Chương 10

SẮC KÝ LỎNG
Th.s Nguyễn Thị Thùy Linh

4/25/2020 1
Lịch sử 1906

Kỹ
thuật Ete dầu hỏa
sắc
ký

CaCO3

4/25/2020 2
4/25/2020 3
 Mục tiêu học tập
1. Trình bày được sơ đồ hệ thống HPLC và
vai trò của từng bộ phận.
2. Trình bày được cơ chế tách và các pha
dùng trong Sắc ký phân bố( Sắc ký phân
bố pha thuận và sắc ký phân bố pha đảo)
3. Trình bày được ứng dụng của HPLC
4. Nêu được cơ chế tách và đánh giá được
phạm vi ứng dụng của Sắc ký lớp mỏng.

4/25/2020 4
Sắc ký lỏng hiệu năng cao-HPLC
(High Perfomance Liquid Chromatography)
Khái niệm:
 HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các
chất phân tích di chuyển qua cột chứa các
hạt pha tĩnh dưới tác động của Pha động
là chất lỏng.
Tốc độ di chuyển liên quan tới Hằng số
phân bố K của chúng giữa 2 pha và quyết
định rửa giải các chất ra khỏi cột.
4/25/2020 5
4/25/2020 6
 1. Hệ thống HPLC
 Hệ thống cấp pha động
 Bơm cao áp
 Bộ phận tiêm mẫu
 Cột và pha tĩnh
 Detector
 Bộ phận xử lý dữ liệu
 Bình đựng thải

4/25/2020 7
4/25/2020 8
 1.1 Hệ thống cấp pha động
- Pha động trong HPLC thường là các dung
dịch đệm, nước tinh khiết.
- MP là hỗn hợp các dung môi hòa tan vào
nhau các thành phần được đong theo thể
tích, trộn kĩ và lọc bỏ các tiểu phân >
0,45µm.
??? Tại sao phải loại bỏ khí hòa tan trong
pha động?

4/25/2020 9
Có bọt khí Giảm hiệu lực cột
Biến dạng pic
Nhiễu đường nền

Hai chế độ dung môi:

• Chế độ đẳng dòng(isocratic)
• Chế độ Gradient

4/25/2020 10
 isocratic

Gradient

4/25/2020 11
4/25/2020 12
4/25/2020 13
Hai kiểu thực hiện chương trình dung môi

Chương trình dung môi ở áp suất thấp

Dung môi 1

Bộ phận Bơm Van mẫu

Dung môi 2
hòa trộn

Dung môi 3

4/25/2020 14
Hai kiểu thực hiện chương trình dung môi

Chương trình dung môi ở áp suất cao

Dung môi 1 Bơm 1

Bộ phận
Dung môi 2 Bơm 2 Van mẫu
hòa trộn

Dung môi 3 Bơm 3

4/25/2020 15
 1.2 Hệ thống bơm
Tạo áp suất cao để đẩy pha động đi với tốc
độ dòng hằng định.
 Yêu cầu:
• Hoạt động ở áp suất cao >5000 psi
• Đảm bảo lưu lượng lặp lại
• Không bị ăn mòn

4/25/2020 16
 Các loại bơm
• Bơm đẩy một pittông
• Bơm làm đầy nhanh
• Bơm kép đẩy kéo

4/25/2020 17
 1.3 Hệ tiêm mẫu
- Dùng van tiêm mẫu
- Tiêm mẫu tự động

4/25/2020 18
 1.3 Hệ tiêm mẫu

1. Mẫu vào
2. Ra
3. Vòng chứa mẫu
4. Dung môi vào
5. Cột
6. Tiêm

4/25/2020 19
 1.4 Cột sắc ký và pha tĩnh
• Cột nhồi: 3, 5, 10 µm
• Cột bảo vệ
• Pha tĩnh

4/25/2020 20
4/25/2020 21
 1.5 Detector
• Dựa vào đáp ứng chọn lọc với chất phân
tích: Detector UV-ViS, huỳnh quang
• Dựa vào tính chất chung của chất pt trong
pha động: Detector chỉ số khúc xạ, độ dẫn
điện.

4/25/2020 22
 Yêu cầu đối với Detector
 Đáp ứng nhanh và lặp lại
 Độ nhạy cao
 Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng
 Khoảng tuyến tính rộng
 Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng

4/25/2020 23
 Một số loại detector chủ yếu
• Detector hấp thụ UV-VIS
• Detector huỳnh quang
• Detector chỉ số khúc xạ
• Detector tán xạ bay hơi
• Detector đo dòng
• Detector độ dẫn

