Đại học Quốc tế Hồng Bàng

Bộ môn Hóa phân tích

Bài giảng

Sắc ký lớp mỏng

1
Mục tiêu

- Trình bày được cơ chế chính trong SKLM.

- Pha tĩnh và pha động trong SKLM

- Trang thiết bị dùng trong SKLM

- Các bước tiến hành trong SKLM

- Ứng dụng SKLM trong ngành dược

2
Nội dung

1. Giới thiệu – Định nghĩa

2. Pha tĩnh – Pha động
3. Trang thiết bị
4. Nguyên tắc trong SKLM
5. Các bước tiến hành khi thực hiện SKLM
6. Vài thông số đặc trưng của SKLM
7. Ứng dụng của SKLM
8. Đánh giá SKLM

3
1. Giới thiệu – Định nghĩa
• 1906: Mikhail Tswett phân tích sắc tố thực vật gọi tên là pp sắc ký.
• 1938: Izmailov và Schraiber dùng bột oxyd nhôm để phân tích dịch
chiết alkaloid thực vật.

4
• SKLM là một PP sắc ký dùng chất hấp phụ làm pha tĩnh trải thành lớp
mỏng trên tấm kính, nhựa hay kim loại. Quá trình tách các hợp chất xảy
ra khi cho pha động là dung môi di chuyển qua pha tĩnh
• Cơ chế: hấp phụ chiếm phần lớn.

5
 2. Pha tĩnh – Pha động

2.1. Pha tĩnh: chất hấp phụ (đã được tiêu chuẩn
hóa, được ghi trong dược điển) làm pha tĩnh trải
thành lớp mỏng trên tấm kính, nhựa hay kim loại.
• Chất hấp phụ có tính chất kết dính: silicagel G
(silicagel có cho thêm 5 – 15% CaSO4), oxyd
nhôm G. (G:gypsum)
• Chất hấp phụ không kết dính: Silicagel H, oxyd
nhôm H.
• Chất hấp phụ có thêm chất chỉ thị huỳnh
quang: Silicagel GF254, Silicagel HF254 (có thêm
chất chỉ thị phát huỳnh quang 254nm).

6
2. Pha tĩnh – Pha động
2.1. Pha tĩnh

Silicagel: Alumina:
• Sử dụng rộng rãi nhất. • Oxyd nhôm trung tính, acid, base.
• Hoạt hóa 120oC/giờ trước khi sử • Hoạt hóa 120oC/giờ trước khi sử
dụng. dụng.
7
2. Pha tĩnh – Pha động
2.2. Pha động
• Thay đổi tùy theo cơ chế tách.
• Tăng cường sức rửa giải: thường kết hợp 2 dung môi.
• Không có quy tắc cụ thể để lựa chọn dung môi.
• Sắc ký sơ bộ để thăm dò hệ dung môi.
• Nên chọn hệ dung môi đơn giản và dùng loại tinh khiết.
• Hướng dẫn lựa chọn pha tĩnh và pha động:
 Tính chất của mẫu phân tích: độ hòa tan, độ phân cực, số lượng và
đặc tính các nhóm chức.
 Khả năng hấp phụ của pha tĩnh.
 Dung môi: Độ bay hơi, độ nhớt, độ tinh khiết, sự phân lớp. 8
2. Pha tĩnh – Pha động
2.2. Pha động
Một số nhóm chức có độ phân cực tăng dần:

Dung môi với sức rửa giải (sức dung môi) tăng dần:

