III – Cấu hình hệ thống: không theo thứ tự

Bơm: bình chứa, bộ phận khử khí, hệ thống bơm

Tiêm mẫu: Hệ thống tiêm, buồng lưu mẫu
Cột: Buồng cột, tiền cột, cột
Đầu dò: Đầu dò, bộ phận ghi nhận và xử lý
1. Bình chứa pha động:
- Thuỷ tinh trung tính (cao cấp nhất, được sử dụng sản xuất các lọ thuốc pha tiêm, vacxin,…)
- Được đánh giá chất lượng tuỳ hệ HPLC: UV (độ nhạy thấp hơn MS), MS (đầu dò có độ nhạy cực
cao),…. → Tuỳ thuộc vào hệ thống đầu dò của HPLC
- Có sợi dây rỗng: Khi bơm hút sẽ kéo dung môi vào hệ thống, có bộ phận lọc các tiểu phân rắn hạn
chế tiểu phân rắn vào hệ thống
2. Bộ phận khử khí:
- Tích hợp vào hệ thống máy: ở trong máy
- Chức năng: loại khí trong pha động (lỏng, hệ đa dung môi)
- Online hay In – line: khi hệ thống máy chạy, bộ phận khử khí chạy theo
- Khử khí dựa vào nguyên lý chân không
3. Bơm HPLC:
- Chức năng: hút pha động để đẩy qua cột
- Nguyên tắc hoạt động: piston thuận nghịch
- Phân loại: Đẳng hệ, Nhị phân, Tứ phân
+ Đẳng hệ: gồm 1 dung môi, không phối trộn, không gradient
+ Nhị phân: 2 kênh dung môi, phối trộn áp suất cao, gradient tốt
+ Tứ phân: 4 kênh dung môi, phối trộn áp suất thấp, gradient kém hơn nhị phân
4. Bộ phận tiêm mẫu (van bơm mẫu):
Chức năng: tiêm mẫu, bảo quản mẫu
Cấu tạo:
- Bộ phận tiêm:
+ Sample loop: 0,1 – 100 microlit
+ Tự động hay thủ công
- Bộ phận nhiệt:
+ Điều chỉnh nhiệt
+ Phân tích tạp
 + Thời gian dài
5. Buồng cột:
Chức năng: chứa cột và tạo môi trường phân tách cho cột
→ Tạo môi trường giữ nhiệt ổn định: tăng độ lặp, tăng khả năng phân tách, giảm thời gian lưu, hiệu
chuẩn
6. Lọc tiền cột:
Chức năng: loại tiểu phân rắn trước khi vào cột, bảo vệ cột
Cấu tạo: màng lọc, holder
Đặc tính: cùng bản chất, ngắn, trước cột
7. Cột sắc ký:
Chức năng: chứa pha tĩnh, phân tách
Cấu tạo: vỏ bằng kim loại hay nhựa, pha tĩnh bên trong
Phân loại:
- Pha tĩnh: pha thuận, pha đảo
- Mục đích: phân tích, điều chế
- Dược điển:
+ Việt Nam: A, B, C
+ USP: L1, L3, L7
8. Đầu dò:
Chức năng: Phát hiện chất phân tích
Nguyên lý: đặc tính chất phân tích
- Hấp phụ UV – Vis: UV, PDA
- Phát xạ: FS
- Không đặc trưng: MS, ELSD, RI
Yêu cầu:
- Đáp ứng nhanh - Dễ sử dụng
- Độ lặp cao - Ổn định
- LOD thấp
UV/ PDA (DAD) MS ELSD RI
Rẻ, phổ biến, nhạy Vạn năng, rất nhạy Gần vạn năng, kém Gần vạn năng, kém
nhạy nhạy
 IV – Pha động trong HPLC:
1. Pha động: dung môi phải đạt chuẩn HPLC (chai phải ghi dùng cho HPLC)
- Phải là dạng lỏng
- Quan trọng
- Đơn hay hỗn hợp dung môi
- Có thể chứa dung môi hữu cơ + vô cơ (nước hoặc dung dịch đệm – dung dịch của muối, giữ pH luôn
ổn định)
- Lọc tiểu phân – Khử khí (tất cá những gì HPLC)
- Quy định trong TC
2. Màng lọc: loại tiểu phân rắn, không lọc tiểu phân khí
- Kích thước: 0,22 và 0,45 micromet
- Phân loại: dựa vào pha động sử dụng
+ Dung môi vô cơ: cellulose nitrat, cellulose acetate
+ Dung môi hữu cơ: teflon
+ Hỗn hợp (DMHC + VC): RC, polyamid hay nylon
3. Sự rửa giải:
- Định nghĩa: lưu giữ CPT ở trên pha tĩnh, CPT giữ nhiều hay ít.
- Phụ thuộc:
+ Tương tác của CPT với PT (ái lực cố định)
+ Khả năng kéo CPT của PĐ
- Phân loại:
Isocratic (đẳng hệ):
+ Sử dụng 1 thành phần dung môi hay một tỉ lệ hỗn hợp dung môi để rửa giải mẫu ra khỏi cột → Tỷ
lệ pha động là hằng số trong quá trình sắc ký
+ Đơn giản, rẻ tiền
+ Khó rửa giải tất cả chất với độ phân giải cao trong thời gian thích hợp
+ Pha động càng mạnh, thời gian rửa giải càng nhanh thì nó phân tách không rõ. Càng giảm pha
động, thời gian rửa giải càng lâu và phân tách càng rõ hơn
Gradient:
+ Thay đổi thành phần pha động theo thời gian → Tỷ lệ PĐ thay đổi trong quá trình sắc kí
+ Dung môi có thể thay đổi theo kiểu bậc thang, tuyến tính hoặc không tuyến tính
 + Nếu được chọn phương pháp tối ưu hơn thì sẽ chọn chế độ gradient vì thời gian ngắn hơn, peak
cũng rõ hơn
] Trên thực tế, nếu chất ta đưa vào phân tích là chất đơn giản (chỉ có từ 1 – 2 chất trong dung dịch),
nếu chế độ đẳng hệ đạt được hiệu quả trong thời gian ngắn thì sẽ ưu tiên chọn chế độ đẳng hệ, còn nếu
gradient thời gian ngắn hơn thì chọn gradient.
- Pha động: Để mô tả độ lưu giữ của chất tan trên cột, thuật ngữ pha động mạnh và pha động yếu được
sử dụng.
Pha động mạnh Pha động yếu
Là pha động nhanh chóng đẩy CPT ra khỏi cột Là pha động đẩy CPT chậm ra khỏi cột
→ Pha động rất tương đồng với pha tĩnh trong → Pha động rất khác với pha tĩnh trong tương tác
tương tác nội phân tử của nó với chất tan nội phân tử của nó với chất tan
Ví dụ: Hexane là một pha động yếu trên pha tĩnh phân cực, nhưng lại là pha động mạnh trên pha tĩnh
kém phân cực
] Bản chất của pha động yếu hay mạnh tùy thuộc vào pha tĩnh đang được sử dụng
Khi lựa chọn một pha động cho sắc ký lỏng, các yếu tố cần phải được cân nhắc:
– Pha tĩnh sẽ sử dụng => Quyết định pha động nào là mạnh hay yếu
– Độ hòa tan của của chất tan
– Độ nhớt của pha động
– Loại đầu dò được sử dụng
– Độ tinh khiết của dung môi
– Độ đồng tan cho dung môi
pha tĩnh phân cực => pha động mạnh là dung môi phân cực
+ pha tĩnh là dung môi kém phân cực => pha động mạnh sẽ là dung môi kém phân cực