4/25/2020 24
 Detector hấp thụ UV- VIS
- Detector đo ở bước sóng cố định: sử dụng
kính lọc để chọn bước sóng
Nguồn sáng:
đèn thủy ngân và đèn Vonfram chọn 1 số bước
sóng: 254, 280, 334, 436 nm
 Ưu điểm: rẻ tiền
 Nhược điểm: kém linh hoạt (chất phân tích
không hấp thụ các ƛ này thì không phát hiện
được hoặc nếu hấp thụ yếu thì giới hạn phát
hiện thấp.
4/25/2020 25
 Detector hấp thụ UV- VIS
- Detector đo ở bước sóng thay đổi:
Nguồn sáng và thiết bị đơn sắc hóa được nối với
ống nhân quang → chuyển tín hiệu quang thành
tín hiệu điện.
Nguồn sáng: Đèn D2 190 – 380 nm
Đèn wonfram 400-800 nm
Đèn Deuterium ARC 190-800nm

4/25/2020 26
4/25/2020 27
4/25/2020 28
 Detector hấp thụ UV- VIS
- Detector mảng diod:
Nguồn sáng: Đèn D2 190 – 380 nm
Đèn wonfram 400-800 nm
Đèn Deuterium ARC 190-800nm
Sử dụng một hay hai mảng Diod(linh kiện bán dẫn) có rất
nhiều các diod đóng vai trò như đầu dò để nhận tán xạ đã
tán sắc từ một cách tử kẻ vạch bằng laser (cách tử đặt sau
flow cell)
- đo được cả một dải sóng trong 1 thời điểm
- theo dõi đồng thời nhiều thành phần hấp thụ tại nhiều
bước sóng khác nhau.

4/25/2020 29
4/25/2020 30
4/25/2020 31
4/25/2020 32
4/25/2020 33
4/25/2020 34
 1.6 Bộ phận xử lý số liệu
 Máy ghi ( recorder)
 Máy tích phân ( Integrator)
 Máy tính và phần mềm điều khiển

4/25/2020 35
4/25/2020 36
4/25/2020 37
 2.Các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc
Sắc Sắc Sắc Sắc Sắc
ký
ký Ký Ký Ký Ký
Trao
Phân Hấp Loại Ái Đồng
Đổi
bố phụ cỡ lực Phân
ion

4/25/2020 38
 2.1 Sắc ký phân bố hiệu năng cao
• Sắc ký lỏng – lỏng: Pha tĩnh là lớp chất
lỏng bao quanh hạt chất mang rắn, đó là
chất nhồi cột. Quá trình lưu giữ chất phân
tích liên quan đến sự phân bố giữa hai
pha lỏng.
• Sắc ký pha liên kết: Pha tĩnh có liên kết
với bề mặt chất mang rắn( silica,..)

4/25/2020 39
 Pha tĩnh

Dẫn chất Dẫn chất

Bề mặt silica
Clorosilan Siloxan

4/25/2020 40
 Pha tĩnh liên kết

Tính chất phân cực của pha tĩnh phụ thuộc vào gốc R

4/25/2020 41
 Phân loại pha tĩnh
Pha tĩnh không Pha tĩnh phân cực:
phân cực: R là R là:

-CH2- (CH2)16- CH3: - CH2- (CH2)2- CN:

ODS(C18) cyano
-CH2- (CH2)6- CH3: - CH2- (CH2)2 – NH2:
OS( C8) amino
-CH2- (CH2)2- C6H5: -CH2CH2OCH(OH)CH2OH
Phenyl propyl
diol
4/25/2020 42
4/25/2020 43
 Chất phân tích

F1 F2

Pha tĩnh Pha động

F3

4/25/2020 44
 Hai kỹ thuật sắc ký phân bố
Sắc ký pha thuận: Sắc ký pha đảo:
- Pha tĩnh( SP): phân - Pha tĩnh (SP): không
cực ( cyano, amino, phân cực (C18, C8,
diol,…) phenyl propyl,…)
- Pha động( MP): dung - Pha động (MP): dung
môi ít phân cực môi phân cực (
(hexan, CHCl3, MeCN, MeOH, THF,
isopropanol,…) hệ đệm,…)

4/25/2020 45
 Để tách sắc ký, chọn 2 nguyên tắc sau:
1. Độ phân cực của chất phân tích hợp
với độ phân cực của pha tĩnh và khác
xa độ phân cực của pha động
2. Độ phân cực của chất phân tích hợp với
độ phân cực của Pha động và khác
nhiều với độ phân cực của pha tĩnh.
→ Sắc ký pha đảo phân tích:….
→ Sắc ký pha thuận phân tích:….

4/25/2020 46
 Thứ tự rửa giải
Sắc ký pha thuận (SP phân cực, MP ít phân cực)
phân cực trung bình
Kém phân cực phân cực

Thời gian

4/25/2020 47
 Thứ tự rửa giải
Sắc ký pha đảo (SP không phân cực, MP phân cực)

phân cực trung bình

kém phân cực
phân cực

Thời gian

4/25/2020 48
 Thứ tự rửa giải
Sắc ký pha thuận Sắc ký pha đảo
(MP ít phân cực) ( MP phân cực mạnh)

Thời gian Thời gian

Khi tăng độ phân cực của pha động thì thứ tự rửa giải có
thay đổi không? Thời gian lưu có thay đổi không? Giải thích?

