HÓA PHÂN TÍCH 2

BÀI: SẮC KÝ HIỆU LỎNG NÂNG CAO

( High Peformance Liquid Chromatography)
 NỘI DUNG
1. ĐỊNH NGHĨA
2. NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC
3. PHÂN LOẠI
4. TRANG THIẾT BỊ
5. ỨNG DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC
1. ĐỊNH NGHĨA

- HPLC là kỹ thuật sắc ký:

+Tách hỗn hợp trên cột được nhồi đầy các hạt có kích thước ≤ 10 µm
+Dùng một bơm có áp suất cao khoảng 300 atm để đẩy pha động qua cột ( pha tĩnh) với
tốc độ dòng khoảng vài ml/phút
+Cho phép phân giải nhanh một lượng mẫu nhỏ cỡ 20 µg
- HPLC ra đời từ năm 1960 đến nay đã được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí
nghiệm, áp dụng nhiều lĩnh vực do: có độ nhạy cao, độ đúng và độ chính xác cao đáp
ứng các yêu cầu về định lượng, thích hợp với các hợp chất không bay hơi và kém bền
với nhiệt.
 Bơm mẫu Chiều di chuyển của pha động
T=0 Detector

T= 10 phút

T= 20 phút

Mạnh Yếu
Chất nào đi ra khỏi cột sẽ bị phát hiện bởi detector ( đầu dò ) và cho ra những tính hiệu. Những chất phân
tích di chuyển theo pha động, mỗi chất khác nhau trong hỗn hợp sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau. Chất
nào di chuyển nhanh thì tương tác yếu với pha tĩnh, chất nào di chuyển chậm thì tương tác mạnh với pha
tĩnh.
2. NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC
HPLC là một phương pháp chia tách với pha động là chất lỏng, còn
pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn được phân chia ở dạng tiểu phân
hoặc một chất lỏng phủ lên trên một chất mang rắn hay là chất mang
đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với những nhóm chức hữu cơ.
Quá trình này dựa trên cơ chế hấp thụ, phân bố và trao đổi ion hay
phân loại theo kích cỡ (rây phân tử).

Nó được phân biệt với sắc ký lỏng truyền thống bởi áp suất hoạt động
cao hơn nhiều (50 – 350 bar). Đây là phương pháp hiệu quả nhất với
khả năng kiểm soát tốt và cung cấp lương chất đi qua tương đối cao,
chúng đẩy dung môi đi qua ở áp suất cao thay vì sử dụng trọng lực
như phương pháp truyền thống.
Về bản chất, sắc ký lỏng hiệu năng cao liên quan đến việc trộn một
dung dịch từ một bể chứa với một vùng mẫu chứa các chất phân tích
được tách ra, sau đó bơm hỗn hợp này vào bộ phận tiêm mẫu. Tiếp
theo, pha động mang chất phân tích đi qua cột sắc ký có chứa pha tĩnh.
Trong trường hợp chất phân tích không có màu cần có đầu dò để biết
được khi nào nó đi qua cột. Dữ liệu phát hiện sẽ được lưu trữ để phân
tích và chất thải được thu vào.
 3. PHÂN LOẠI
- Dựa vào cơ chế tách chiết phương pháp SKHLNC được chia làm 4 loại:
+ Sắc ký phân bố ( partition chromatography)
+ Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng- rắn ( adsorption/ liquid chromatography)
+ Sắc ký ion ( ion chromatography)
+ Sắc ký rây phân tử ( size exclusion/gel permeation chromatography)
Trong đó sắc ký phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân ích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất
phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn ( <3000)

- Sắc ký phân bố chia thành 2 loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động:
+ Sắc ký pha thường ( sắc ký pha thuận):
 Pha tĩnh phân cực
 Pha động là dung môi hữu cơ ít phân cực
 Dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm.
+ Sắ ký pha đảo:
 Pha tĩnh là những chất lỏng ít phân cực
 Pha động là dung môi phân cực ( nước, methanol..)
 Dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực.
4. TRANG THIẾT BỊ

1: Bình chứa pha động.

2: Bộ phận khử khí

3: Bơm cao áp

4: Bộ phận tiêm mẫu

5: Cột sắc ký (pha tĩnh)

6: Đầu dò

7: Hệ thống máy tính nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu, điều khiển hệ thống.

