Anthranoid

Dicloromethan (DCM) hay chloroform: dung môi chiết

2.1. Định tính anthranoid bằng phản ứng Borntrager
2.1.1. Định tính anthranoid dạng tự do (dạng aglycon, anthraquinon)
Lấy khoảng 0,5 g bột dược liệu cho vào 1 erlen 50 ml, thêm dicloromethan (hoặc
chloroform) ( vì aglycon tan tốt trong dung môi kém phân cực nên khi ta ngâm
dược liệu vào chloroform, anthranoid ở dạng tụư do dễ hòa tan trong chlorofom->
thu được dịch chiết có anthranod dạng tự do)
cho thấm đều và ngập mặt dược liệu khoảng 1 cm (# 20 ml), lắc kỹ, gạn và lọc lấy
dịch chiết
dicloromethan (DCM)
Lấy 2 ml dịch DCM cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml dung dịch NaOH 10%, lắc kỹ.
Nếu lớp kiềm có màu đỏ: phản ứng dương tính ( nhóm OH ở vị trí 1,8 của
anthranoid sẽ tác dụng với kiềm cho ra ra màu đỏ, nằm trên vì tỉ trọng của DCM sẽ
nặng (>1) nằm ở dưới))
2.1.2. Định tính anthranoid ở dạng kết hợp (dạng glycosid, anthraglycosid))
Cân 1 g bột dược liệu, cho vào 1 bình nón 100 ml, thêm 50 ml nước đun sôi, lắc
kỹ, để nguội.
- Lọc lấy dịch chiết cho vào 1 bình nón, thêm 2 ml dung dịch acid sulfuric 25
%, ( để thủy phân anthranoid từ dạng kết hợp về dạng tự do vì yêu cầu của
phản ứng là anthanoid phải ở dạng tự do) đun cách thủy 95 ºC trong 10 phút.
Làm nguội dịch thủy phân dưới vòi nước, cho vào bình lắng gạn, thêm vào
10 ml DCM và lắc kỹ. Gạn lấy lớp DCM (lớp dưới), lấy 2 ml dịch chiết
DCM cho vào ống nghiệm lắc với 2 ml NaOH 10%. ( giải thích giống ở trên
cụ thể là Các dẫn chất này có nhóm –OH ở cả vị trí Carbon số 1 và số 8 nên
chúng có thể tan trong NaOH, bị khử tạo thành các Phenolat có màu đỏ tan
trong nước.)

Nếu lớp kiềm có màu đỏ: phản ứng dương tính. Phần dịch chiết DCM còn lại được
dùng để định tính tiếp acid chrysophanic ở mục 2.1.3.
2.1.3. Định tính acid chrysophanic (chrysophanol)
Gộp các dịch chiết DCM (ở mục 2.1.1 và 2.1.2) vào 1 bình lắng gạn. Lấy riêng 2
ml dịch
chiết dùng làm mẫu thử cho sắc ký lớp mỏng. Phần còn lại chiết với dung dịch
NH4OH 10 % ( vì acid chrysophanic là có nhóm thế ở vị trí số 3 là methyl nên nó
có tính acid yếu chỉ phản ứng với kiềm mạnh nên ta phải loại anthranoid có tính
acid mạnh( là rhein> Emodin > Chrysophanol) bằng cạn cho phản ứng với
NH4OH 10%)
nhiều lần, mỗi lần 20 ml cho đến khi lớp amoniac không còn màu hồng nữa thì
ngưng (loại bỏ
dịch amoniac sau mỗi lần chiết). ( ở những lần đầu tiên anthranoid có tính acid
nên sẽ phản ứng với NH3 làm lớp NH3 có màu đỏ khi ta lắc rồi chiết nhiều lần
NH3 cho đến khi hết màu đỏ tức đã hết acid trong anthranoid ( là Rhein ) Thêm
vào dịch DCM còn lại 1-5 ml dung dịch NaOH 10 %
