Chương 1: Protein

Thí nghiệm 1. Định tính alpha-amino acid bằng phản ứng ninhydrin
-Tiến trình
+Chuẩn bị sẵn dung dịch protein trứng trước khi làm thí nghiệm
+Tiếp tục pha thêm dung dịch glycine 0,02% và dung dịch thuốc thử ninhydrin 0,1% .
+Cho 1mL dd glycine 0,02% vào ống nghiệm 5.1.1 và 1mL dung dịch protein trứng vào
ống nghiệm 5.1.2.
+Thêm mỗi ống nghiệm 5 giọt dung dịch thuốc thử ninhydrin 0,1%
+Đun nóng 2 ống nghiệm trong 1 phút bằng đèn cồn
-Kết quả
+Ống 1: Xuất hiện màu xanh tím nhạt
+Ống 2: Xuất hiện màu xanh tím đậm

-Giải thích: Sự xuất hiện của màu xanh tím là do phản ứng của ninhydrin và amino acid
Thí nghiệm 2: Định tính protein bằng phản ứng biuret:
-Tiến trình
+Chuẩn bị dung dịch sodium hidroxide 10% và dung dịch copper sulfate 1% trước khi
vào thí nghiệm
+Cho 0,1g tinh thể urea vào ống nghiệm số 5.2.1, 1mL dung dịch protein trứng vào ống
nghiệm 5.2.2
+Đun nóng ống 5.2.1 trên đèn cồn cho đến urea nóng chảy rồi bắt đầu đông cứng lại, sau
đó để nguội
+Thêm vào 2 ống mỗi ống 1mL dung dịch NaOH 10% và 1 giọt CuSO4 1% sau đó lắc
đều.
-Kết quả
+Ống 1:Xuất hiện màu tím hồng
+Ống 2:Xuất hiện màu tím
-Giải thích:Do trong môi trường kiềm, các liên kết peptide phản ứng với sulfate đồng tạo
phức chất màu tím. Màu của phản ứng phụ thuộc vào lượng đồng và số lượng các liên kết
peptide trong phân tử chất tham gia phản ứng.
+Ống 1: Biuret được tạo thành từ urea trong điều kiện nhiệt độ cao. Khi môi trường kiềm
chứa Cu2+ thì sẽ hình thành màu tím hồng trong đ biuret.

+Ống 2: Dung dịch protein trứng chuyển thành dd có màu xanh tím trong môi trường
kiềm có chứa Cu2+.

Thí nghiệm 3. Tìm điểm đẳng điện của protein bằng phương pháp tạp pH khác nhau
Tiến trình
- Dung dịch Na2HPO4 0,2M : Cân 71,6314g Na2HPO4.12H2O, định mức bằng nước cất
cho đủ 1000mL dung dịch.
- Dung dịch C6H8O7 0,1M : Cân 21,0137g C6H8O7.H2O, định mức bằng nước cất cho đủ
1000mL dung dịch, bảo quản trong lọ màu nâu.
Lấy 3 ống nghiệm : đánh số theo thứ tự : 5.3.1; 5.3.2; 5.3.3
Ống 5.3.1: 0,34mL dd Na2HPO4 0,2M + 0,66mL dd C6H8O7 0,1M (pH =3,7)
Ống 5.3.2: 0,48mL dd Na2HPO4 0,2M + 0,52mL dd C6H8O7 0,1M (pH =4,7)
Ống 5.3.3: 0,66mL dd Na2HPO4 0,2M + 0,34 mL dd C6H8O7 0,1M (pH =5,7)
Lắc đều ba ống nghiệm và thêm vào mỗi ống nghiệm 1mL dung dịch protein trứng, lắc
nhẹ và thêm mỗi ống 1mL cồn 96 , lắc đều, để yên 5 phút.
Kết quả
Cả ba ống nghiệm đều xuất hiện kết tủa tuy nhiên mức độ kết tủa khác nhau :
Độ kết tủa từ thấp đến cao là : 5.3.3< 5.4.1 < 5.3.2
pHi của albumine trứng là : 4.6
Giải thích
Ống 5.3.1 (pH = 3,7) do có lượng lớn Na2HPO4 và ít C6H8O7, nơi có pH thấp, dẫn đến
sự xuất hiện kết tủa. Tuy nhiên ở ống 5.3.2 (pH = 4,7) lượng Na2HPO4 tăng lên so với
ống 5.3.1, dẫn đến tăng độ pH. Sự tăng độ pH gần với điểm đẳng điện của albumine là 4.6
do đó ống 5.3.2 là ống có mức độ kết tủa cao nhất . Tiếp theo ống 5.3.3 (pH = 5,7): Nơi
đây có nhiều C6H8O7 hơn so với Na2HPO4, dẫn đến tăng độ pH so với ống 5.3.2. và
5.3.1. Độ pH cao làm giảm độ kết tủa, vì vậy ống này có mức độ kết tủa thấp nhất trong
ba ống.
Thí nghiệm 4. Kết tủa protein bằng muối trung tính (NH4)2SO4 và bằng cách đun sôi trong
các môi trường khác nhau.
a. Kết tủa thuận nghịch protein
Lấy 2 ống nghiệm, đánh số 5.4.1a và 5.4.2a, cho vào mỗi ống 1 mL dung dịch lòng trắng
trứng nguyên chất
Ông 5.4.1a: cho vào 1mL dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa, lắc nhẹ, xuất hiện các thể vẩn
trắng globuline.
Ông 5.4.2a : thêm từ từ tinh thể (NH4)2SO4, lắc cho đến khi dung dịch trở thành bão hòa
(NH4)2SO4
Kết quả