8: In dữ liệu.
4. Trang thiết bị cơ bản của HPLC
4.1 Hệ thống cấp pha động

 Pha động trong sắc ký lỏng thường là 2 dung môi hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ
phân giải phù hợp.
 Trước khi sử dụng cần lọc (màng lọc 0,45 μm) và đuổi khí hòa tan trong pha động.
 Khi hòa tan có thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền.
 Có thể loại khí hòa tan bằng cách chạy siêu âm, sục khí như heli,…
 Pha động thường được chứa trong bình thủy.
 Có hai cách dùng pha động rửa giải
- Đẳng dòng (isocratic): Thành phần pha động không thay đỏi trong quá trình sắc ký
- Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2:4 loại được đựng trong các bình
khác nhau. Tỉ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định
4. Trang thiết bị cơ bản của HPLC
4.1 Hệ thống cấp pha động

Hệ thống cấp Bộ phận tiêm

Bơm
dung môi mẫu

Hệ thu nhận xử lý
dữ liệu Detector Cột sắc ký
(máy ghi, máy tính)
Lò cột

Thải

Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

4. Trang thiết bị cơ bản của HPLC
4.2 Hệ thống bơm
• Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng cần đáp ứng yêu cầu sau:

 Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên
(1 psi = 0,068 atm; 1 atm = 1,01 bar; 1 atm = 101,01 kPa)
 Đảm bảo bơm lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01 5,0 mL/phút
 Chịu được tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn mòn)

• Về mặt kết cấu: có 3 loại thường gặp

 Bơm đẩy một pittong (single piston pump)

 Bơm làm đầy nhanh (Rapid Refill pump)
 Bơm kéo đẩy kéo (twin – headed reciprocating pump)
4. Trang thiết bị cơ bản của HPLC
4.3 Hệ tiêm mẫu

 Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng

vào pha động cao áp ngay ở đầu cột mà
không cần dừng dòng bằng một van tiêm có
vòng chứa mẫu (sample loop)

 Vòng chứa mẫu có dung tích khác nhau:

thường dung loại 0,5 20

 Khi dung van tiêm sẽ dễ dàng tự động hoá

 Phần mền máy tính dễ dàng tự động hoá

→ sai số tiêm mẫu dùng van khoảng 0,5%

4. Trang thiết bị cơ bản của HPLC
4.4 Cột và pha tĩnh

 Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được

chế tạo bằng thép không gỉ, thuỷ tinh hoặc chất
dẻo

 Chiều dài 10-30 cm, đường kính trong 4-10 mm

 Cột nhồi thường có hạt cỡ 5 hoặc 10 μm. Chất

nhồi cột cho sắc ký lỏng được chế tạo từ silica
→ kết tụ các hạt silica để tạo ra các hạt có kích
thước lớn hơn và đường kính đều nhau → hạt
silica gel hình thành thường được bao một lớp
mỏng hữu cơ liên kết với bề mặt.
4. Trang thiết bị cơ bản của HPLC
4.5 Detector
 Phát hiện các chất phân tích có thể dựa vào:
 Đáp ứng chọn lọc với chất phân tích trong pha
 Hiện có nhiều detector, nhưng thường sử
động khi dectector hấp thụ bức xạ UV – Vis
dụng 6 loại dectector thuộc 2 nhóm quang
hoặc huỳnh quang
học và điện hoá:
 Tính chất chung của chất phân tích trong pha
 Detector hấp thụ UV-Vis
động như detector chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện
 Detector huỳnh quang
 Dectector trong sắc ký lỏng cần đáp ứng yêu cầu sau:  Detector chỉ số khúc xạ
 Đáp ứng nhanh và lặp lại.  Detector tán xạ bay hơi
 Độ nhậy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở khối  Detector đo dòng
lượng hoặc nồng độ thấp.  Detector độ dẫn
 Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng
 Khoảng hoạt động tuyến tính rộng
 Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng
ỨNG DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC
Mục tiêu chính của HPLC: Định tính, định lượng và tinh chế các thành phần cụ thể của hỗn hợp.
Ứng dụng trong nhiều lĩnh vực:
- Công nghiệp
- Dược phẩm
- Môi trường
- Pháp y
- Lâm sàng
- Thực phẩm và gia vị
ỨNG DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC
 Dược phẩm
 Nghiên cứu độ hòa tan của dạng bào chế là viên nén.
 Kiểm soát độ bền của thuốc, xác định thời hạn sử dụng.
 Xác định các thành phần hoạt tính.
 Kiểm soát chất lượng dược phẩm.
 Môi trường
 Phát hiện các hợp chất phenol trong nước uống.
 Xác định diphenhydramine trong các mẫu trầm tích.
 Giám sát sinh học của chất ô nhiễm.
 Tách nhanh và xác định các hợp chất carbonyl.
 Pháp y
 Định lượng các mẫu thuốc sinh học.
 Xác định steroid đồng hóa trong huyết thanh, nước tiểu, mồ hôi và tóc.
 Phân tích pháp y của thuốc nhuộm dệt.
 Xác định cocaine và các loại thuốc lạm dụng khác trong máu, nước tiểu, v.v ...
 Xác định các loại thuốc benzodiazepin đường uống bằng LC/MS/MS.
 Lâm sàng
• Catecholamine (epinephrine và dopamine) rất quan trọng đối với nhiều chức năng sinh học.
Phân tích tiền chất và chất chuyển hóa của chúng có thể cung cấp chẩn đoán bệnh Parkinson,
bệnh tim và loạn dưỡng cơ.
• Định lượng các ion trong phân tích nước tiểu và phân tích kháng sinh trong huyết tương.
• Ước tính bilirubin & biliviridin trong huyết tương trong trường hợp rối loạn gan.
• Phát hiện các neuropeptide nội sinh trong ngoại bào của não.
 BÀI THUYẾT TRÌNH:

SẮC KÝ HIỆU LỎNG NÂNG CAO CỦA

NHÓM 3 ĐẾN ĐÂY LÀ KẾT THÚC

THÀNH VIÊN NHÓM 3:

1. Trần Văn Trúc

2. Thái Hoàng Ngọc Vy
3. Lê Trần Ánh Vy
4. Huỳnh Thị Thảo Vy
5. Nguyễn Thị Xuân
6. Trần Thị Thanh Yến
HÓA PHÂN TÍCH 2

Sắc ký khí
(Gas Chromatography)
 ĐẠI CƯƠNG VÀ CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN
Sắc ký khí là một phương pháp dùng để tách hỗn hợp các chất bay hơi dựa trên
sự “phân bố” của các cấu tử bay hơi giữa pha tĩnh là chất rắn (sắc ký hấp phụ)
hay chất lỏng (sắc ký phân bố) và pha động là một chất khí trên một cột mở
Mẫu phân tích: là những chất bay hơi ở nhiệt độ tiến hành sắc ký, được hòa tan
trong dung môi hữu cơ (MeOH, ether …) hay ở thể hơi (kỹ thuật headspace)
Pha động (khí mang) là chất khí di chuyển liên tục (sắc ký rửa giải) qua pha tĩnh
không bay hơi, theo một phương nhất định
Pha động không tương tác với chất phân tích, chỉ có nhiệm vụ di chuyển chất
phân tích qua cột
 ĐẠI CƯƠNG VÀ CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN

Cơ chế của quá trình tách có thể là

Phân bố (chủ yếu trong các cột mao quản)
Hấp phụ (trong các cột nhồi chất hấp phụ, nay ít dùng)
Khả năng bay hơi (nhiệt độ sôi) của mẫu thử đóng một vai trò quan trọng
Các chất tách được là do “ái lực” khác nhau với pha tĩnh
 ĐẠI CƯƠNG VÀ CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN
Khả năng tách của các chất trong mẫu phân tích phụ thuộc nhiều vào
 Bản chất của mẫu
 Bản chất của pha tĩnh
 Nhiệt độ của hệ thống (pha tĩnh, khí mang, mẫu thử)
 Nhiệt độ là thông số quan trọng của quá trình SKK
 Phải được kiểm soát chặt chẽ
 Nhiệt độ của quá trình phân tích có thể không đổi (isothermal) hay tăng theo thời
gian (gradient)
 NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ

1. Sơ lược về hệ thống
Mẫu được bơm vào trong và theo dòng
khí mang (khí mang thường là N2) đưa
đến cột sắc ký (pha tĩnh). Mẫu khi qua cột
này sẽ được hấp phụ lên trên pha tĩnh đó.
Sau đó, các chất lần lượt tách khỏi cột
theo dòng khí ra ngoài được ghi nhận bởi
đầu dò. Từ các tín hiệu nhận được máy 1. Hệ thống khí: khí mang; khí nén; hydro
tính sẽ xử lý và biểu hiện kết quả bằng 2. Cổng bơm mẫu; buồng bơm mẫu
sắc ký đồ. Các chất được xác định nhờ 3. Buồng cột
4. Cột sắc ký
giá trị thời gian lưu trên sắc ký đồ. 5. Đầu dò
6. Hệ thống xử lí và lưu kết quả
 NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
A. KHÍ MANG
1. Nguồn cung cấp khí mang
- Có thể sử dụng bình chứa khí hoặc các thiết bị sinh khí (thiết bị tách khí N2 từ không khí, thiết bị cung
cấp khí H2 từ nước cất,…).
- Yêu cầu khí mang
Trơ
Phù hợp với Detector
Độ tinh khiết cao
Dễ sử dụng
Giá thành rẻ
Không có nguy cơ phát cháy
Cho hiệu của cột và tốt nhất
 NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
A. KHÍ MANG
Các thông số quan trọng
-Khối lượng phân tử
Cao: khuếch tán ít ->Peak gọn
Thấp: độ nhạy cao
-Độ nhớt của khí mang
Tỷ lệ với độ giảm áp suất qua cột
Thời gian phân tách
Tốc độ dòng khí mang
Các điểm cần chú ý khi sử dụng khí mang cho các đầu
dò khác nhau
- Đầu dò dẫn nhiệt (TCD)
• sử dụng khí mang có độ dẫn điện cao như hydro,
heli
- Đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID)
• Vận hành với tất cả khí mang vô cơ (trừ oxy)
• Nitơ thường được sử dụng
• Kết hợp với GC-MS: sử dụng heli
- Đầu dò cộng kết điện tử (ECD)
• Vận hành theo kiểu dòng một chiều: nitơ
• Vận hành theo kiểu xung: argon bổ sung 5% methan
NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
B. BỘ PHẬN BƠM MẪU
Phương pháp tiêm phổ biến nhất là sử
dụng ống tiêm siêu nhỏ để bơm mẫu qua
vách ngăn cao su vào cổng thiết bị hóa hơi
nhanh ở đầu cột.
Nhiệt độ của cổng mẫu thường cao hơn
khoảng 50 ° C so với nhiệt độ sôi của
thành phần ít bay hơi nhất trong mẫu.
Đối với cột nhồi, kích thước mẫu nằm
trong khoảng từ 1/10 microlit đến 20
microlit. Mặt khác, các cột mao quản cần
ít mẫu hơn nhiều, thường khoảng 10 -3
mL
Một ví dụ về cổng bơm đơn giản cho
cột nhồi được thể hiện trong Hình 2.
Đỉnh của cột nằm gọn trong một khối
kim phun được làm nóng, với khí
mang đi vào từ phía dưới. Mẫu được
tiêm qua vách ngăn cao su bằng ống
tiêm microlit như trong Hình 1. Bơm
mẫu trực tiếp vào cột sẽ giảm thiểu sự
mở rộng dải bằng cách trộn mẫu với
lượng khí mang nhỏ nhất có thể. Khối
bơm mẫu được làm nóng đến nhiệt độ
cao hơn ít nhất 50 o C so với thành
phần mẫu có điểm sôi cao nhất, đảm
bảo các thành phần của mẫu bay hơi
nhanh.

Hình 1: Mẫu được tiêm qua Hình 2: Một ví dụ về cổng bơm

vách ngăn cao su bằng ống đơn giản cho cột nhồi được thể
tiêm microlit như trong Hình hiện trong Hình
12.29
 NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
C. BUỒNG CỘT
Yêu cầu
Tăng nhiệt độ nhanh, đều trong toàn bộ buồng cột
Ổn định nhiệt độ
Có khả năng thay đổi nhiệt độ nhanh, chính xác từng bước nhỏ
trong
sắc ký với chương trình nhiệt
Nhiệt độ: 40 – 450oC
Thiết kế
Thể tích buồng chứa 1 hay nhiều cột
Điện trở
Nhiệt kế
 NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
D. NHIỆT ĐỘ CỘT
Nhiệt độ của cột là rất quan trọng
để đạt được sự phân tách tốt trong sắc
ký khí. Vì lý do này, cột được đặt bên
trong lò ổn nhiệt (xem Hình bên).
Trong quá trình phân tách đẳng
nhiệt, duy trì cột ở nhiệt độ không
đổi. Để tăng sự tương tác giữa chất
tan và pha tĩnh, nhiệt độ thường được
đặt thấp hơn một chút so với chất tan
có điểm sôi thấp nhất.
 NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
E. CỘT SẮC KÝ
Có hai loại cột sắc ký chính: cột nhồi và cột mao quản.
Nói chung, cột nhồi có thể xử lý các mẫu lớn hơn và cột
mao quản có thể tách các hỗn hợp phức tạp hơn.
Cột nhồi
 Được làm tử thủy tinh, thép không gỉ, đồng hoặc
nhôm
Chiều dài từ 2–6 m với đường kính trong từ 2–4 mm.
Cột chứa đầy chất rắn dạng hạt hỗ trợ, với đường kính
hạt nằm trong khoảng từ 37–44 μm đến 250–354 μm
 NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
E. CỘT SẮC KÝ
Cột mao quản

