BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH

Bài 1: Xác định hàm lượng Nitơ tổng số bằng

phương pháp Kjeldahl

1.Họ tên: Lê Văn Việt

MSSV: 20190398

2. Nguyên tắc của phương pháp phân tích:

a. Nguyên tắc chung:

- Khi đốt nóng mẫu phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợp chất hữu
cơ bị oxi hóa. Các hợp chất cacbon, hidro, lưu huỳnh tạo thành
CO2, H2O, SO2. Còn N2 sau khi được giải phóng ra dưới dạng NH3
kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch.
- Đuổi NH3 khỏi dung dịch bằng NaOH đồng thời cất và thu NH3
bằng lượng dư axit Boric H3BO3. Định phân lượng Tetraborat
amon tạo thành bằng dung dịch H2SO4 0,1N chuẩn, từ đó tính được
lượng nitơ có trong mẫu nguyên liệu thí nghiệm.
(Để xác định thời điểm dừng chuẩn độ bằng H2SO4 thì ta cần bổ sung
chất chỉ thị Taxiro vào bình hấp thụ NH3.)

b. Giải thích nguyên tắc:

- Giai đoạn vô cơ hóa mẫu: Thêm H2SO4 đậm và chất xúc tác. Đốt
nóng hỗn hợp để protein bị oxi hóa. Cacbon và hidro tạo thành
CO2 và H2O còn Nito sau khi được giải phóng ra dưới dạng NH3
kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch:

Protein và các chất hữu cơ + H2SO4 -> NH3 + CO2 + SO2 + H2O
2NH3 + H2SO4 -> (NH4)2SO4
 - Giai đoạn cất đạm: Thêm NaOH sẽ xảy ra phản ứng làm giải phóng
NH3:

(NH4)2SO4 + 2NaOH -> Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O

- Giai đoạn hấp thụ NH3 bằng Acid Boric (Với sự có mặt của chất
chỉ thị Taxiro):

NH4OH + 4H3BO3 -> (NH4)2B4O7 + 7H2O

Lúc này dung dịch trong bình hứng đang có màu tím (Do môi
trường acid yếu của H3BO3 nên thuốc thử Taxiro có màu tím) thì
khi hấp thụ NH3 sẽ chuyển sang màu xanh lá (Do môi trường kiềm
hơn vì đã xảy ra phản ứng trung hòa nên thuốc thử Taxiro có màu
xanh lá).
(Để kiểm tra xem NH3 đã được hấp thụ hoàn toàn hay chưa thì
ta sử dụng giấy quỳ tím, nếu giấy quỳ tím không chuyển màu sang
xanh thì NH3 đã được hấp thụ hoàn toàn)

- Giai đoạn định phân: Định phân lượng Tetraborat amon tạo thành
bằng dung dịch H2SO4 chuẩn:
(NH4)2B4O7 + H2SO4 -> (NH4)2SO4 + 4H3BO3

Thời điểm dừng định phân là thời điểm mà dung dịch trong bình
hấp thụ NH3 vừa chuyển từ màu xanh lá sang màu tím (Do môi
trường lúc này lại có tính acid do H2SO4 phản ứng với Tetraborat
amon tạo ra acid Boric nên chất chỉ thị Taxiro có màu tím).

- Tính toán: Từ lượng H2SO4 tiêu tốn ta nhân với hệ số chuyển sẽ ra

lượng Nitơ tổng số trong mẫu.

● Một số lưu ý khi làm thí nghiệm

- Trong giai đoạn cất mẫu không dùng Ca(OH)2 thay thế cho NaOH
vì Ca(OH)2 sẽ tạo kết tủa.
 - Không phải tất cả nitơ có trong mẫu đều sẽ chuyển thành NH4+
trong dung dịch, nitơ trong N2 và NO sẽ không thể chuyển thành
NH4+ trong dung dịch, vì N2 có liên kết 3 khá bền nên khá trơ về
mặt hóa học, NO là oxit trung tính nên không kết hợp với H2SO4
chuyển về dạng NH4+.
- Khi cất đạm trên bộ cất đạm tự động cần chú ý không để mẫu dính
vào thành bình vì sẽ gây thất thoát mẫu, lượng mẫu vừa phải ( mẫu
giàu protein lấy từ 0.2-0.5g, mẫu ít protein lấy từ 1-2g, mẫu là
dung dịch lấy từ 5-10ml).
- Khi bắt đầu cất đạm nhiệt độ bắt đầu thấp (tầm 100oC) vì nếu nhiệt
độ cao thì H2SO4 sẽ bị bắn dẫn đến mất mẫu, nhiệt độ 100oC cũng
là nhiệt độ sôi của nước nước sẽ bay hơi đi đảm bảo quá trình an
toàn hơn.
- H2O2 được thêm vào cuối quá trình nếu cần để quá trình OXH xảy
ra triệt để. Tuy nhiên H2O2 là peoxit không bền nhiệt nên nếu thêm
vào ngay từ đầu thì H2O2 có thể bị phân hủy gây lãng phí.
- Cũng có thể hấp thụ NH3 bằng 1 lượng dư axit sunfuric hay
clohidric chuẩn. Sau đó đem định phân phần axit sunfuric không
phản ứng với NH3 để tạo thành Amoni sunfat bằng dung dịch
NaOH chuẩn, rồi suy ra lượng H2SO4 đã tham gia phản ứng với
NH3:
2NH3 + H2SO4 -> (NH4)2SO4