4/25/2020 49
 SKPB Pha đảo
Độ phân cực tăng dần
C B A

Pha Pha động

tĩnh

Pha C B A Pha động

tĩnh

A B C

4/25/2020 50
 SKPB Pha thuận
Độ phân cực tăng dần
C B A

Pha Pha tĩnh

động

B A
Pha C Pha tĩnh
động

4/25/2020 51
Sắc ký pha thuận:
- Pha tĩnh( SP): phân cực
(cyano, amino, diol,…)
- Pha động( MP): dung môi ít
phân cực (hexan, CHCl3,
isopropanol,…)
- Chất phân tích: chất phân cực
và phân cực trung bình
- Thứ tự rửa giải:
Chất ít phân cực rửa giải ra
trước, chất phân cực trung
bình, chất phân cực rửa giải
sau cùng.
- Tăng độ phân cực pha động
tR giảm dần
4/25/2020
Sắc ký pha đảo:
- Pha tĩnh (SP): không phân
cực (C18, C8, phenyl propyl,…)
- Pha động (MP): dung môi
phân cực ( MeCN, MeOH,
THF, hệ đệm,…)
- Chất phân tích: chất kém
phân cực và phân cực trung
bình
- Thứ tự rửa giải: Chất phân
cực rửa giải ra trước, chất
phân cực trung bình, chất ít
phân cực rửa giải sau cùng.
- Tăng độ phân cực pha động
tR tăng lên
52
 Cách chọn pha tĩnh và pha động:
Với pha tĩnh: Dựa vào nhóm thế R của
dẫn xuất siloxan
Với pha động: Dựa vào trị số P’
Nếu pha động là hỗn hợp của 2 dung môi A
và B thì :
P’= P’A. TA + P’B. TB

4/25/2020 53
 Một số tính chất của dung môi dùng trong sắc ký lỏng
Giới hạn
Chỉ số Điểm sôi Độ nhớt Độ phân
TT Tên dung môi đo UV
khúc xạ (0oC) CP, 25oC cực(P')*
(nm)
1 n-hexan 190 1,372 69 0,3 0,1
2 Benzen 280 1,498 80 0,60 2,7
3 Metylen clorid 233 1,421 40 0,41 3,1
4 n-propanol 240 1,385 97 1,90 4,0
5 Tetrahydrofuran 212 1,405 66 0,46 4,0
6 Ethyl acetat 256 1,370 77 0,43 4,4
7 Cloroform 245 1,443 61 0,53 4,1
8 Aceton 330 1,356 56 0,30 5,1
9 Ethanol 210 1,359 78 1,08 4,3
10 Acid acetic - 1,370 118 1,1 6,0
11 Acetonitril 190 1,341 82 0,34 5,8
12 Methanol 205 1,326 65 0,54 5,1
13 Nước 190 1,333 100 0,89 10,2
4/25/2020 54
 Chất phân tích:
dựa vào nhóm chức
Hydrocacbon mạch thẳng < olefin <
hydrocacbon thơm < dẫn xuất halogen <
sulfid < ether < dẫn xuất nitro < este =
aldehyd= ceton <ancol = amin< sulfon<
sunfoxid< amid< acid carbonxylic< nước
Dựa vào chỉ số lgP (chỉ số dầu/nước)
Cs ( oc tan ol )
lg P ( oc tan ol / nuoc)  lg( )
Cs( nuoc)
lgP càng thấp, chất phân tích càng phân cực
4/25/2020 55
 Tại sao thường sử
dụng sắc ký phân bố
pha đảo?

4/25/2020 56
 Bài tập 1
Dự đoán thứ tự rửa giải các chất A, B, C
trong hỗn hợp với các điều kiện sau:
A: nitro benzen
B: acid benzoic
C: Clorua benzen
Điều kiện 1: Cột C8( 250×4,6 mm, 5µm)
Pha động: MeOH:H2O (50:50)
Điều kiện 2: Cột Lichrosorb CN( 250×4,6mm,5µm)
Pha động: n hexan- isopropanol( 90:10)
4/25/2020 57
 Bài tập 2 (đề thi K67)
Acid veleric và 1-aminopentan được phân tích bằng cột C8, sử
dụng dung môi pha động là methanol : đệm phosphat
(pH=2,5) = 20 : 80.
– Anh (chị) cho biết chương trình sắc ký trên là loại sắc ký
nào? Tại sao?
– Chất nào sẽ được rửa giải ra trước? Giải thích tại sao
Cho công thức cấu tạo của:
• Acid veleric CH3CH2CH2CH2COOH (pka = 4,5)
• 1-aminopentan CH3CH2CH2CH2CH2NH2 (pkb = 3,4)

4/25/2020 58
 Triển khai Sắc ký pha đảo:
Dùng để phân tích hỗn hợp chất hữu cơ có
M< 2000, trung tính và không phân cực
Xác định mục tiêu của phân tích
 Chọn kỹ thuật xử lý mẫu
 Chọn Detector thích hợp
 Chọn điều kiện Sắc ký