Cột hình ống hở được xây dựng từ silica nung chảy và

được phủ một lớp polyme bảo vệ. Các cột có chiều dài từ
15–100 m với đường kính trong khoảng 150–300 μm
Trong cột ống hở có thành ống (WCOT), một lớp pha
tĩnh mỏng, thường dày 0,25 μm, được phủ lên thành trong
của mao quản.
Trong cột hình ống hở có lớp xốp (PLOT), chất rắn xốp
hỗ trợ—nhôm, silica gel và sàng phân tử là những ví dụ
điển hình—được gắn vào thành trong của mao quản.
Cột hình ống hở có lớp phủ hỗ trợ (SCOT) là cột PLOT
bao gồm pha tĩnh lỏng
NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
F. Pha tĩnh
Phân loại:
Sắc ký khí – rắn: pha tĩnh là chất rắn với cơ chế phân tách các chất dựa vào nguyên lý sắc ký
hấp phụ. (Chất phân tích được hấp phụ trực tiếp trên pha tĩnh)
Sắc ký khí – lỏng: pha tĩnh là chất lỏng không bay hơi và cơ chế phân tách dựa vào nguyên lý sắc
ký phân bố.
 Một số tiêu chí quan trọng để chọn pha tĩnh:
 Pha tĩnh rắn:
Khả năng hấp phụ khác nhau trên các chất khác nhau

Pha tĩnh lỏng:

Không phản ứng với khí mang, chất mang rắn, cấu tử cần tách.
Phải có độ phân cực phù hợp với các thành phần của mẫu.
Không bay hơi.
Bền với nhiệt.
Trơ về mặt hóa học
NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
F. Pha tĩnh
Pha tĩnh rắn - Sắc ký hấp phụ:
Carbon graphit hóa
 Không lỗ xốp, trơ, hấp phụ không đặc hiệu.
 Hấp phụ theo hình dạng, kích thước, độ phân cực.
 Carbopack, carbotrap, …
Các polyme xốp:
 Là pha tĩnh rắn dùng cho cột nhồi phổ biến nhất được chọn trong phân tích các chất khí, các chất hữu cơ ít carbon, các acid,
amin.
 Polyme xốp thường dùng như: Chromosorb (101-108), Porapak.
Silica, nhôm oxyd …
Hình dạng, kích thước pha tĩnh ảnh hưởng lên số đĩa lý thuyết.
Hình dạng: phỏng cầu, vô định hình (đồng nhất)
Kích thước: 3 – 10 µm
Kích thước lỗ xốp: 30 – 100 x 10-10 m
Khi kích thước hạt giảm:
 Mật độ pha tĩnh tăng -> số đĩa lý thuyết tăng.
NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
F. Pha tĩnh
Pha tĩnh lỏng – Sắc ký phân bố:
Hydrocarbon: Apiezon (không phân cực), sáp paraffin, squalen (phân nhánh), nhexadecan …
Ester: Sáp ong, ethylenglycol succinat, diethylenglycol adipat (DEGA) …
Polyglycol: Carbowax, Ucon …
Silicon: OV, SE, DC, XE, SF …
Amid
Các pha tĩnh thông dụng nhất
Phân tách hỗn hợp các chất phân cực: polyethylen glycol.
Phân tách hỗn hợp các chất không phân cực: polymer của methylsilicon.
Phân lập các methyl ester acid béo: DEGS (diethylenglycol succinat)
 NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
F. Pha tĩnh
Pha tĩnh lỏng – Sắc ký phân bố:
Đặc tính của một số pha tĩnh lỏng thông dụng:
Pha tĩnh Phân cực Tên thương Nhiệt độ tối Ứng dụng đại diện
mại đa (độ C )
Polydimethyl siloxan Hơi phân SE-30 300–350 alkaloid, dẫn xuất axit amin,
cực thuốc, thuốc trừ sâu, phenol,
steroid
Phenylmetyl polysiloxan Phân cực OV-17 375 alkaloid, thuốc, thuốc trừ sâu,
(50% phenyl, 50% metyl) vừa phải hydrocarbon đa thơm, biphenyl
polychlorin hóa
Trifluoropropylmetyl Phân cực OV-210 275 alkaloid, dẫn xuất axit amin,
polysiloxan (50% vừa phải thuốc, hợp chất halogen hóa,
trifluoropropyl, 50% metyl) xeton
Cấu trúc chung của các pha
Cyanopropylphenylmetyl Phân cực OV-225 275 nitriles, thuốc trừ sâu, steroid
tĩnh phổ biến: (a) polysiloxan
polysiloxan (50%
cyanopropyl, 50% thế; (b) polyetylen glycol.
phenylmetyl)
Polyethylen glycol Phân cực Sáp cacbua 225 anđehit, este, ete, phenol
20M
NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
G. Đầu dò (detector)
Đặc trưng của đầu dò lý tưởng trong SKK:
Giới hạn phát hiện thấp.
Đáp ứng tuyến tính trên một dải rộng nồng độ chất tan (giúp cho công việc định lượng dễ dàng hơn).
Độ nhạy đối với tất cả các chất tan hoặc độ chọn lọc đối với một loại chất tan cụ thể.
Không nhạy cảm với một sự thay đổi trong tốc độ dòng chảy hoặc nhiệt độ.

