Chuẩn bị thí nghiệm hóa hữu cơ

Bài 4: Sắc ký lớp mỏng

1. Mục tiêu bài thí nghiệm: Sau khi học xong bài này sinh viên có khả năng:
- Trình bày được nguyên tắc tách các hợp chất hữu cơ bằng kỹ thuật sắc ký.
- Áp dụng được kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để phân tích và đánh giá được mức độ sạch của một
mẫu.
- Áp dụng được kỹ thuật sắc ký lớp mỏng điều chế để tinh chế hợp chất hữu cơ.
2. Tính chất vật lý và tính an toàn của các hóa chất.

Tên Cấu trúc MW mp (oC) bp (oC) Tỷ trọng Tính

hợp chất an toàn
n-Hexane C6H14 86,18 g/mol -95oC (178K) 69oC (342K) 0,6548 g/ml
Ethyl acetate C4H8O2 88,11 g/mol -84oC (190K) 77oC (350K) 0,897-0,902 g/m3
Acetone (CH3)2CO 58,04 g/mol -95oC (178K) 56oC (329K) 0,791 g/m3
Methanol CH3OH -97,6oC (175,6K) 64,7oC (337,8K) 0,7918 g/m3
Sodium sulfate Na2SO4 142.04 g/mol 884 °C (khan) 1429 °C (khan) 2.664 g/cm³
(khan) 32.38 °C (khan)
322.20 g/mol (decahydrat) 1.464 g/cm³
(decahydrat) (decahydrat)
Silica gel
3. Quy trình tiến hành thí nghiệm
- Các giai đoạn thực hiện TLC phân tích định tính
Giai đoạn 1: Chuẩn bị vi quản
 Bước 1: Dùng hai tay cầm hai đầu ống vi quản, dùng các đầu ngón tay vừa se tròn, vừa hơ nóng
đoạn giữa của vi quản đến khi mềm dẻo.
 Bước 2: Đưa ống vi quản tránh khỏi ngọn lửa rồi kéo từ từ hai đầu ống ra xa khỏi nhau đến khi
đạt khoảng cách 4-5 cm
 Bước 3: Giữ yên cho đến khi thủy tinh nguội và đặc cứng lại. Bẻ đôi thu được hai ông vi quản.
Giai đoạn 2: Chuẩn bị bảng TLC
 Bước 1: Dùng viết chì và thước để chia bảng TLC 20x20 thành 4 phần 20x5, dùng kéo để cắt
bảng.
 Bước 2: Kẻ nhẹ một đường thẳng cách mép trên bảng 0,5cm làm vạch kết thúc.
 Bước 4: Tùy theo số lượng mẫu cần chấm mà cắt bảng TLC với chiều rộng phù hợp. Dùng bút
chì đánh chì dấu các vị trí chấm mẫu sao cho các vị trí cách nhau và cách mép bảng TLC
khoảng 0,5 – 1,0 cm
Giai đoạn 3: Chuẩn bị dung môi
 Bước 1: Dùng ống đong pha 10 mL hệ dung môi hexane: acetone (7:3, v/v)
  Bước 2: Cho vào bình giải ly có đặt sẵn một tấm giấy lọc, nghiêng đảo nhẹ dung môi thấm ướt
tờ giấy lọc.
 Bước 3: Đậy nắp bình giải ly và để yên
Giai đoạn 4: Chấm mẫu chết lên bảng TLC
 Bước 1: Chuẩn bị mẫu
(1) Cân khoảng 1g lá mổng tơi khô cắt nhỏ rồi cho vào cối sứ, dùng chày nghiền nhuyễn, thêm 0,5g
Na2SO4 khan và 10 mL acetone, khuấy trộn đều (lượng acetone lấp xấp mẫu). Gạn dịch chiết
vào ống nghiệm. Dùng thêm 2 mL acetone để tráng rửa phần bã và chày cối và chuyển tất cả
dịch acetone vào oogns nghiệm (thực hiện tráng rửa 2 lần)
(2) Cho 1g Na2SO4 khan cho vào dịch chiết aceton. Lắc đều
(3) Gạn phần dịch chiết, bỏ phần chất rắn, chuyển dịch chiết vào cốc 50 mL. Làm bay hơi dung môi
trên bếp cách thủy, thu được phần cặn làm mẫu chấm bảng TLC
 Bước 2: Hòa tan phần cặn bằng 0,5 mL hexane
 Bước 3: Chấm đầu ống vi quản vào dung dịch mẫu
 Bước 4: Chạm nhẹ đầu vi quản vào bảng TLC tại điểm trên vạch xuất phát. Nhanh chóng nhấc
vi quản rời khỏi bảng TLC để vết chấm chỉ lan rộng ra thành vết tròn có đường kính 1mm
 Bước 5: Tùy thuộc nồng độ mẫu mà chấm vài lần vào một điểm đến khi thấy vết có màu vàng
rõ. Trước khi chấm lần kế tiếp cần làm bay hơi dung môi tại vết đã chấm
 Bước 6: Sấy nhẹ làm bay hơi dung môi
 Bước 7: Nếu cần khảo sát nhiều mẫu khác nhau, chấm mỗi mẫu một vết trên vạch xuất phát của
bảng TLC. Các vết cách nhau 0,5 – 1,0 cm. Hai vết ở ngoài bìa phải cách gờ cạnh 1 cm
Giai đoạn 5: Triển khai bảng TLC
 Bước 1: Đặt bảng TLC vào bình giải ly, cạnh đấy của bảng TLC chạm vòa đáy của bình và ngập
trong dung môi. Vạch xuất phát và các vết chấm mẫu không được ngập vào dung môi.