4/25/2020 59
 2.2. Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao
Là quá trình hấp phụ chất phân tích trên
bề mặt chất rắn.
SP: chất rắn phân cực
MP: chất lỏng
Chất phân tích tranh chấp với pha động ở
các vị trí hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh.
Lưu giữ chất phân tích là lực hấp phụ

4/25/2020 60
 Pha tĩnh:
 Silica: nguyên liệu chất nhồi cho sắc ký
pha thuận.Trên bề mặt có nhóm silanol ở
dạng tự do (có ái lực hấp phụ mạnh nhất)
SP ổn định ở pH = 2-8.
 Alumina: ổn định ở pH =2 – 12. Ứng dụng
tách các bazo hữu cơ.
 Hiện nay đang nghiên cứu sử dụng
titanoxyd và zirconi oxyd, ổn định được
môi trường acid đến pH=1.
4/25/2020 61
 Pha động
 Thành phần pha động ảnh hưởng rõ rệt
đến hệ số phân bố của chất phân tích.
 Dùng pha động có sức rửa giải ε0
 Nếu pha động gồm nhiều dung môi:
ε = ε0A* TA + ε0B*TB

4/25/2020 62
 Chất phân tích

F1 F2

Pha tĩnh Pha động

Pha tĩnh Silicagel trần Pha động có độ phân cực
có chứa các nhóm –OH giống chất phân tích
phân cực
4/25/2020 63
 Thứ tự rửa giải trên cột hấp phụ

Chất phân cực hơn có tR

dài hơn

Chất phân cực trung bình

Chất kém phân cực có tR

ngắn nhất

Muốn làm giảm tR của chất phân

cực: Tăng sức rửa giải MP
-Tăng tỉ lệ dung môi phân cực
4/25/2020 -Thêm dung môi phân cực 64
 Sức rửa giải của một số dung môi
trong sắc ký hấp phụ
TT Tên dung môi o silica o alumina
1 n - hexan 0 0,01
2 n - heptan 0 0,01
3 Cyclohexan - 0,04
4 Carbon tetraclorid 0,11 0,17
5 Isopropyl ether 0,32 0,28
6 Cloroform 0,26 0,36
7 1,2 dicloroethan 0,34 0,44
8 Tetrahydrofuran 0,53 0,51
9 Ethyl acetat 0,48 0,60
10 Acetonitril 0,52 0,55
11 Dioxan 0,51 0,61
12 Tert - butanol - 0,70
13 n - butanol - 0,82
14 i - propanol 0,60 0,82
15 Ethanol - 0,88
16 Methanol 0,70 0,95
4/25/2020 65
17 Nước - > 0,95
Ứng dụng:
Phân tích chất có khối lượng phân tử
dưới 5000, ít tan trong nước hoặc tan
trong hỗn hợp nước- dung môi hữu cơ
không thích hợp với sắc ký pha đảo.
+ Tách các đồng phân vị trí của các HCHC
+ Phân tích các chế phẩm dầu mỏ, thực
phẩm, dược phẩm.

4/25/2020 66
 Những loại sắc ký khác
• Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao
• Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel
• Sắc ký ái lực
• Sắc ký lỏng siêu tới hạn
Tài liệu

4/25/2020 67
 3.Ứng dụng của HPLC

Thử tinh khiết

 Định tính

Định lượng

4/25/2020 68
 Chuẩn
 Định tính:
- Dựa vào tR Thử

- Kết hợp Detector DAD chồng phổ

chất chuẩn và chất thử.

4/25/2020 69
 Định lượng

4/25/2020 70
Phương pháp ngoại chuẩn
- Chuẩn ngoại 1 điểm (so sánh)
- Chuẩn ngoại nhiều điểm (đường chuẩn)
 Phương pháp nội chuẩn
- Chuẩn nội 1 điểm
- Chuẩn nội nhiều điểm
 Phương pháp thêm
- Thêm 1 điểm
- Thêm đường chuẩn
 Phương pháp chuẩn hóa diện tích
4/25/2020 71
 3.1 Phương pháp ngoại chuẩn
- Mẫu chuẩn và mẫu thử sắc ký cùng điều kiện
- So sánh diện tích hoặc chiều cao của chất phân
tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn tương ứng đã
biết
Yêu cầu:
 Chất chuẩn ngoại có cùng bản chất với chất
phân tích
 Đạt yêu cầu là chất chuẩn tinh khiết

4/25/2020 72
 3.1 Phương pháp ngoại chuẩn
Ngoại chuẩn 1 điểm
Mẫu thử (Cx) Mẫu chuẩn (Cc)
Xử lý mẫu cùng điều kiện

Dung dịch thử (Cx ) Dung dịch chuẩn (Cc)

Chạy sắc ký cùng điều kiện

Diện tích pic thử (Sx) Diện tích pic chuẩn (Sc)

