Họ và tên: Trần Mạnh Hùng

MSSV: 20200264
Lớp: 716644 – chiều thứ 5

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Bài 1: Xác định hàm lượng Nito tổng số bằng phương pháp Kjeldahl

I. Nguyên tắc của phương pháp Kjeldahl

 Giai đoạn 1: Vô cơ hóa mẫu
Khi đun nóng mẫu cần phân tích với H2SO4 đặc nóng cùng các chất xúc tác cần
thiết, các hợp chất hữu cơ bị oxy hóa. Các thành phần Cacbon, Hydro, Lưu
Huỳnh tạo thành C O2 , H 2 O , S O2. Nito được giải phóng ra dưới dạng N H 3 kết
hợp với H2SO4 trong dung dịch tạo thành muối Amoni sunfat ( N H 4 ) 2 S O4 tan
trong dung dịch.
Phản ứng:
Protein và các chất hữu cơ + H2SO4  NH3 + CO2 + SO2 + H2O
2NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4
 Giai đoạn 2: Cất mẫu
Sử dụng dung dịch kiềm mạnh NaOH hoặc KOH để đẩy NH3 ra khỏi muối, cất
và thu nó bằng lượng dư axit boric H 3 B O 3.
Phản ứng:
(NH4)2SO4 + 2NaOH  Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O
NH4OH + 4H3BO3  (NH4)2B4O7 + 7H2O
 Giai đoạn 3: Định phân
Định phân lượng Amon Tetraborat vừa rồi bằng dung dịch H2SO4 0,1N, từ đó
tính được lượng Nito có trong mẫu cần phân tích.
Phản ứng:
(NH4)2B4O7 + H2SO4  (NH4)2SO4 + 4H3BO3
II. Cách tiến hành thí nghiệm
1.Chuẩn bị
- Kiểm tra mức nước trong bình đun.
- Kiểm tra các khóa, van của bộ cất.
- Cho nước vào máy chạy qua ống sinh hàn.
- Đun sôi nước trong bình tạo hơi và rửa bộ cất đạm.
- Mẫu thí nghiệm là dịch vô cơ hóa mẫu đã được phòng thí nghiệm chuẩn bị
sẵn.
- Khi bắt đầu thí nghiệm, bật bếp từ và đun sôi bình đun.

Hình ảnh bộ chưng cất đạm Kjendahl

2. Cất đạm
- Chuẩn bị bình hấp thụ NH3: Cho vào bình tam giác (cỡ 100ml):
 20 ml H3BO3 3% (dùng ống đong)
 2-3 giọt chỉ thị Taxiro
 Lắp bình vào bộ cất đạm (đuôi ống sinh hàn ngập trong dung dịch)
- Chuẩn bị cho vào bầu cất của bộ cất đạm lần lượt:
 5 ml NaOH 40% (dùng ống đong)
  2 ml H20 dùng để tráng phễu (sử dụng micropipet); Đóng khóa bầu cất
 5 ml dung dịch vô cơ hóa mẫu (dùng micropipet hút dịch)
- Hấp thụ NH3 bằng axit boric H3BO3 với sự có mặt của chất chỉ thị Taxiro.
Lúc này dung dịch có màu tím sau, sau khi hấp thụ NH3 dung dịch chuyển sang
màu xanh lá ( trước khi chưa hấp thụ NH3, môi trường trong bình là môi trường
axit yếu nên Taxiro có màu tím, sau khi hấp thụ NH3 môi trường axit trong bình
được trung hòa nên thuốc thử Taxiro có màu xanh lá)..
- Quá trình tiến hành cất diễn ra trong khoảng từ 5-7 phút. Sử dụng giấy quỳ
để kiểm tra xem lượng NH3 đã được hấp thụ hoàn toàn chưa, nếu giấy quỳ
chuyển xanh thì tiếp tục quá trình cất đạm tiếp.

3. Định phân
- Định Phân lượng (NH4)2B4O7 thu được trong bình cất đạm bằng dung dịch
H2SO4 0,1N. Định phân mẫu đến khi dung dịch xuất hiện màu tím trở lại thì
dừng quá trình chuẩn độ. Do H2SO4 tác dụng với Amoni tetraborat tạo ra axit
boric làm môi trường axit yếu trở lại làm cho chất chỉ thị chuyển từ xanh lá
sang màu tím).
- Ghi lượng H2SO4 vừa chuẩn độ.
III. Tính toán, nhận xét kết quả thí nghiệm
1. Số liệu, tính toán kết quả thí nghiệm
 Kết quả phân tích:
Thể tích H2S04 dùng cho mẫu thí nghiệm = 2,15 ml
Thể tích H2SO4 dùng cho mẫu kiểm chứng = 0,05ml
 Ta có:
Thể tích H2SO4 dùng để định phân = Thể tích H2SO4 dùng cho mẫu thí
nghiệm - Thể tích H2SO4 dùng cho mẫu kiểm chứng = 2,15 - 0,05 = 2,1(ml)
 Ta có:
1 ml H2SO4 0,1N định phân tương ứng 1,4mg Nito trong mẫu cất
=> 2,1 ml H2SO4 0,1N định phân tương ứng 2,1 x 1,4 = 2,94 mg Nito
Vậy 5ml dung dịch cất đạm có 2,94 mg Nito => 100ml dung dịch cất đạm có
2,94 x 100/5 = 58,8 mg = 0,06g
=> Hàm lượng Nito 0,06% (g/100ml)
Biết N chiếm 16% trong Protein => Lượng protein kết tủa: 0,06 : 16% = 0,375g
5g mẫu có 0,375g protein => hàm lượng protein là: 0,375/5 x 100%= 7,5%