 Bước 2: Đậy nắp bình giải ly và để yên
 Bước 3: Chờ đến khi mực dung môi thấm dần và dâng lên đến vạch kết thúc thì nhấc bảng TLC
ra khỏi bình giải ly và sấy khô bảng TLC.
Giai đoạn 6: Hiện hình vết trên bảng TLC
Bước 1: Quan sát bằng mắt thường (1) Quan sát sự hiện màu các vết. (2) Chụp ảnh lại để lưu trữ. Bước
2: Phát hiện bằng đèn tử ngoại (UV) (1) Đặt bảng TLC dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm và quan sát.
(2) Chụp ảnh lại để lưu trữ. (3) Dùng viết chì khoanh những vết có màu tối trên nền sáng. Bước 3: Hiện
vết bằng dung dịch vanillin/H2 SO4 (với chất không màu) (1) Nhúng bảng TLC vào bình đựng dung
dịch H2 SO4 50%. Cạ nhẹ bảng trên thành bình để phần acid dư về lại bình. Đặt mặt nhôm của bảng
TLC lên tờ giấy thấm để ráo acid. (2) Đặt bảng TLC lên mặt bếp gia nhiệt để hơ nóng. (3) Quan sát sự
hiện màu các vết. (4) Chụp ảnh lại để lưu trữ.
Giai đoạn: Tính toán Rf
Bước 1: Dùng thước đo khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm từng vết trên bảng TLC. Bước 2: Đo
khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch kết thúc Bước 3: Tính toán Rf theo công thức đã trình bày ở
phần lý thuyết. Bước 4: Xem các vết hiện trên TLC đã trong giới hạn Rf phù hợp chưa. Nếu chưa, thực
hiện quy trình tương tự lần thứ hai với hệ dung môi giải ly do nhóm tự đề xuất. Bước 5: So sánh kết
quả TLC với các hệ dung môi giải ly đã thực hiện. Nhận xét.
TLC phân tích định lượng
Giai đoạn 1: Chuẩn bị vi quản
Thực hiện thao tác kéo vi quản tương tự như phần TLC phân tích định tính. Nhưng lưu ý một số vấn đề
sau: - Sử dụng ống vi quản có đường kính lớn. - Sau khi kéo ống vi quản, bẻ phần đầu thủy tinh thừa
sát vào trong sao cho đầu ống vi quản có kích thước lớn hơn để mẫu dễ dàng thoát ra với lượng lớn
Giai đoạn 2: Chuẩn bị bảng sắc ký lớp mỏng điều chế (prep TLC)
Thực hiện công đoạn chuẩn bị bảng prep.TLC tương tự như phần TLC phân tích định tính. Nhưng lưu
ý một số vấn đề sau: - Chuẩn bị 1 bảng prep.TLC có kích thước 5 cm x 10 cm (có thể dùng bảng có
kích thước lớn hơn trong các trường hợp mẫu khó tách). - Kẻ vạch xuất phát cách mép dưới bảng 1,5
cm. - Kẻ vạch kết thúc cách mép trên bảng 0,5 cm.