9
3. Nguyên tắc trong SKLM
SKLM: một trong những phương pháp đơn giản nhất của sắc ký, dựa
trên tác động tương hổ theo kiểu tĩnh điện.
• Đặt một vết lên bản mỏng (giấy, silic,…) để tách bằng cách nhúng
bản mỏng trong một dung môi hay hỗn hợp dung môi (chất rửa giải).
• Chất rửa giải phân tán theo chiều dài của giá mang.
• Vết di chuyển nhanh hay chậm tùy thuộc vào bản chất của tương tác
mà vết chịu ảnh hưởng của giá mang và chất rửa giải: Chất rửa giải
phân cực: dễ dàng kéo theo các chất phân cực vào pha động => di
chuyển nhanh.
• Sự phân cực của chất rửa giải quyết định sự di chuyển của các hợp
10
chất.
3. Nguyên tắc trong SKLM
3.1. Chọn giá mang (pha tĩnh):
• Bao gồm ba loại chính: Silice, alumine, cellulose => được phủ trên
một bản mỏng bằng nhôm, thủy tinh.
• Một vài loại không màu dưới ánh sáng tự nhiên nhưng có màu xanh
lá dưới đèn UV (ZnS hấp thu ở 256 nm).
 Silice: giá mang được sử dụng nhiều nhất.
 Alumine: dùng đối với các hợp chất có tính kiềm.
 Cellulose: đối với các hợp chất rất phân cực như các đường hay
các acid amin.

11
3. Nguyên tắc trong SKLM
3.2. Lựa chọn chất rửa giải (pha động):
• Quan trọng.
• Thường là một hỗn hợp 2 – 3 dung môi với những tỷ lệ xác định.
• Lựa chọn dung môi: phụ thuộc vào tính phân cực của chất phân tích.
Làm thế nào thực hiện một SKLM khi chưa có thông tin?
 Giá mang (pha tĩnh): Silice
 Chất rửa giải (pha động): Làm thử với hỗn hợp ether dầu hỏa (không
phân cực) và acetat etyl (phân cực) theo những tỷ lệ thay đổi: 100-0, 75-
25, 50-50, 25-75,…
 Sau đó chọn dung môi phân cực nhất như acid acetic.
12
4. Trang thiết bị (TLC)
Bản mỏng:

Bình sắc ký:

Ống mao quản:

13
4. Trang thiết bị (HPTLC)

14
5. Các bước tiến hành khi thực hiện SKLM

Gồm 4 giai đoạn:

• Chuẩn bị bình khai triển.
• Chuẩn bị bản mỏng.
• Tiến hành rửa giải (khai triển)
• Phát hiện.

15
5. Các bước tiến hành khi thực hiện SKLM

5.1. Chuẩn bị bình khai triển: gồm bình chứa và nắp đậy.
• Nắp đậy để dung môi không bay hơi và nhất là để thực hiện một SKLM
trong điều kiện không khí bão hòa (áp suất hơi bão hòa của dung môi)
nhằm giá trị thu được các lần phân tích có tính lặp lại.
• Chuẩn bị dung môi khai triển, pha đúng tỷ lệ. Chiều cao dung môi trong
bình khai triển là 0,5 cm, sau đó đậy nắp lại.
• Bão hòa dung môi trong bình khai triển: Đặt một tờ giấy lọc theo chiều
thẳng đứng vào bình khai triển. Dung môi theo hiện tượng mao dẫn
thấm dần hết tờ giấy => bão hòa không khí bằng hơi của dung môi.

16
5. Các bước tiến hành khi thực hiện SKLM
5.2. Chuẩn bị bản mỏng:
Thí dụ: Chuẩn bị một bản mỏng dùng để chấm 3 vết.
- Cắt bản mỏng kích thước 6x12 cm.
- Dùng bút chì kẻ một đường thẳng cách bờ dưới của bản mỏng (gọi là
vạch xuất phát): 1cm. Trên đường kẻ, đánh dấu 3 điểm cách đều nhau.
- Từ vạch xuất phát đo 10cm, kẻ một đường thẳng (gọi là vạch tiền tuyến).
- Dùng ống mao quản chấm lấy dung dịch mẫu => chấm vào các điểm để
đánh dấu trên bản mỏng.
- (Chú ý: các vết chấm tròn càng nhỏ càng tốt; dung dịch mẫu loãng cần
chấm nhiều lần, nhưng phải khô rồi mới chấm vết tiếp theo; không được
để ngón tay chạm vào bản mỏng). 17
5. Các bước tiến hành khi thực hiện SKLM

5.3. Khai triển:

• Đặt bản mỏng vào bình khai triển, đậy nắp và để dung môi khuếch tán.
• Khi dung môi chạy lên đến vạch tiền tuyến thì ngưng khai triển.
• Lấy bản mỏng ra, làm khô bản mỏng bằng không khí hoặc bằng bếp điện.