Cx Sx

4/25/2020
Cc Sc 73
 3.1 Phương pháp ngoại chuẩn
Chuẩn ngoại nhiều điểm
Chuẩn bị mẫu:
dd mẫu thử: mẫu thử Cx
dd mẫu chuẩn: 1. mẫu chuẩn C1
2. mẫu chuẩn C2 i. Xử lý mẫu
Sắc
3. mẫu chuẩn C3 ii. Chạy sắc ký
ký đồ

4. mẫu chuẩn C4 cùng điều kiện

5. mẫu chuẩn C5
Lưu ý: C1 ≤ Cx ≤ C5

4/25/2020 74
 S5
S4

S3
Sx
S2
S1

Mẫu chuẩn 1 Mẫu chuẩn 2 Mẫu chuẩn 3 Mẫu chuẩn 4 Mẫu chuẩn 5 Mẫu thử Cx

4/25/2020 75
 3.1 Phương pháp ngoại chuẩn
S

S5
S= a.C + b
S4
R≥ 0,99
Sx
S3
Sx= a.Cx +b
S2

S1

Cx= (Sx –b)/a

C1 C2 C3 Cx C4 C5 C

4/25/2020 76
 Ví dụ 1: Xây dựng đường chuẩn của 5-HMF
Nồng độ ban đầu Diện tích
(µg/ml) pic (mAU.s)
5,0 7,329
10,0 13,52
50,0 71,48
80,0 113,1 Sx
100,0 135,4
150,0 210,0
200,0 276,9
Phương trình hồi quy
y = 1,3847x +0,5464 (R2 = 0,9996) Cx

Mẫu thử

4/25/2020 77
 Bài tập 3
Tiến hành định lượng nguyên liệu Loratadin bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC).
 Dung dịch thử: Cân 0,0179 g nguyên liệu Loratadin vào bình định
mức 50,0ml, hòa tan và định mức vừa đủbằng dung môi pha mẫu
thích hợp. Hút chính xác 1,00 ml pha loãng bằng dung môi pha
động, định mức vừa đủ thành 100,0 ml (dung dịch X)
 Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 0,0198 g Loratadin chuẩn vào bình
định mức 50,0ml, hòa tan và định mức vừa bằng dung môi pha mẫu
thích hợp. Hút chính xác 1,00 ml pha loãng bằng dung môi pha
động, định mức vừa đủ thành 100,0 ml (dung dịch Y).
Tiến hành chạy sắc ký cùng điều kiện 2 dung dịch X, Y thu được
diện tích pic lần lượt là 16020,1 (mAu.s) và 17915,4 (mAu.s).
a, Phương pháp định lượng trên là phương pháp gì?
b, Tính hàm lượng % (kl/kl) Loratadin trong nguyên liệu trên?

4/25/2020 78
 Bài tập 4
Để định lượng paracetamol (PAR) bằng phương pháp HPLC, người ta
xây dựng đường chuẩn với kết quả như sau:

STT mẫu chuẩn 1 2 3 4 5

Nồng độ chuẩn PAR (µg/ml) 16,3 26,2 32,7 39,2 49,0
Diện tích pic S (mAu.s) 778,05 1239,5 1564,4 1799,2 2284,5

a, Thiết lập phương trình đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa
diện tích pic S và nồng độ C của PAR. Biết rằng phương trình S =
a.C + b có các hệ số a và b được xác định như sau:
trong đó S và C lần lượt là diện tích pic và nồng độ của các dung
dịch chuẩn, n là số dung dịch của đường chuẩn.

4/25/2020 79
 Bài tập 4
b, Hãy tính hàm lượng% (kl/kl) của PAR trong từng mẫu dưới đây biết
rằng lượng mẫu cân được hòa tan trong 100ml dung môi pha động, pha
loãng 100 lần bằng dung môi pha động, lọc qua màng lọc 0,45 µm rồi chạy
sắc ký cùng điều kiện với dung dịch chuẩn.

Mẫu Khối lượng cân Diện tích pic S (mAu.s)

(g)
X 0,7235 1436,5
Y 0,7253 1489,3

4/25/2020 80
 3.2 Phương pháp nội chuẩn
Thêm lượng giống nhau của chất chuẩn thứ 2 ( chuẩn
nội (Internal Standard - IS) vào mẫu chuẩn và mẫu thử
rồi tiến hành Sắc ký.
Chuẩn bị mẫu:
dd mẫu thử: mẫu thử Cx + Cis
dd mẫu chuẩn: mẫu chuẩn Cc + Cis
Chất chuẩn nội:
+ Có cấu trúc hóa học tương tự chất thử
+ Có nồng độ ~ nồng độ chất thử
+ Không có phản ứng với bất cứ thành phần nào của mẫu
thử
+ Có độ tinh khiết cao và dễ kiếm

4/25/2020 81
 3.2 Phương pháp nội chuẩn

• Yêu cầu của chất chuẩn nội:

+ Pic của chất chuẩn nội phải tách khỏi pic
của các thành phần khác( Rs >1,25)
+ Pic của chất chuẩn nội phải gần với pic
của chất phân tích.
→ Sai số do tiêm mẫu được loại bỏ