Phân loại:
Đầu dò phụ thuộc vào nồng độ (TCD, ECD)
Cường độ tín hiệu phụ thuộc vào nồng độ mẫu trong đầu dò
Thường không phá hủy mẫu
Pha loãng làm giảm đáp ứng đầu dò
Đầu dò phụ thuộc vào dòng vật chất (lưu lượng khối, mass flow: lượng mẫu theo đơn vị thời gian g/giây, lưu
lượng khí mang x nồng độ mẫu): FID, TID và MS.
Phân hủy mẫu
Cường độ tín hiệu phụ thuộc vào tỷ lệ mẫu đi vào đầu dò
Đáp ứng của đầu dò không phụ thuộc vào sự pha loãng
 NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
G. Đầu dò (detector)
Đầu dò độ dẫn nhiệt (TCD)
Một trong những máy dò sắc ký khí sớm nhất tận dụng tính dẫn nhiệt
của pha động.
Khi pha động ra khỏi cột, nó đi qua dây tóc vonfram-rheni.
Điện trở của dây tóc phụ thuộc vào:
Nhiệt độ của nó -> phụ thuộc vào độ dẫn nhiệt của pha động.
Ngoài ra, còn phụ thuộc thời gian của tốc độ dòng chảy, áp suất hoặc năng lượng
điện.
=> Do tính dẫn nhiệt cao, helium là pha động được lựa chọn khi sử dụng
máy dò độ dẫn nhiệt (TCD). Sơ đồ thể hiện một máy dò dẫn nhiệt. Đây là một
Ưu điểm: ô của một cặp phù hợp. Tế bào mẫu lấy khí mang
Vì tất cả các chất hòa tan đều ảnh hưởng đến độ dẫn nhiệt của pha động nên đầu khi nó rửa giải khỏi cột. Nguồn khí mang đi
dò dẫn nhiệt là đầu dò vạn năng. vòng qua cột sẽ đi qua ô tham chiếu.
Phản ứng tuyến tính của TCD trên dải nồng độ kéo dài từ 10^4 –10^5 bậc độ lớn.
Nhược điểm:
Giới hạn phát hiện kém đối với hầu hết các chất phân tích.
Mẫu bị phá hủy khi sử dụng máy dò độ dẫn điện.
 NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
G. Đầu dò (detector)
Đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID):
Quá trình đốt cháy một hợp chất hữu cơ trong ngọn lửa H 2 /không khí
dẫn đến ngọn lửa chứa các electron và cation hữu cơ, có lẽ là CHO+.
Áp dụng điện thế xấp xỉ 300 vôn trên ngọn lửa sẽ tạo ra một dòng điện
nhỏ khoảng 10^–9 đến 10^–12 ampe.
Khi được khuếch đại, dòng điện này cung cấp tín hiệu phân tích hữu
ích =>cơ sở của detector ion hóa ngọn lửa phổ biến.
Máy dò FID là máy dò hữu ích để phân tích các mẫu môi trường nước
và khí quyển.
Ưu điểm:
Giới hạn phát hiện nhỏ hơn khoảng hai đến ba bậc độ lớn so với giới hạn của máy
dò dẫn nhiệt. Sơ đồ thể hiện máy dò ion hóa ngọn lửa. Chất rửa
giải từ cột trộn với H2 và được đốt cháy với sự có
Đáp ứng tuyến tính trên 10^6 –10^7 bậc độ lớn trong lượng chất phân tích được
mặt của không khí dư thừa. Quá trình đốt cháy tạo
bơm vào.
ra ngọn lửa chứa các electron và cation CHO+. Đặt
Nhược điểm: một điện thế giữa đầu ngọn lửa và bộ thu, một dòng
Mẫu bị phá hủy khi sử dụng máy dò ion hóa ngọn lửa. điện tỷ lệ với nồng độ cation trong ngọn lửa.
 NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
G. Đầu dò (detector)
Máy dò bắt giữ điện tử (ECD)
Máy dò bắt electron là một ví dụ về máy dò chọn lọc.
Bao gồm một bộ phát β, chẳng hạn như 63Ni.
Các electron phát ra làm ion hóa pha động, thường là
N2, tạo ra dòng điện đứng giữa một cặp điện cực.
 Khi một chất tan có ái lực cao để bắt các electron rửa
giải khỏi cột, dòng điện sẽ giảm -> vai trò là tín hiệu.
Ưu điểm: Sơ đồ hiển thị một máy dò bắt electron.
ECD có tính chọn lọc cao đối với các chất tan có nhóm chức âm
điện (nhóm halogen và nitro).
Giới hạn phát hiện của nó là tuyệt vời.
Nhược điểm:
Tương đối không nhạy cảm với amin, rượu và hydrocacbon.
Phạm vi tuyến tính của nó chỉ kéo dài trên khoảng hai bậc độ lớn.
 NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
G. Đầu dò (detector)
Khối phổ kế (MS)
Máy quang phổ khối là một dụng cụ ion hóa một
phân tử khí bằng cách sử dụng đủ năng lượng để
ion tạo thành phân tách thành các ion nhỏ hơn.
Có thể tách chúng ra bằng từ trường hoặc điện
trường.
Phổ khối thu được chứa cả thông tin định lượng
và định tính về chất phân tích.