H2SO4 + 2NaOH -> Na2SO4 + 2H2O

3. Số liệu thí nghiệm:

- Mẫu thí nghiệm: Dịch vô cơ hóa mẫu (Được phòng thí nghiệm
chuẩn bị sẵn).
- Thể tích dịch vô cơ hóa mẫu (Còn gọi là dịch cất đạm) lấy làm thí
nghiệm: 5 ml
- Kết quả phân tích:

Mẫu thí nghiệm Mẫu đối chứng

Lượng H2SO4 0.1N 2,4 0
tiêu tốn (ml)
4. Tính toán kết quả:

● Thiết lập công thức tính:

- Vì 1 ml H2SO4 0.1N tiêu tốn cho định phân tương ứng với 1.4 mg
Nitơ có trong mẫu cất nên ta có công thức tính số miligam Nitơ có
trong 5 ml mẫu là:

N = 1,4 x (a – b) (mg) (1)

trong đó:
N là lượng Nitơ tổng số trong 5ml mẫu thí nghiệm (ml)
a là số ml H2SO4 0.1N dùng cho mẫu thí nghiệm (ml)
b là số ml H2SO4 0.1N dùng cho mẫu đối chứng (ml)
1.4 là hệ số chuyển đổi lượng H2SO4 tiêu tốn khi định phân sang lượng
Nitơ tương ứng

- Công thức tính tổng hàm lượng Nitơ của dịch cất đạm (%):
(a−b) ×1,4
% (w /v )= ×100 % (2)
V × 1000

trong đó:
%(w/v) là hàm lượng nitơ của dịch cất đạm tính bằng %
a là số ml H2SO4 0.1N dùng cho mẫu thí nghiệm (ml)
b là số ml H2SO4 0.1N dùng cho mẫu đối chứng (ml)
1.4 là hệ số chuyển đổi lượng H2SO4 tiêu tốn khi định phân sang lượng
Nitơ tương ứng
V là lượng dung dịch vô cơ hóa đem đi cất (ml)
1
là hệ số chuyển đổi lượng Nitơ từ miligam sang gam
1000

● Tính toán:

- Từ kết quả chuẩn độ, thay số vào công thức (1) ta được:

N = 1,4 x (a – b) = 1,4 x (2,4 – 0) = 3,36(mg)

 - Áp dụng công thức (2) ta tính được hàm lượng Nitơ của dịch cất
đạm (%):

(2,4−0)×1,4
%(w/v) = ×100 %=0,067 %
5 × 1000

5. Nhận xét:

- Ngoài việc giúp xác định hàm lượng Nitơ tổng số trong mẫu thực
phẩm và hàm lượng Nitơ Protein thì phương pháp Kjeldahl còn
ggiúp xác định hàm lượng Nitơ phi protein và hàm lượng Protein
trong mẫu thực phẩm. Nếu biết lượng Nitơ Protein ta lấy nó nhân
với hệ số N tùy theo loại mẫu thực phẩm (VD: protein từ động vật
thì nhân với 6,25) sẽ được lượng Protein trong mẫu thực phẩm. Và
nếu lấy lượng Nitơ tổng số trừ đi lượng Nitơ protein ta được lượng
Nitơ phi Protein hoặc xác định hàm lượng Nitơ Protein một cách
trực tiếp bằng cách đem vô cơ hóa nước lọc sau khi kết tủa protein.
- Phương pháp Kjeldahl có một số nhược điểm. Phương pháp này
chỉ đo được lượng Nitơ trong các hợp chất hữu cơ (protein, axit
amin, axit nucleic) và NH4+ trong mẫu. Các dạng Nitơ khác, chẳng
hạn như Nitrat và Nitrit, không thể đo được thông qua phương
pháp này.