CHƯƠNG 2: KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC

1. Nguyên tắc thử giới hạn tạp chất: so sánh giữa ống thử và ống chuẩn (so màu,
so độ đục)
Mục đích của thử giới hạn tạp chất?
Xác định giới hạn tạp chất trong thuốc thực chất là thử độ tinh khiết của thuốc nhằm xác định
phẩm chất của thuốc. Nếu thuốc càng tinh khiết thì hiệu quartacs dụng càng cao.
2. Trình bày ảnh hưởng của tạp chất đối với thuốc và các nguyên nhân tạo
thành các tạp chất đó?
 + Ảnh hưởng của tạp chất đối với thuốc:
 - Gây tác hại cho sức khoẻ
 - Gây hiện tượng tương kị hoá học
 - Biểu thị cho mức độ sạch (độ tinh chế chưa đủ).
 - Chất xúc tác đẩy nhanh quá trình phân huỷ thuốc.
 + Các nguyên nhân tạo thành các tạp chất:
 - Nguyên liệu, phụ liệu hoặc bán thành phẩm dùng để sản xuất thuốc chưa đủ độ
tinh khiết.
 - Qui trình sản xuất đã qui định không được thực hiện nghiêm chỉnh.
 - Phương pháp sản xuất chưa tốt và ảnh hưởng của các dụng cụ sử dụng.
 - Trong quá trình bảo quản, các phản ứng phụ làm phát sinh các tạp chất.
 - Do dụng ý gian lận của người sản xuất…
(Phương pháp xác định tạp: PP so sánh)

3. Định lượng acid, base hữu cơ trong môi trường khan: Đối tượng, dung môi,
dung dịch chuẩn?
- Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng trung hòa giữa acid và base, là phản ứng cho nhận
proton
- Vai trò của dung môi: Solvat hóa chất tan và tác động lên quá trình điện ly.
- Khái niệm PH: Trong dung môi khan, người ta xác định pH biểu kiến (Liên quan
đến hằng số điện ly Ks của dung môi)
- Xác định điểm tương đương: 2 phương pháp: chỉ thị màu pH, chỉ thị màu đo thế.
- Ứng Dụng Chuẩn Độ Acid-Base Trong Mt Khan?
Chuẩn độ trong môi trường khan được áp dụng khi:
 Chất phân tích không hòa tan trong nước. Trong kiểm nghiệm thuốc thường gặp các
acid và base có KL phân tử lớn ít tan trong nước.
 Sức acid, base quá yếu trong nước nên khó phát hiện điểm tương đương.
 Các acid, base đa chức có các hằng số điện ly trong nước ít khác biệt nhau.
 Acid Base
Các - Các acid carboxylic - Alkaloid
chất - Dẫn xuất enol, imid, sulfonamid - Base nito tổng hợp
cần - Dẫn xuất thế phenol như polyclorophenol,
định polynitrophenol.
lượng - Hỗn hợp các chất có tính acid hoặc acid đa chức .

Dung Thường chọn dm có tính base để tăng tính acid của - Acid acetic khan,
môi chất phân tích như: pyridin, dimetylformamid (DMFA). - Anhydrid acetic
Ngoài ra tert - butanol thường được dùng làm dung môi
cho CĐ acid carboxylic, dẫn xuất của phenol.