Phổ khối của toluene làm nổi bật ion phân tử có màu xanh lục (m/z = 92) và hai ion
mảnh có màu xanh lam (m/z = 91) và màu đỏ (m/z = 65). Phổ khối cung cấp cả
thông tin định lượng và định tính: chiều cao của bất kỳ pic nào tỷ lệ thuận với lượng
toluene trong máy quang phổ khối và kiểu phân mảnh là duy nhất đối với toluene.
 NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
G. Đầu dò (detector)
Khối phổ kế (MS) Sơ đồ khối của thiết bị sắc ký
Phương pháp phổ biến nhất để theo dõi sắc ký đồ khi khí khối phổ (GC–MS) điển
hình. Dòng (A) ra khỏi cột đi
sử dụng khối phổ kế làm máy dò là liên tục quét toàn vào nguồn ion của khối phổ kế
bộ khối phổ và báo cáo tổng tín hiệu cho tất cả các ion theo cách loại bỏ phần lớn khí
đến máy dò trong mỗi lần quét -> cung cấp khả năng mang. Trong buồng ion hóa,
phát hiện chung cho tất cả các chất phân tích. các phân tử còn lại—hỗn hợp
khí mang, dung môi và chất hòa
Chúng ta có thể đạt được một số mức độ chọn lọc tan bị ion hóa và phân mảnh
bằng cách chỉ theo dõi các tỷ lệ khối lượng/điện tích cụ (ion mảnh). Máy phân tích khối
thể-> theo dõi ion chọn lọc. lượng của máy quang phổ phân
Ưu điểm: tách các ion theo tỷ lệ khối
lượng trên điện tích của chúng.
Cung cấp các giới hạn phát hiện tuyệt vời, điển hình là 25 fg
Một máy dò đếm các ion và
đến 100 pg, với dải tuyến tính là 10^5 thứ tự độ lớn.
hiển thị khối phổ.
Có thể quay lại và kiểm tra khối phổ cho bất kỳ khoảng thời
gian nào.
=> Có thể sử dụng khối phổ để giúp xác định các thành
 NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
G. Đầu dò (detector)
Máy dò khác
Máy dò trắc quang ngọn lửa phát xạ quang học từ phốt pho
và lưu huỳnh cung cấp máy dò chọn lọc cho các hợp chất có
chứa các nguyên tố này.
Máy dò nhiệt điện tử phản ứng với các hợp chất có chứa
nitơ hoặc phốt pho. Phân tích GC – FTIR
Máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT–IR) cũng
có thể đóng vai trò là máy dò.
Trong GC–FT–IR:
Dòng chảy ra từ cột chảy qua một tế bào quang học được chế tạo từ
ống Pyrex 10–40 cm với đường kính trong từ 1–3 mm.
Bề mặt bên trong của tế bào được phủ một lớp vàng phản chiếu.
Nhiều phản xạ của bức xạ nguồn khi nó được truyền qua tế bào làm
tăng chiều dài đường quang qua mẫu. Máy Quang Phổ Biến Đổi Hồng Ngoại
Trường hợp của GC–MS, máy dò FT–IR liên tục ghi lại phổ của chất Fourier FT/IR 4000/6000 Hãng Jasco
NGUYÊN LÍ VÀ CẤU TẠO CỦA SẮC KÝ KHÍ
H. Thiết bị điều khiển ghi nhận lưu trữ thông tin
Tín hiệu analog
•Đầu dò -> recorder
•Đầu dò -> integrator