Sau đó thêm nước cất vào từng ống nghiệm, khuấy nhẹ từ từ cho đến khi tủa tan hoàn
toàn, tạo thành dung dịch protein trong suốt.
Kết quả
Giải thích
Ở ống 5.4.1a thể vẩn trắng globuline xuất hiện do tương tác giữa protein globuline trong
lòng trắng trứng và ion sulfate (SO₄²⁻) từ (NH₄)₂SO₄. Sự kết tủa xảy ra khi protein kết
hợp với ion sulfate, tạo thành liên kết hydrogen, dẫn đến sự kết tủa. Tuy nhiên ở ống
5.2.2a có thể xảy ra sự tương tác giữa protein và tinh thể (NH₄)₂SO₄ mà không dẫn đến
kết tủa đáng kể. do dung dịch ở ống đã đủ bão hòa (NH₄)₂SO₄, và sự kết tủa không xảy ra
do nồng độ ion sulfate trong dung dịch đã đạt mức bão hòa.
Sau khi nước cất vào từng ống nghiệm, khuấy nhẹ từ từ cho đến khi tủa tan hoàn toàn, tạo
thành dung dịch protein trong suốt do sự tan của tủa .
b. Kết tủa không thuận nghịch
Lấy 5 ống nghiệm đánh số và thêm mỗi ống 1mL dung dịch protein trứng, sau đó tiến
trình như sau
- Ống 5.4.1b : đun nóng
- Ống 5.4.2b: thêm 2 giọt CH3COOH 1% đun nóng
- Ống 5.4.3b: Thêm 2 giọt CH3COOH 10% đun nóng ( có thể đến sôi )
- Ống 5.4.4b: Thêm 2 giọt CH3COOH 10% và 2 giọt NaCl bão hòa, đun nóng.
- Ống 5.4.5b: Thêm 1 giọt NaOH 10% đun nóng ở khoảng 50- 55 độ C ( có thể đến sôi ).

Giải thích hiện tượng

Ống 5.4.1b (đun nóng): Khi đun nóng dung dịch protein trứng sẽ làm thay đổi cấu trúc
protein, các liên kết như liên kết hydrogen, liên kết kỵ nước bị đứt, các phân tử protein bị
đông tụ, tạo nên kết tủa.
Ống 5.4.2b (thêm CH3COOH 1% và đun nóng): Việc thêm CH3COOH (acetic acid) 1%
vào dung dịch protein trứng và đun nóng làm giảm độ pH của dung dịch. Protein có khả
năng phản ứng với axit và tạo thành các kết tủa. Trong trường hợp này, quá trình đông
đặc protein diễn ra như trong ống 5.4.1b, nhưng có thể xảy ra nhanh hơn do tác động của
axit.
Ống 5.4.3b (thêm CH3COOH 10% và đun nóng): Việc thêm CH3COOH 10% vào dung
dịch protein trứng và đun nóng cũng làm giảm độ pH. Sự tăng độ axit hơn so với ống
5.4.2b có thể gây ra tác động mạnh hơn đến cấu trúc protein, làm tăng tốc độ đông đặc
protein. Nếu đun nóng đến sôi, sẽ hình thành một kết tủa rắn.
Ống 5.4.4b (thêm CH3COOH 10% và NaCl bão hòa, đun nóng): Việc thêm CH3COOH
10% và NaCl bão hòa vào dung dịch protein trứng và đun nóng làm phản ứng kết tủa diễn
ra nhanh chóng trong điều kiện môi trường gần với điểm đẳng điện của protein và với sự
có mặt của chất điện ly là NaCl
Ống 5.4.5b (thêm NaOH 10% và đun nóng): Việc thêm NaOH 10% vào dung dịch protein
trứng và đun nóng làm tăng độ kiềm của dung dịch làm cho cấu trúc protein bị phá vỡ và
protein tan trong dung dịch kiềm. Tuy nhiên, nếu đun nóng đến sôi, protein có thể trải qua
quá trình đông tụ do tác động nhiệt.
Kết luận
- Đun nóng dung dịch protein trứng có thể gây ra quá trình đông tụ và hình thành kết tủa.
- Sự tác động của axit (CH3COOH)có thể làm tăng tốc độ và mạnh hóa quá trình đông tụ
- Sự có mặt của chất điện ly NaCl có thể làm tăng tốc độ và mạnh hóa quá trình đông tụ .
- Sự tác động của kiềm (NaOH) có thể làm phá vỡ cấu trúc protein và làm tan protein
trong dung dịch kiềm.

Thí nghiệm 5: Định lượng protein niệu (Kỹ thuật Mestrezat)

 Tiến trình
- Lấy 11 ống nghiệm đánh số từ 5.5.1-5.5.11(M)
- Cho thuốc thử vào mỗi ống:
Ống 5.5. 5.5. 5.5. 5.5. 5.5. 5.5. 5.5. 5.5. 5.5. 5.5.1 5.5.11(
nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 M)
Protein 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 0
mẫu(mL)
Nước 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 0
cất(mL)
Nước 0 5,0
tiểu
trong(m
L)
TCA 5% 2
(mL)
- Lắc đều, để yên 15p
- So sánh ống 5.5.11(M) với các ống còn lại, lấy 2 ống có độ trong gần giống với
ống 5.5.11(M)
- Để 3 ống lên hàng chữ xoay ra phía có ánh sáng để so sánh độ mờ chữ qua ống

*Kết quả

Kết quả so sánh: Ống 5.5.11(M) với ống 5.5.1 và 5.5.2

 Độ mờ giảm dần: 5.5.11(M), 5.5.1, 5.5.2
 Ống mẫu không có protein