Dung KOH trong alcol (thường dùng trong methanol), Dung dịch chuẩn:
môi Metylat kim loại kiềm như natri, kali, Dung dịch acid
chuẩn Tetraalkyl amonium hydroxyd: thường dùng tert - percloric trong acid
Bu4NOH trong hỗn hợp dung môi benzen - methanol acetic khan,
(95:5).
Lưu ý: Chất chuẩn:
Dd chuẩn kim loại kiềm gây sai số base cho điện cực thủy Kali hydrophtalat
tinh khi chuẩn độ đo thế
Dd chuẩn R4NOH là base mạnh, mạnh hơn dd hydroxyd
kiềm như KOH nên có thể cđ các acid rất yếu, tuy nhiên
các dung dịch này có nhược điểm là độc do benzen, pha
chế mất nhiều thời gian, khó bảo quản (do phản ứng với
CO2 trong kk
 4. PP SỬ DỤNG THUỐC THỬ KARL FISCHER?
A/ NGUYÊN TẮC
Thuốc thử này gồm có iod, SO2, methanol và pyridin. Hỗn hợp phản ứng với nước theo hai pt
sau:
C5H5N.I2 + C5H5N.SO2 + C5H5N + H2O  2C5H5N.HI + C5H5N.SO3
C5H5N.SO3 + CH3OH  C5H5N(H)SO4CH3
Hỗn hợp có lượng lớn pyridin nên các chất tham gia phản ứng và sản phẩm đều tồn tại dưới
dạng phức. Phản ứng đầu tiêu thụ 1 phân tử nước. Phản ứng thứ 2 xảy ra khi có dư CH 3OH là
cần thiết, quyết định sự thành công của chuẩn độ vì phức SO3 cũng phản ứng với nước.
C5H5N.SO3 + H2O  C5H5N(H)SO4H
Đây là phản ứng phụ. Để loại bỏ phản ứng này, người ta dùng methanol (nhân tố quyết định
phản ứng) dư trong hỗn hợp.
B/ Lưu ý
 Cần lưu ý là một số phản ứng hóa học cản trở phương pháp Karl Fischer do tạo thành
nước sau phản ứng:
 Các hợp chất carbornyl tác dụng với methanol:
R – CHO + 2CH3OH  R – CH (OCH3)2 + H2O
 Oxyd kim loại phản ứng với HI
MO + 2HI  MI2 +H2O
 Ngoài ra các chất oxy hóa khử cũng thường cản trở phương pháp Karl Fischer vì chất
oxy hóa sẽ phản ứng với iodid là sản phẩm của thuốc thử, còn chất khử phản ứng với iod
của thuốc thử.

CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC

A. QUANG PHỔ PHÂN TỬ
I. Quang phổ UV- VIS
I.1. Định luật Lamber-beer
Định luật: Khi chiếu 1 chùm tia sáng đơn sắc có cường độ I0 qua dung dịch có bề dày
l(cm) ta thu được chùm chia đi ra có cường độ I:
I
 ⇒ độ truyền qua T = I x 100% ( T càng nhỏ thì dung dịch hấp thụ ánh sáng càng
0

mạnh )
1 I0
 A = log T = log =K.C.L ⇒ hàm lượng của chất phân tích tỷ lệ thuận mật độ
I
quang 
 C có 2 loại CM (mol/l) , C% (g/100ml)
1%
 nếu C =10% , l=1cm => k = E1 cm, nếu C =1M . l =1cm => k= Ɛ 
→ hệ số hấp thụ phân tử
Điều kiện áp dụng:
 Ánh sáng phải đơn sắc
 Khoảng nồng độ phải thích hợp: định luật Lamber – Beer chỉ đúng trong một giới
hạn nhất định của nồng độ. ( A tối ưu: 0,2 – 0,8).
 Dung dịch phải trong suốt
  Chất thử phải bền trong dung dịch mà bền dưới tác dụng của ánh sáng UV – VIS

Ứng dụng của UV - VIS

 Định tính và thử tinh khiết: max, min, tỷ lệ, chồng phổ, hệ số Match
 Định lượng: Quy trình định lượng, phương pháp định lượng.

2/ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

* Điều kiện: Điều kiện định lượng đáp ứng Lambert-beer
 Chọn bước sóng làm việc
 Chọn khoảng C thích hợp
 Chọn các điều kiện khác( tạp chất, pH, dung môi pha mẫu)
2.1. PP đo phổ trực tiếp: Đo độ hấp thụ A của dung dịch, tính nồng độ C của nó dựa vào
giá trị độ hấp thụ riêng (có trong các bảng tra cứu).

Cần phải chuẩn hoá máy quang phổ về bước sóng lẫn độ hấp thụ.