4/25/2020 82
 3.2 Phương pháp nội chuẩn
Nội chuẩn 1 điểm
Mẫu thử (Cx) Mẫu chuẩn ngoại (Cc)
Thêm chuẩn CIS Thêm chuẩn CIS

Dung dịch thử (Cx + CIS) Dung dịch chuẩn (Cc+ CIS )
i. Xử lý mẫu

ii. Chạy sắc ký cùng điều kiện

Diện tích pic mẫu thử (Sx , Sis) Diện tích pic mẫu chuẩn (Sc , Sis)

4/25/2020 83
 3.2 Phương pháp nội chuẩn
Phương pháp nội chuẩn 1 điểm
Sis
Sc Sis
Sx

Dd mẫu chuẩn Dd mẫu thử

SC SX
RC  RX 
SIS SIS
CC SC RC
 
Cx SX RX
4/25/2020 84
 3.2 Phương pháp nội chuẩn

Phương pháp nội chuẩn nhiều điểm

Chuẩn bị mẫu:
dd mẫu thử: mẫu thử Cx + Cis
dd mẫu chuẩn: 1. mẫu chuẩn C1 + Cis
2. mẫu chuẩn C2 + Cis
3. mẫu chuẩn C3 + Cis
4. mẫu chuẩn C4 + Cis
5. mẫu chuẩn C5 + Cis

4/25/2020 85
 3.2 Phương pháp nội chuẩn
Sis Sis
S3

S2
S1

Sis S4 Sis S5 Sis

Sx

4/25/2020 86
 3.2 Phương pháp nội chuẩn
Tính các hệ số R tương ứng:
R1 = S1/ Sis
R2 = S2/ Sis
R3 = S3/ Sis
Phương trình tuyến tính R(C)
R4 = S4/ Sis
R5 = S5/ Sis
Rx = Sx/ Sis

4/25/2020 87
 3.2 Phương pháp nội chuẩn
R

R5
R= a.C + b
R4
R≥ 0,99
Rx
R3
Rx= a.Cx +b
R2

R1
Cx= (Rx –b)/a

C1 C2 C3 Cx C4 C5 C

4/25/2020 88
 Bài tập 5
Phân tích dung dịch chuẩn có 3 thành phần A,B và C bằng sắc ký
khí cho kết quả như bảng sau:

Hợp chất Nồng độ (mg/ml) Diện tích pic (cm2)

A 1,03 1,08
B 1,16 0,43
C 1,89 0,86
Một dung dịch thử được chuẩn bị bằng cách trộn 29,00 mg chất B
vào 10,00 mL dung dịch X chứa lượng chất A và C. Sau đó chuyển
vào bình định mức 25,00 ml, thêm dung môi đến vạch. Chạy sắc ký
với cùng điều kiện như trên thu được sắc ký đồ có diện tích pic của
A, B, C lần lượt là 1,23 và 0,45 và 1,04 (cm2).
 Phương pháp định lượng trên là phương pháp gì? Vai trò của B
trong quy trình phân tích trên là gì? Các yêu cầu của chất B?
 Tìm nồng độ của chất A (mg/ml) và C (mg/ml) trong dung dịch X?

4/25/2020 89
3.3 Phương pháp thêm chuẩn
Nguyên tắc: Xác định hàm lượng chất phân
tích trên nền dung dịch cần định lượng, sử
dụng chất chuẩn ngoại (chất chuẩn của
chính chất cần phân tích)
Thêm một điểm
Thêm đường chuẩn

4/25/2020 90
3.3 Phương pháp thêm chuẩn
Thêm chuẩn 1 điểm
Mẫu thử (Cx) Mẫu thử (Cx)
Không thêm Cc Thêm chuẩn Cc

Dung dịch thử (Cx ) Dung dịch thử thêm chuẩn

(Cx + Cc )
i. Xử lý mẫu

ii. Chạy sắc ký cùng điều kiện

Diện tích pic thử (Sx)
Diện tích pic thử thêm chuẩn (Sc+x)

Cx Sx

C x  C c Sc  x
4/25/2020 91
3.3 Phương pháp thêm chuẩn
Thêm chuẩn nhiều điểm (thêm đường chuẩn)
Chuẩn bị mẫu:
dd mẫu thử: mẫu thử Cx
dd mẫu thử thêm chuẩn: 1. mẫu thử CX + thêm chuẩn C1
2. mẫu thử CX + thêm chuẩn C2
3. mẫu thử CX + thêm chuẩn C3
4. mẫu thử CX + thêm chuẩn C4
5. mẫu thử CX + thêm chuẩn C5
Xử lý mẫu và chạy sắc ký mẫu thử và mẫu thêm chuẩn
ngoại cùng điều kiện.