và lắc kỹ. Nếu lớp NaOH có màu hồng tới đỏ thì dược liệu có chứa acid
chrysophanic.( Để xác nhận sự có mặt của Chysophanol, ta tiếp tục cho NaOH
là một kiềm mạnh vào tác dụng với dung dịch Cloroform. Khi này,
Chrysophanol có tính acid yếu sẽ phản ứng tạo muối phenolat có màu hồng đỏ
=> chứng tỏ dược liệu chứa Acid Chysophanol )
2.2. Thử nghiệm vi thăng hoa
Cho một ít bột dược liệu (Nhàu hoặc Đại hoàng) vào 1 chén nung nhỏ. Đặt chén
nung vào nồi cách cát (được giữ nhiệt độ ở 140 – 180 oC)( Dẫn chất anthraquinon
dễ thăng hoa khi đun nóng) và đảo đều dược liệu cho đến khi không còn hơi nước
bốc lên nữa. Đậy 1 phiến kính lên miệng chén, trên phiến kính đặt 1 miếng bông
ẩm đểlàm lạnh(Đặt bông tẩm nước lên lam kính để làm lạnh, khi đó dẫn chất
anthraquinon sẽ dễ ngưng tụ hơn), thỉnh thoảng thay miếng bông này. Sau khoảng
10 –15 phút, dẫn chất anthraquinon sẽ thăng hoa và bám vào mặt dưới của phiến
kính làm cho phiến kính có màu vàng.Lấy phiến kính soi dưới kính hiển vi (vật
kính 10 ) sẽ thấy các tinh thể hình kim màu vàng.Nhỏ vào phiến kính 1 giọt dung
dịch NaOH 10 % thì các tinh thể này sẽ tan thành dung dịch có màu hồng. Cũng có
thể dùng 1 que bông nhỏ (đã được làm ẩm với dung dịch NaOH 10 %) quẹt nhẹ ở
nơi có các tinh thể. Que bông sẽ có màu hồng đến đỏ(Chất màu vàng này là dẫn
chất 1,8 dihydoxy anthraquinon, có thể là Cryzophanol, Aloe emodin, Rein, Reum
emodin, ...
-Màu đỏ xuất hiện sau khi nhỏ 1 giọt NaOH lên phiến kính có dẫn chất
anthraquinon là do có phản ứng Borntrager xảy ra.)
2.3. Sắc ký lớp mỏng
- Chuẩn bị: tương tự như mục 2.4.1 bài Dược liệu chứa saponin.
- Pha tĩnh: Bản mỏng silica gel F254 tráng sẵn (Merck), kích thước 2,5  10 cm.
- Mẫu thử: lấy 2 ml dịch DCM đã chuẩn bị ở phần 2.1.3 cho bay hơi dung môi còn
khoảng 0,2 ml (chấm thành vạch 1 mm  3 mm)
- Dung môi khai triển: S2 (xem phần 1.1).
- Phát hiện: sau khi khai triển, bản mỏng được để bay hết dung môi, quan sát vết
dưới đèn
UV 254, 365 nm; sau đó đặt bản mỏng vào bình chứa hơi amoniac đặt trong tủ hốt,
quan
sát; sau đó nhúng với thuốc thử NaOH 10 %. Các vết anthranoid sẽ có màu đỏ.
- Ghi nhận và đánh giá kết quả: Chụp hình và vẽ lại sắc ký đồ và tính giá trị Rf của
các vết

Coumarin
. Chiết xuất 
Phương pháp 1 (áp dụng cho dược liệu là thân, rễ) Lấy 2 g bột dược liệu (Bạch chỉ,
Tiền hồ) cho vào 1 bình nón 100 ml, thêm 30 ml cồn 96 %( Chiết xuất cỏ tranh
bằng cồn cao độ vì hoạt chất mong muốn thu được là coumarin, mà coumarin kém
phân cực.Nên phải dùng cồn ) và đun sôi trên cách thủy 10-15 phút. Lọc
lấydịchchiết để thực hiện các phản ứng định tính.