2.2. Phương pháp gián tiếp

a. PP so sánh:
Nguyên tắc: Chuẩn bị dung dịch chuẩn + thử. Mang đi đo quang thu được A tương ứng.
Lập tỷ lệ:
A T CT AT
= → C T =C c
A c Cc Ac

Ưu: Dễ thực hiện

Nhược: Khó thực hiện trên mẫu có nhiều thành phần tạp
Chú ý: Nồng độ của dung dịch thử CX và dung dịch chuẩn CS không được chênh lệch
nhau quá nhiều. Các nồng độ này càng gần nhau, kết quả càng chính xác.
b. PP đường chuẩn (Đây là phương pháp hay dùng trong phân tích quang phổ)
Nguyên tắc:
- Chuẩn bị một dãy chuẩn khoangr 5 dung dịch có các nồng độ chất chuẩn C s khác
nhau.
- Đo độ hấp thụ As của dãy chuẩn và lập đồ thị của A theo C
- Đo độ hấp thụ Ax của dung dịch mẫu thử và dựa vào đường chuẩn ta xác định được
nồng độ mẫu thử Cx
Chú ý:
- Khoảng tuyến tính của A với C.
 - Cần làm thêm một số điểm chuẩn nữa với các nồng độ gần nhau hơn (khác nhau
không quá 10%) nếu không tuân theo Lambert – beer.
- Vẽ đồ thị  xây dựng phương trình hồi qui tuyến tính. r > 0,995
c. PP thêm đường chuẩn
 II. QUANG PHỔ HỒNG NGOẠI:

III. QUANG PHỔ HUỲNH QUANG

Các chất phân tích có khả năng phát quang:
 Các hợp chất hữu cơ vòng thơm đều phát huỳnh quang
 Các dị vòng đơn giản không phát huỳnh quang
 Những phân tử ngưng tự nhiều vòng có phát huỳnh quang
 Các hợp chất đa vòng làm cho bước sóng của huỳnh quang dài hơn
 Các nhóm thế gắn vào còng thơm gây chuyển dịch bước sóng kích thích
 Những nhóm cho điện tử làm tăng hiệu suất huỳnh quang
 Những nhóm hút điện tử làm giảm hiệu suất huỳnh quang
Ứng dụng:
 Định tính: dựa vào bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ huỳnh quang.
 Định lượng: dựa vào cường độ huỳnh quang/ Phản ứng với thuốc thử  dược chất huỳnh
quang
 Có tính đặc hiệu và độ nhạy cao
 Có thể định lượng các kim loại có vạch cộng hưởng có cường độ đủ mạnh.
 Có thể định lượng gián tiếp một số chất hữu cơ tham gia tạo phức như lưu huỳnh,
photpho…
B. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
1. Các thông số đặc trưng
 Hệ số dung lương k’: đại diện thời gian lưu của chất đó trong pha tĩnh so với thời
gian lưu của chất đó trong pha động.
' V s Qs t ' R t R −t o
k =K . = = =
V m Qm to to
 Hệ số chọn lọc α: Đại diện khả năng tác các chất ra khỏi nhau trong hỗn hợp
k ' B t RB
α= =
k ' A t RA

1.05 ≤ α ≤ 2.0
- Hệ số đối xứng F: biểu diễn tính đối xứng của một pic sau khi phân giải
W
F=
2a

 Số đĩa ký thuyết và hiệu lực cột N: N càng lớn khả năng tách càng tốt, các pic thu
được càng hẹp và nhọn
L
H=
N