4/25/2020 92
 3.3 Phương pháp thêm
Thêm chuẩn nhiều điểm (thêm đường chuẩn)

Sx
mẫu thử: mẫu thử Cx
1. mẫu thử CX + thêm chuẩn C1 S1
2. mẫu thử CX + thêm chuẩn C2 S2
3. mẫu thử CX + thêm chuẩn C3 S3
4. mẫu thử CX + thêm chuẩn C4 S4
5. mẫu thử CX + thêm chuẩn C5 S5

4/25/2020 93
 3.3 Phương pháp thêm chuẩn
S

S5 S= a.C + b
S4 R≥ 0,99
S3
S2
S1
Sx

Cx C1 C2 C3 C4 C5 Nồng độ chuẩn thêm vào

Nồng độ dd thử

4/25/2020 94
 3.4 Phương pháp chuẩn hóa diện tích
Hàm lượng% chất A trong mẫu phân tích có
n thành phần:

SA S A .100
%A  100  n
S1  S 2  ...  S n
 Si
i 1
Yêu cầu:
- Tất cả các thành phần được rửa giải
-Tất cả các thành phần được phát hiện và có hệ số đáp ứng
trên Detector như nhau
4/25/2020 95
4/25/2020 96
 3.4 Phương pháp chuẩn hóa diện tích

 Trường hợp các chất có hệ số đáp ứng

khác nhau thi f được xác định bằng cách:
f= Cc/ Sc

S A .f A
%A
S1f1  S 2 f 2  ...  S n f n
4/25/2020 97
 Bài tập 6
Để xác định giới hạn tạp liên quan A, B, C của nguyên liệu
clorpromazin hydroclorid (CH) ta phân tích mẫu thử nguyên liệu CH
bằng sắc ký lỏng, sử dụng phương pháp chuẩn hoá diện tích thu được
kết quả sau:
Pic tR (phút) S pic
Dung môi 1,52 80
Tạp A 9,76 118
Tạp B 10,02 123
CH 10,93 22041
Tạp C 12,05 145
Biết hệ số đáp ứng của detector đối với các chuẩn tạp A, B, C và CH lần
lượt là 0,021; 0,012; 0,015 và 0,018. Hãy tính % tạp A, B, C trong nguyên
liệu CH? Nguyên liệu trên có đạt yêu cầu về giới hạn tạp chất liên quan
không, biết giới hạn cho phép của từng tạp là dưới 0,70% và tổng các tạp
dưới 1,40%?
4/25/2020 98
 3. Sắc ký lớp mỏng
(Thin- Layer Chromatography :TLC)
3.1. Nguyên tắc
• Là hệ sắc ký lỏng rắn
• Cơ chế tách: phân bố, hấp phụ, trao đổi
ion, loại cỡ.
• Đặc trưng bởi hệ số lưu giữ Rf
• Một số loại pha tĩnh và cơ chế sắc ký.

4/25/2020 101
 Một số chất làm pha tĩnh cho TLC

Pha tĩnh Cơ chế sắc Ứng dụng phân tích

ký
* Silica Hấp phụ Acid amin, hydrocarbon,
alcaloid, vitamin
* Dẫn chất siloxan Phân bố Các chất ít phân cực
* Cellulose Phân bố Acid amin, carbohydrat,
nucleotid
* Alumina Hấp phụ Hydrocarbon, alcaloid, chất
màu thực phẩm, lipid
* Cát biển Phân bố Đường, acid béo
* Cellulose trao đổi Trao đổi ion Acid nucleic, nucleotid, ion kim
ion loại, halogenid
* Gel sephadex
4/25/2020
Loại cỡ Polymer, protein, phức kim loại
102
4/25/2020 103
 Pha tĩnh

• Kích thước hạt : 10-30µm

• Bề dày : 250 µm
• Kích thước bản mỏng: 5-20 cm

4/25/2020 104
 Pha tĩnh
Một số loại pha tĩnh hay được sử dụng
 Silicagel G: bản mỏng Silica và chất kết dính thạch cao
(Gymsum- 13% CaSO4)

 Silicagel H: bản mỏng Silica và không chất kết dính

thạch cao (dùng Al2O3 làm chất kết dính)

 Silicagel GF254: bản mỏng Silica và chất kết dính thạch

cao (Gymsum) trộn chất phát huỳnh quang ở bước sóng
254 nm ( Fluorescent –ƛex 254nm )

 Silicagel HF254: bản mỏng Silica và trộn chất phát huỳnh

quang ở bước sóng 254 nm ( Fluorescent –ƛex 254nm )
4/25/2020 105
 Pha động
 Dung môi cần có độ tinh khiết cao
 Cần điều chỉnh sức rửa giải của MP sao
cho 0,2 < Rf < 0,8.
 Chất phân tích dạng ion hay phân cực
được rửa giải tốt bằng dung môi phân cực
 Khi dùng silicagen hoặc các chất hấp phụ
phân cực khác, độ phân cực của pha
động sẽ quyết định tốc độ di chuyển của
chất phân tích và vị trí Rf của chúng.
4/25/2020 106
4/25/2020 107
• Hệ số lưu giữ:
dR
Rf 
dM
dR: khoảng cách từ điểm xuất phát đến
tâm vết phân tích
dM: khoảng cách từ điểm xuất phát tới
mức dung môi pha động
Rf = (0 – 1)