Giai đoạn 3: Chuẩn bị dung môi
Bước 1: Từ kết quả TLC của các thí nghiệm trước, chọn ra hệ dung 88 môi phù hợp để tách các chất
(các vết) ra khỏi nhau. Sử dụng hệ dung môi này cho prep.TLC. Bước 2: Đặt một tấm giấy lọc vào bình
giải ly, Bước 3: Cho vào bình giải ly lớn 20 mL hệ dung môi đã chọn, nghiêng đảo nhẹ để dung môi
thấm ướt tờ giấy lọc. Bước 4: Đậy nắp bình giải ly và để yên
Giai đoạn 4: Chấm mẫu chất lên bảng prep TLC
Bước 1: Dùng mẫu dịch chiết lá mồng tơi đã chuẩn bị ở phần trước. Bước 2: Chấm ống vi quản vào
dung dịch mẫu, để mẫu chất dâng lên tối đa trong ống vi quản. Bước 3: Chạm nhẹ đầu vi quản vào
bảng prep.TLC tại vạch xuất phát. Đặt nghiêng ống vi quản và kéo một đường thẳng dọc theo vạch
xuất phát (yêu cầu thao tác kéo đều, thẳng, vạch dứt khoát). Lặp lại 3 lần. Bước 4: Sấy nhẹ làm bay hơi
dung môi
Giai đoạn 5: Triển khai bảng prep TLC
Bước 1: Đặt bảng TLC vào bình giải ly, cạnh đáy của bảng prep. TLC chạm vào đáy của bình và ngập
vào dung môi. Vạch xuất phát và các vết chấm mẫu không được ngập vào dung môi. Bước 2: Đậy nắp
bình giải ly và để yên. Bước 3: Chờ đến khi mực dung môi di chuyển đến vạch kết thúc thì nhấc bảng
prep.TLC ra khỏi bình giải ly và sấy khô.
Giai đoạn 6: Phát hiện vết trên bảng prep TLC
Bước 1: Phát hiện bằng đèn tử ngoại (UV) (1) Đặt bảng TLC dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm và
quan sát. (2) Dùng viết chì khoanh vùng có màu tối. Bước 2: Phát hiện hình vết bằng dung dịch vanilin
pha trong acid (1) Cắt rìa 2 mép ngoài của bảng prep. TLC với khoảng cách mép bảng 0,5 cm. 89 (2)
Nhúng 2 rìa mép bảng TLC vào bình đựng dung dịch vanilin pha trong acid. Thực hiện bước hiện hình
tương tự với TLC phân tích định tính. (3) Đặt 2 rìa mép vào vị trí ban đầu và đánh dấu vùng hiện màu.
(4) Căn cứ vào mép này và vùng chuyển màu mờ mờ trên bảng để định hình vùng chất cần tách. Lưu ý:
nếu thực hiện đúng thì vùng này trùng với vùng đánh dấu bằng viết chì khi soi đèn UV
Giai đoạn 7: Tách chất cần tinh chế
Bước 1: Dùng dao nhọn hoặc mũi nhọn của spatula khắc vào bảng prep.TLC theo dấu viết chì. Bước 2:
Cạo silica gel hấp phụ theo từng vùng chất và để vào các hũ bi riêng cho từng chất. Bước 3: Cho 10 mL
hỗn hợp hexane : acetone (7:3, v/v) vào hũ bi chứa chất màu vàng và 10 mL hỗn hợp acetone :
methanol (8:2, v/v) vào hũ bi chứa chất màu xanh, đun cách thủy 2 phút. Bước 4: Chuẩn bị 2 pipet
Pasteur có nhét bông cotton ở đầu mũi. Bước 5: Dùng các pipet Pasteur này đưa vào hút dung dịch
trong từng hũ bi và chuyển vào từng hũ bi sạch. Bước 6: Thêm hỗn hợp dung môi tương ứng từng mẫu
vào từng hũ bi chứa silica gel để giải hấp triệt để. Hút lấy dịch lọc và chuyển vào hũ bi đựng mẫu chất
tương ứng. Bước 7: Đuổi dung môi trên bếp khuấy từ gia nhiệt (đặt trong tủ hút khí độc) để thu chất
tinh khiết.
Giai đonạ 8: Kiểm tra độ tinh khiết bằng TLC
Bước 1: Dùng TLC để kiểm tra hiệu quả của quá trình tách bằng cách chấm mẫu dịch trích và các chất
sau khi tách bằng prep.TLC trên cùng một bảng TLC (5 x 3 cm). Bước 2: Triển khai TLC với hệ dung
môi phù hợp. 90 Bước 3: Quan sát màu sắc các vết ở điều kiện thường và dưới đèn UV 254 và 365 nm.
Bước 4: Chụp hình và lưu kết quả. Bước 5:Tính toán Rf các vết. Bước 6: Nhận xét