Kỹ thuật khai triển:

• Sắc ký một chiều

• Sắc ký hai chiều
 Mẫu phân tích nhiều chất
 Sắc ký 1 chiều không đủ tin cậy

18
5. Các bước tiến hành khi thực hiện SKLM

5.4. Phát hiện

• Nếu các vết có màu => đánh dấu bằng cách dùng viết chì khoanh lại.
• Phần lớn các hợp chất không màu => phát hiện bằng các cách sau:
 Đèn UV (256 hoặc 350 nm): Nếu bản mỏng phát quang dưới đèn UV,
bản mỏng có màu xanh lá trừ các vết được khoanh lại bằng viết chì.
 Hơi iod: Nhiều hợp chất hữu cơ có vết vàng nâu khi phát hiện bằng
hơi iod. Trong 1 lọ, đặt bản mỏng và tinh thể iod, đậy kín => các vết
màu xuất hiện.
 Phun thuốc thử hiện màu.
 Dùng máy đo mật độ quang.
19
5. Các bước tiến hành khi thực hiện SKLM

5.4. Phát hiện

20
6. Vài thông số đặc trưng của SKLM
6.1. Hệ số lưu giữ Rf

­ Rf = 0: Chất tan hoàn toàn không di chuyển,

nằm tại điểm xuất phát.
­ Rf = 1: Chất tan di chuyển cùng với vận tốc của
dung môi.
­ dR: khoảng di chuyển được của chất cần tách

­ dM: khoảng di chuyển được của dung môi

­ V: vận tốc di chuyển của chất cần tách
21
6. Vài thông số đặc trưng của SKLM
6.1. Hệ số lưu giữ Rf: Các yếu tố ảnh hưởng đến Rf
- Chất lượng và hoạt tính của chất hấp phụ
- Chiều dày của lớp mỏng, quãng đường sắc ký.
- Lượng chất chấm.
- Vị trí và số lượng chất cần tách trên bản mỏng.
- Thành phần và độ tinh khiết của pha động
- Phương pháp khai triển sắc ký Hiện tượng bờ

- Độ bão hòa của dung môi trong bình sắc ký (hiện tượng bờ)
- Ảnh hưởng của các cấu tử khác có trong thành phần hỗn hợp cần tách.
- Độ ẩm, nhiệt độ và pH…
22
6. Vài thông số đặc trưng của SKLM
6.1. Hệ số lưu giữ Rf: Sử dụng chất đối chiếu

𝑅 𝑓 ( 𝑋 ) 𝑂𝑋 𝑂𝐴 𝑂𝑋
𝑅 𝑆 ( 𝑋 )= = : =
𝑅 𝑓 ( 𝐴) 𝑂𝐹 𝑂𝐹 𝑂𝐴

- Hai chất giống nhau lần lượt phải có Rf

và RS bằng nhau.
- Hai chất phải có cùng lượng chấm như
1 2 3
nhau và được triển khai trong cùng điều
kiện sắc ký.
23
6. Vài thông số đặc trưng của SKLM
6.2. Hệ số dung lượng