Tín hiệu số
•Đầu dò -> integrator + bộ nhớ + Ploter/Printer
•Đầu dò -> máy tính + máy in

Tín hiệu số + tự động hóa

•Máy sắc ký + Đầu dò + Máy tính (điều khiển thiết bị, xử lý, lưu trữ, truy xuất dữ liệu) + Máy in

Tín hiệu số + tự động hóa + network

•Máy sắc ký + Đầu dò + Máy tính + Mạng máy tính
 THỰC HÀNH SẮC KÝ KHÍ

Để chọn được điều kiện sắc ký

Chọn mẫu: biết nguồn gốc và thành phần mẫu
Chọn cột (loại cột, pha tĩnh, kích thước cột), đầu dò, khí mang
Nhiệt độ cột tách: chọn chế độ đẳng nhiệt hay chương trình nhiệt. Nhiệt độ phải
đủ cao để giữ mẫu phân tích ở thể hơi nhưng không được quá cao làm hư pha
tĩnh.
Nhiệt độ bơm mẫu: khoảng 50°C trên điểm sôi của cấu tử
 ỨNG DỤNG SẮC KÝ KHÍ
Thử tinh khiết, định tính
Thông số căn bản trong định tính
Thời gian lưu
Đặc tính phổ học của mẫu thử

Định danh các chất

Có chuẩn: so sánh thời gian lưu của chất cần định danh với chuẩn hoặc dùng phương pháp thêm chuẩn
Không có chuẩn
Chỉ số lưu (RI, Retention Index):
chỉ số Kovats
 Đặc tính phổ học
o Phổ IR, MS, NMR
o Thư viện phổ
 ỨNG DỤNG SẮC KÝ KHÍ
Thử tinh khiết, định tính
Định danh các chất Đặc tính phổ học Phổ MS
 ỨNG DỤNG SẮC KÝ KHÍ
Thử tinh khiết, định tính
So sánh thời gian lưu của chất cần định tính với chuẩn
 ỨNG DỤNG SẮC KÝ KHÍ
Định lượng
Ứng dụng đại diện của Sắc ký khí
Arae Ứng dụng
Phân tích môi trường Khí nhà kính ( CO2, CH4, Nox) trong không khí
Thuốc trừ sâu trong nước, nước thải, đất khí thải từ
phương tiên giao thông
Phân tích lâm sàng Thuốc, độ cồn trong máu
Phân tích pháp y Phân tích chất xúc tác đốt, phát hiện chất nổ
Sam rphaamr tiêu dung Chất hữu cơ dễ bay hơi trong gia vị và nước hoa
Phát hiện chất hữu cơ trong rượu whiskey
Monomers in latex paint
Dầu khí và công nghiệp hóa Độ tinh khiết của dung môi
chất Nhà máy lọc khí
Thành phần của xăng
 ỨNG DỤNG SẮC KÝ KHÍ
Định lượng
Dựa vào diện tích pic hoặc chiều cao pic (qui về 100% diện tích pic)
Hàm lượng phần trăm của cấu tử trong mẫu thử
Xác định độ tinh khiết sắc ký của cấu tử
SẮC KÝ KHÍ VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÁC
So sánh thiết bị sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu năng cao
SẮC KÝ KHÍ VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÁC
So sánh thiết bị sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu năng
cao
 Nhược điểm của GC so với HPLC
Ưu điểm của GC so với HPLC  Hạn chế mẫu phân tích
Độ phân giải cao • Chỉ áp dụng được cho các mẫu bay
hơi, ít phân cực
Cột dài, số đĩa lý thuyết lớn • Không thực hiện được với chất kém
Tách được các hỗn hợp phức tạp bền nhiệt (250oC)
• Phải tạo dẫn chất bay hơi: ether hóa,
 Độ nhạy cao
ester hóa
Lượng mẫu nhỏ (microlit), chi phí thấp  Khó thực hiện sắc ký điều chế
Giới hạn phát hiện thấp (ppm – ppb) Lượng mẫu nhỏ (khả năng hòa tan của
pha động)
 SẮC KÝ KHÍ VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÁC

Sắc ký lỏng siêu tới hạn (SFC, Supercritical Fluid Chromatography)

Sắc ký hội tu siêu hiệu năng (UPCC, Ultra Performance Convergence Chromatography)
Cảm ơn thầy và các bạn đã lắng nghe