 Phương pháp 2 (áp dụng cho dược liệu là lá)
Lấy 2 g bột dược liệu (lá Ba dót) cho vào 1 bình nón 100 ml, thêm 40 ml cồn 96
% và đun sôi trên cách thủy trong 10-15 phút. Lọc lấy dịch chiết cho vào 1 bình
nón khác. Thêm vào dịch lọc này một ít than hoạt, lắc nhẹ và đun cách thủy trong 3
phút. Lọc nóng qua giấy lọc, thu dịch lọc để thực hiện các phản ứng định tính (ở
mục 2.2).
 Lưu ý: Lượng than hoạt cho vừa đủ sao cho dịch chiết giảm màu xanh chlorophyll
nhưng không mất màu hoàn toàn
2.2. Định tính coumarin
2.2.1. Phản ứng đóng mở vòng lacton
Cho vào 3 ống nghiệm bằng nhau (kích thước 1,6  16 cm), mỗi ống 2 ml dịch lọc
ở 2.1: -
Ống 1: thêm 4 ml nước cất, dung dịch trở nên đục.
- Ống 2: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10 %. Đun cách thủy trong 2-3 phút. Bổ
sung nước cất cho đến khi thể tích bằng ống 1, quan sát sẽ thấy ống 2 trong hơn
ống 1. ( Do trong cỏ tranh có coumarin có vòng lacton (ester nội) nên coumarin dễ
bị mở vòng bởi kiềm tạo thành muối tan trong nước, nên màu trong hơn ống 1)
- Ống 3: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10 %. Đun cách thủy trong 2-3 phút.
Tiếp tục acid hóa ống 3 với vài giọt HCl đđ (thử bằng giấy pH), thêm nước cất cho
đến thể tích bằng ống 2 sẽ thấy ống này đục hơn ống 2
( khi cho acid vào sẽ xảy ra sự acid hóa làm vòng lacton đóng lại và dd đục)
2.2.2. Sự tăng huỳnh quang trong môi trường kiềm dưới tác dụng của tia UV
Lấy 2 ml dịch chiết cồn (từ mục 2.1), thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10 %, ( vì
coumarin trong mt kiềm sẽ mở vòng)đun cách thủy trong 3 phút rồi nhỏ vài giọt
dịch chiết này lên 1 tờ giấy lọc, sấy khô dung môi và lặp lại như trên 4 lần nữa.
Sấy khô hoàn toàn. Che nửa vết dịch chiết bằng 1 miếng kim loại rồi đem soi đèn
UV 365 nm trong 1 phút. ( coumarin trong môi trường kiềm mở vòng ở dạng
coumarinat chất này có cấu dạng cis ( phát huỳnh quang kém) nên khi ta chiếu UV
( cung cấp năng lượng) thì từ cấu dạng cis sẽ chuyển sang trans là ( coumarat) chất
này có khả năng phát huỳnh quang mạnh hơn)( Lấy miếng kim loại ra sẽ thấy nửa
không bị che phát quang sáng hơn nửa bị che. Nếu tiếp tục chiếu UV sau vài phút
thì cường độ phát quang của 2 nửa sẽ như nhau.
2.2.3. Thử nghiệm vi thăng hoa
Cho 1-2 g bột dược liệu được xay mịn vào 1 chén nung nhỏ. Đun cách cát, đảo
đều dược liệu cho bay hết hơi nước rồi đậy chén bằng 1 phiến kính trên có đặt sẵn
1 miếng bông gòn thấm nước lạnh,( giải thích giống trên) tiếp tục đun khoảng 5-10
phút nữa (thỉnh thoảng thay bông lạnh). Lấy phiến kính ra, để nguội rồi quan sát
dưới kính hiển vi (10) sẽ thấy nhiều tinh thể không màu.( hình que)
2.2.4. Phản ứng với thuốc thử diazonium
Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết cồn (từ mục 2.1), thêm 0,5 ml dung dịch
NaOH 5 %. Đun cách thủy trong 2 phút rồi để nguội hoặc làm lạnh bằng vòi nước,(
vì điều kiện của phản ứng này là phải xảy ra trong môi trường kiềm và to thấp nếu
thay đổi phản ứng sẽ không xảy ra) thêm từ từ từng giọt thuốc thử diazonium cho
đến khi xuất hiện màu đỏ hoặc đỏ cam