′ 𝑑 𝑀 − 𝑑𝑅 1 − 𝑅 𝑓
𝑘= =
𝑑𝑅 𝑅𝑓

6.3. Số đĩa lý thuyết biểu kiến

( )
2
𝑑𝑅
𝑁 =16
𝑊

6.4. Độ phân giải

2[ 𝑑 𝐵 − 𝑑 𝐴 ]
𝑅 𝑆=
𝑊 𝐴 +𝑊 𝐵

24
7. Ứng dụng của SKLM
- Định tính và thử tinh khiết

• Dựa vào Rf
• Sắc ký so sánh chất thử X với chất đối chiếu A trên cùng một sắc ký đồ.
• Điều kiện X là A: Rf(X)=Rf(A) với các hệ dung môi khác nhau.
• Chất thử được coi là tinh khiết khi trên sắc ký đồ không có vết lạ.
- Bán định lượng – định lượng
• Đo diện tích hay cường độ màu vết sắc ký
• Dùng máy đo mật độ quang (Densitometer): chiếu chùm tia vào vết sắc
ký và đo cường độ hấp thụ hoặc huỳnh quang.
• Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số độ phân giải cao.
25
7. Ứng dụng của SKLM
- Định tính so sánh dược liệu (Dấu vân tay)
- Dựa vào màu sắc và Rf

1: Sâm Mỹ; 2: Sâm Trung Quốc; 3: Tam thất; C: Sâm Ngọc Linh chuẩn; 4-8: các mẫu
26
"Sâm Việt Nam" ngoài thị trường dược liệu; các chuẩn: MR2; Rb1; Rg1.
HPTLC chromatogram (Ethyl acetate – water – butanol 25:50:100, lớp trên), phát hiện: Anisaldehyde / sulfuric
acid reagent. (Analytix Reporter, ISSUE 2, 2018, Merck.)

Track 1: ginsenoside Rf (green arrow); 2: ginsenoside F11 (red arrow); 3: P. ginseng root extract 4: P. ginseng
root; 5: P. quinquefolium root extract; 6: P quinquefolium root; 7: P. notoginseng root extract; 8: P. notoginseng
root; 9: P. japonicas root; 10: P. vietnamensis root; 11: wild Vietnamese ginseng root. 27
7. Ứng dụng của SKLM
SKLM hieäu naêng cao
(High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC)

28
7. Ứng dụng của SKLM
SKLM hieäu naêng cao
(High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC)

29
7. Ứng dụng của SKLM

30
7. Ứng dụng của SKLM
- Thăm dò dung môi cho sắc ký cột và HPLC

31
8. Đánh giá SKLM: Ưu điểm

• Phương pháp đơn giản: thử tinh khiết, xác định giới hạn tạp chất, phát
hiện các chất lạ, định tính, bán định lượng và định lượng.
• Sử dụng phổ biến để nghiên cứu và sàng lọc.
• Kỹ thuật và thiết bị đơn giản.
• Sử dụng linh hoạt: dễ thay đổi chất hấp phụ, dung môi khai triển cũng
như thuốc thử phát hiện, kể cả các loại thuốc thử ăn mòn mà sắc ký giấy
không dùng được.
• Thời gian tiến hành nhanh (15-30 ph, tối đa vài giờ) và độ nhạy cao hơn
sắc ký giấy.

32
8. Đánh giá SKLM: Ưu điểm

• Là một phương pháp vi phân tích.

• Có thể dùng để tìm các điều kiện tối ưu cho sự tách bằng sắc ký lỏng
trên cột.
• Phạm vi ứng dụng rộng rãi: kiểm tra hiệu quả chiết tách của các
phương pháp khác như sắc ký cột, chiết xuất, chưng cất, tái kết tinh,
…
• Phát hiện tất cả các chất kể cả các chất không di chuyển theo pha
động.
• Thực hiện dễ dàng các mẫu nhiều thành phần.

33
8. Đánh giá SKLM: Nhược điểm

• Trị số Rf có độ lặp lại thấp do thành phần pha động thay đổi trong
quá trình khai triển sắc ký.
• Tăng giãn độ rộng vết do khuếch tán vì tốc độ dòng pha động thấp.

34
35