 Độ phân giải Rs : là khả năng phân tách hoàn toàn

2. Hệ thống máy HPLC

 Bình chứa dung môi pha động ( Tất cả dung môi phỉa tinh khiết và được chuẩn
hóa)
 Bộ phận đuổi khí
 Bơm cao áp
 Bộ phận tiêm mẫu
 Cột sắc ký (Trái tim của hệ thống)
 Detector (Thiết bị phát hiện tín hiệu)
 Máy tính – phần mềm (Xử lý số liệu)
 Máy in
3. Các kỹ thuật HPLC (Dựa vào bản chất của pha tĩnh)
 Phân bố ( sử dụng nhiều nhất)
 Hấp phụ
 Rây phân tử
 Trao đổi ion
III.1. Sắc ký phân bố
a. Pha tĩnh
 Sắc ký lỏng – lỏng (LLC): lớp mỏng pha lỏng hữu cơ bao trên bề mặt của các tiểu
phân chất mang.
 Nhược điểm: bị rửa trôi dần theo dòng pha động => hiệu lực cột bị giảm dần trong
quá trình sử dụng.
b. Pha động
Tùy thuộc vào việc sử dụng pha động và pha tĩnh, người ta chia sắc ký phân bố thành 2
loại, sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo.
Sắc ký pha thuận Sắc ký pha đảo
Pha tĩnh phân cực hơn pha động. Pha động phân cực hơn pha tĩnh.

Pha tĩnh: không phân cực (C18, C8,

Pha động: không phân cực (hỗn hợp C6H5). Pha động: phân cực (H20,
pentan, hexan, heptan, isootan) MeOH, acetonitril).

Các chất không phân cực sẽ được rửa

giải sớm. Thứ tự rửa giải: chất phân cực ra trước,
Thứ tự rửa giải sẽ chậm dần theo chiều các chất ít và không phân cực ra sau.
tăng của độ phân cực

4. Các phương pháp định lượng HPLC

o Phương pháp chuẩn ngoại: là pp định lượng cơ bản, trong đó có cả 2 mẫu chuẩn và
thử đều tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. So sánh diện tích ( hoặc chiều cao) pic
của mẫu thử với diện tích ( hoặc chiều cao) pic mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của
chất trong mẫu thử.
o Phương pháp chuẩn nội: Áp dụng trong phân tích các mẫu cử lý phức tạp( chiết tách)
và đặc biệt là các mẫu vừa phức tạp vừa có hàm lượng thấp của chất cần định lượng. Có
thể giúp cực tiểu hóa được những sai số gây nên do máy móc và kỹ thuật.
o Phương pháp thêm chuẩn: Kỹ thuật này phối hợp pp chuẩn ngoại và chuẩn nội. Ưu
điểm của kỹ thuật thêm chuẩn là có độ chính xác cao vì nó loại trừ được sai số do các
yếu tố ảnh hưởng, đặc biệt là ảnh hưởng của quá trình xử lý mẫu( chiết xuất, tinh chế
các chất từ các dạng bào chế)
o Phương pháp chuẩn hóa diện tích
 Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được
tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic
thành phần trên sắc đồ.
5. Ứng dụng
 Định tính: So sánh thời gian lưu của chất phân tích trong dung dịch thử với thời gian
lưu của chất chuẩn trong dung dịch chuẩn chạy cùng điều kiện sắc ký.
 Thử tạp chất: Dựa vào thời gian lưu và diện tích pic
 Định lượng
 CHƯƠNG 4: KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC
I. Kiểm nghiệm thuốc bằng pp thử trên động vật
1. Nguyên tắc
Dựa trên sự đáp ứng của động vật thí nghiệm đối với các chế phẩm được đưa vào cơ thể
(liều lượng theo quy định của từng thí nghiệm) để đánh giá chất lượng của chế phẩm cần
thử.
2. Động vật thí nghiệm
- Phải động đều, thuần khiết về nòi giống
- Khỏe mạnh, không nhiễm bệnh
- Không có thai
- Được nuôi dưỡng đẩy đủ
3. Các thử nghiệm trên ĐV được áp dụng trong kiểm nghiệm thuốc.
- Thử độc tính bất thường
- Thử chất hạ huyết áp
- Thử chất gây sốt
- Định lượng các hormon: gonadorelin, corticotrophin, insulin, oxytocin,menotrophin.
- Kiểm tra tính an toàn của vaccine và sinh phẩm
- Xác định hiệu lực của các Vaccine và antitoxin
II. KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỬ VI SINH VẬT
Ứng dụng:
Thử vô khuẩn, thử giới hạn vi sinh vật, thử hoạt lực kháng sinh.
1. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
a. Phân loại:
- Môi trường tự nhiên: động vật hay thực vật
- Môi trường tổng hợp: hóa chất thuần khiết, hòa tan trong nước
- Môi trường bán tổng hợp: nguyên liệu tự nhiên và tổng hợp
Đáp ứng các điều kiện: - Đầy đủ chất dinh dưỡng
- pH trong khoảng quy định
- Vô trùng
b. Kỹ thuật pha chế môi trường
1. Chuẩn bị dụng cụ hóa chất - Dụng cụ: men/ thủy tinh
- Nguyên liệu, hóa chất: chất lượng, tinh
khiết
2. Cân đong nguyên liệu - Chính xác( nhất là nguyên tố vi lượng gây
ức chế vi khuẩn)
3. Hòa tan nguyên liệu - Nước cất/ nước khử khoáng
- Thạch: đun cho tan
4.Điều chỉnh pH -NaOH 1N, HCl 1N
5. Làm trong môi trường - Lọc qua vải gạc/ giấy
6. Đóng ống tiệt trùng - Thông thường: 110oC/30 phút, 120oC/20
phút
- Các chất phân hủy bởi nhiệt  nhiệt độ
thấp
Pha chế môi trường từ hỗn hợp bột môi - Pha: nước cất/ nước khử khoáng
trường chế sẵn - Kiểm tra pH

