ phòng.

 Đọ độ hấp thu (A) ở bước sóng 650 nm.
 Tính toán kết quả theo công thức:
ĐỊNH LƯỢNG CLO TRONG MÁU BẰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐO QUANG
 ĐỊNH LƯỢNG CLO TRONG MÁU

- Nguyên tắc
 Ion clorid phản ứng với dung dịch thủy ngân (II) thiocyanat tạo thành phức có màu.
 Độ hấp thu của phức chất có màu này tỉ lệ với nồng độ clorid.
- Giá trị tham khảo: 98–107 mEq/L (348–380 mg/100 mL; 98–107 mmol/L)
- Khoảng tuyến tính:  16mg/dL (160 mg/L; 4 mmol/L)
- Thuốc thử
 Thủy ngân (II) thiocyanat 2 mmol/L
 Sắt (III) nitrat 20 mmol/ L
 Acid nitric 29 mmol/ L
 Dung dịch Cl− chuẩn 100 mEq/L (355 mg/100 mL; 100 mmol/L)
 ĐỊNH LƯỢNG CLO TRONG MÁU
 
- Tiến hành
 Cho vào 3 ống nghiệm các thuốc thử theo bảng sau:
  Trắng Chuẩn Thử
Thuốc thử (mL) 1 1 1
Nước cất (l) 10    
10  
Dung dịch chuẩn (l)
10
Huyết thanh (l)
 Trộn đều, ủ khoảng 5 phút ở nhiệt độ phòng.
 Đọ độ hấp thu (A) ở bước sóng 480 nm.
 Tính toán kết quả theo công thức:
Address: Contact Number: Email id:
Bộ môn Sinh hóa Mobile No : 0943076841 : ********** tqvuong@ump.edu.vn