4/25/2020 108
Tiền tuyến dung môi

dR dM

dR
Vạch xuất phát

4/25/2020 109
 3.2.Các bước tiến hành
3.2.1. Chuẩn bị bản mỏng và bình dung môi
3.2.2. Đưa mẫu lên bản mỏng
3.2.3. Khai triển
3.2.4. Phát hiện vết
3.2.5. Xử lý kết quả

4/25/2020 110
 3.2.1. Chuẩn bị bản mỏng và bình dung môi

- Chọn bản mỏng có kích

thước phù hợp
- Hoạt hóa bản mỏng ( nếu
cần)
- Kiểm soát độ ẩm của bản
mỏng (nếu cần)

4/25/2020 111
-Bình thủy tinh, có nắp đậy,
sạch, khô
- Bình có kích thước phù hợp
với bản mỏng, cao hơn bản
mỏng 4-5 cm.
- Bão hòa dung môi pha
động (đặt 1 tờ giấy lọc áp sát
thành bình).

4/25/2020 112
 3.2.2. Đưa mẫu lên bản mỏng

4/25/2020 113
4/25/2020 114
Tiền tuyến dung môi

Vạch xuất phát Chuẩn A Chuẩn B

Hỗn hợp PT

4/25/2020 115
 Đưa mẫu
• Lượng mẫu: 0,1- 50µg
• Thể tích dung dịch chấm: 1- 5µl
• Thiết bị chấm mẫu

4/25/2020 116
 3.2.3. Khai triển
• Sắc ký lên
• Sắc ký ngang
• Sắc ký hai chiều

4/25/2020 117
 Sắc ký lên Sắc ký
ngang
4/25/2020 118
Sắc ký hai
chiều

4/25/2020 119
 3.2.4. Phát hiện vết
• Chất phân tích có màu
• Phun thuốc thử hiện màu
• Soi UV : soi dưới đèn 254 nm, quan sát vệt
tối trên nền sáng (với bản mỏng GF254)
• Chất phân tích phát huỳnh quang: soi đèn
UV thấy vệt sáng trên nền tối.
• Dùng máy đo mật độ vết: đo cường độ tia
phản xạ từ bản mỏng khi soi dưới đèn UV-
ViS, chất pt hấp thụ ghi lại thành pic sắc ký.
4/25/2020 120
 Chất phân tích có màu (hấp thụ ViS)
quan sát bằng mắt thường

4/25/2020 Sự tách biệt của mực đen bởi sắc kí lớp mỏng 121
 Phun thuốc thử hiện màu

4/25/2020 122
 Soi UV
Bản mỏng Silicagel
GF254 ,chất phân tích hấp
thụ UV quan sát vệt tối
trên nền sáng

4/25/2020 123
 Soi UV
Bản mỏng Silicagel G, chất
phân tích phát huỳnh
quang quan sát thấy vệt
sáng trên nền tối

4/25/2020 124
 Dùng máy đo mật độ vết

4/25/2020 125
 Một vài thông số đặc trưng của TLC

• Tài liệu

4/25/2020 126
 Ứng dụng của TLC
 Định tính
Thử tinh khiết
Định lượng

4/25/2020 127
 Ứng dụng của TLC
 Thử tinh khiết:
Kiểm tra tạp chất có mặt trong Dược chất
thể hiện ở các vết lạ trên sắc ký đồ.

4/25/2020 128
 Ứng dụng của TLC
 Định tính :
- Dựa vào trị số Rf của mẫu thử và mẫu chuẩn
chạy sắc ký trong cùng điều kiện.
- So sánh hệ số Rr: hệ số lưu giữ tương đối
Rr càng gần 1 chất phân tích và chất chuẩn
càng đồng nhất dR , x
Rr 
dR , c
dR,x: đường đi của chất phân tích (cm)
dR,c: đường đi của chất chuẩn (cm)
4/25/2020 129
Tiền tuyến dung môi
Trong hỗn hợp phân
tích có chất A và
chất B không?
3 B
Tính:
- Rf,A
2
- Rf,B
- Rf,1
A dR dM - Rf,2
1
- Rf,3
So sánh các Rf
chuẩn và thử, kết
dR luận
Vạch xuất phát

Chuẩn A hỗn hợp PT Chuẩn B

4/25/2020 130
 Ứng dụng của TLC
Định lượng:
- Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng
dung môi thích hợp
- Định lượng trực tiếp trên bản mỏng : Đo diện
tích hay cường độ màu của vết sắc ký
+ Máy đo mật độ vết: chiếu chùm tia vào vết sk
và đo cường độ hấp thụ hoặc huỳnh quang
+ Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số: Quét bản
mỏng để thu nhận hình ảnh của vết sk.

4/25/2020 131
• Máy đo mật độ vết
• Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số

4/25/2020 132