c. Các pp tiệt trùng

TIỆT TRÙNG BẰNG

NHIỆT KHÔ
TIỆT TRÙNG GIÁN ĐOẠN (PP TYNDALL)
Diệt được bào tử
TIỆT TRÙNG BẰNG HƠI
NƯỚC
KHỬ TRÙNG NHIỆT ĐỘ THẤP ( PP PASTEUR)
TIỆT TRÙNG Không biệt bào tử
PHƯƠNG PHÁP LỌC

PHƯƠNG PHÁP DÙNG TIA

BỨC XẠ

Lưu ý: Phương pháp tiệt trùng môi trường dễ bị hỏng bởi nhiệt: tiệt trùng bằng hơi nước.

2.Thử vô khuẩn
a. Mục đích
 Phát hiện sự có mặt của vi khuẩn, vi nấm trong: thuốc tiêm, dịch tiêm truyền, thuốc tra
mắt,các dụng cụ y tế mà phải vô trùng.
b. Nguyên tắc
 Vi khuẩn/ nấm cấy vào môi trường có chất dinh dưỡng và nước, ở nhiệt độ thích hợp
 phát triển  biến đổi môi trường.
c. Phương pháp thử

 Phương pháp dùng màng lọc: thấm ướt màng lọc  Rót mẫu thử lên màng Rửa
màng lọc  Cấy vào môi trường trong thời gian quy định  Quan sát hiện tượng,
nhận định kết quả.
 Phương pháp nuôi cấy trực tiếp.
3. Thử giới hạn vi sinh vật
Đếm số lượng VSV:
- Các phương pháp thử:
 Phương pháp đĩa thạch
 Phương pháp pha loãng trong ống nghiệm
 Phương pháp màng lọc
4. Xác định hoạt lực kháng sinh bằng pp thử vsv
Mục đích:
 Đánh giá hoạt tính sinh học của thuốc
 Kiểm tra được sự giảm hay mất hoạt lực của chất kháng sinh
 Xác định hoạt lực các chất kháng sinh có cấu trúc phức tạp hoặc 1 hỗn hợp nhiều
thành phần có tác dụng
 Cho biết độ nhạy cảm của VK gây bệnh và mức độ kháng thuốc của chúng
 Chọn kháng sinh thích hợp cho bệnh nhân trong điều trị
Nguyên tắc :
- Chất kháng sinh khuếch tán vào môi trường dinh dưỡng đặc đã cấy vi sinh vật chỉ thị,
tạo các vùng ức chế VSV có đường kính tỷ lệ thuận với logarit nồng độ tương ứng.
Hoạt lực của chất thử được so sánh với chất chuẩn theo phương pháp thống kê
phương pháp : Phương pháp đo độ đục và Phương pháp khuếch tán