2. Nhận xét kết quả thí nghiệm

Sai số xuất hiện trong phép đo có xuất hiện có thể từ các nguyên nhân sau: Sử
dụng pipet để lấy mẫu chưa chính xác; trong quá trình thêm mẫu vào bầu cất
một phần NH3 bị bay hơi do khóa van không được đóng lại ngay khi thêm hoặc
quá trình thêm mẫu vô cơ hóa vào bầu 1 phần còn dính trên phễu mà chưa được
tráng rửa sạch; quá trình cất đạm NH3 chưa được hấp thụ hoàn toàn vào bình
hấp thụ; kĩ thuật định phân còn chưa chính xác.
IV. Các chú ý khi làm thí nghiệm
- Quá trình vô cơ hóa mẫu có giải phóng CO2 và SO2 vì vậy quá trình đốt
mẫu cần diễn ra trong tủ hút.
- Ở bước vô cơ hóa mẫu, nhiệt độ vô cơ hóa mẫu cao thường từ vài trăm độ C
trở lên( thường từ 280 – 350 độ C). Thời gian vô cơ hóa mẫu phụ thuộc vào
lượng mẫu vật, nguồn nhiệt, chất xúc tác, nồng độ H2SO4.
VD: Nếu dùng lượng CuSO4 với lượng lớn khoảng 1-2g thì thời gian đốt mẫu
trong khoảng 3,5h.
- Thông thường ta sử dụng Selen kim loại kết hợp với CuSO4 và K2SO4 theo
tỉ lệ ( 1:10:100) thì quá trình phá mẫu được tối ưu thời gian.
- Trong quá trình cất đạm, cần đặt bình hấp thụ NH3 vào trước rồi mới cho
dung dịch NaOH và dung dịch vô cơ hóa mẫu vào để tránh thất thoát lượng
NH3 sẽ gây sai lệch kết quả.
- Thực hiện cho vào bầu cất lần lượt: NaOH, H2O, dung dịch vô cơ hóa mẫu;
sau khi thêm vào bầu cất thì khóa van ( hoặc kẹp ống đưa vào bằng dụng cụ) để
tránh NH3 bay ra ngoài làm sai lệch kết quả đo. Quá trình thực hiện thêm vào
bầu cất, do bộ dụng cụ đang ở nhiệt độ cao vì vậy cần thực hiện quá trình thật
nhanh vừa tránh thất thoát lượng NH3, tránh bị bỏng.
- Quá trình định phân, định phân dung dịch vừa thu được bằng H2SO4 0,1N.
Định phân ban đầu chậm 1-2 giọt rồi lắc đều dung dịch trong bình, rồi tiếp tục
định phân dung dịch đều tay, đến khi dung dịch chuyển sang màu tím nhạt thì
dừng quá trình định phân.
- Phải thực hiện với mẫu đối chứng để thấy được yếu tố môi trường trường tác
động đến kết quả của thí nghiệm.

V. Phạm vi áp dụng của phương pháp

- Xác định nito protein, nito phi protein, và hàm lượng protein trong mẫu
 Khi xác định Nito trong thành phần của protein, người ta tách protein ra
khỏi các hợp chất chứa nito bằng phương pháp kết tủa, sau đó đem đốt
kết tủa protein thu được với H2SO4 đặc, rồi xác định nito protein bằng
phương pháp Kjeldahl
 Nếu biết hàm lượng nito protein, nhân với hệ số 6,25 ta được hàm lượng
protein chưa trong mẫu nghiện cứu ( đối với sữa thì nhân hệ số 6,38 còn
đối với ngũ cốc các loại đậu đỗ thì nhân với hệ số 5,7)
 Lấy lượng nito tổng số trừ đi lượng nito protein ta được lượng nito phi
protein hoặc xác định trực tiếp bằng cách vô cơ hóa nước lọc sau khi kết
tủa protein
- Xác định nitơ amoniac ( đạn thối)
 Để giải phóng NH3 khỏi dung dịch, người ta dùng các kiềm yếu và ít tan
trong nước (MgO và CaO)
 Cất amonia ở nhiệt độ 35-40 độ C và dưới áp suất thấp khoảng 15-
20mmHg, sau đó thu nó bằng một lượng dư axit Boric. Định phân lượng
tetraborat amon tạo thành bằng dung dịch H2SO4