Bài 1

Xác định hàm lượng Nito tổng số bằng phương pháp Kjeldahl

Họ và tên: Đào Thu Hiền

MSSV:      20201137

Để xác định hàm lượng Nito tổng số chứa trong các loại vật chất có nguồn gốc sinh vật,
người ta thường sử dụng phương pháp Kjeldahl. Nito tổng số bao gồm các dạng Nito hữu cơ
và Nito vô cơ tồn tại trong mẫu vật nghiện cứu.

I. Nguyên tắc của phương pháp tích phân

a. Nguyên tắc

Vô cơ hóa mẫu vật cần phân tích bằng cách đốt nóng vật phẩm đó với dung dịch H2SO4 đậm
đặc. Các hợp chất hữu cơ trong mẫu bị oxi hóa, cacbon và hidro tạo thành CO2 và H2O, Nito
sau khi được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tồn tại trong
dịch vô cơ hóa mẫu (1). Sử dụng NaOH để giải phóng NH3 ra khỏi dịch vô cơ hóa mẫu, đồng
thời cất và thu nó bằng một lượng axit H3BO3 dư để chuyển về dạng NH4+ (2). Chuẩn độ
lượng NH4+ bằng dịch H2SO4 chuẩn (3).

b. Giải thích
1.  Giai đoạn vô cơ hóa

Chuyển các dạng khác nhau của N có trong mẫu vật về NH4+. Khi đốt nóng mẫu vật với H2SO4
đậm đặc ở nhiệt độ 300 – 350⁰C thì C và H hình thành CO2và H2O và N tồn tại dưới dạng
NH3. Bản chất sự tạo thành NH3 là quá trình oxi hóa – khử. NH 3 sinh ra tác dụng với H2SO4
để tạo thành (NH4)2SO4

R-CH(NH2)-COOH + H2SO4 = NH3 + CO2 + H2O + SO2

2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4

Để đẩy nhanh quá trình vô cơ hóa cần cho thêm chất xúc tác (CuSO 4, K2SO4, Se, H2O2). Hỗn
hợp CuSO4 và K2SO4 có tác dụng làm tăng nhiệt độ sôi của H 2SO4 từ đó làm tăng vận tốc của
phản ứng. H2O2 có khả năng tạo oxi phân tử thúc đẩy quá trình oxi hóa.

2.Giai đoạn cất đạm

Sử dụng kiềm mạnh NaOH để đẩy NH4+ ra khỏi dịch muối của nó giải phóng NH3. NH3  cuốn
theo hơi nước được cất và thu bằng lượng H3BO3 dư.

(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2 H2O + 2 NH3

 2NH4OH + 4 H3BO3 = (NH4)2B4O7 + 7 H2O

3.Giai đoạn định phân

Chuẩn độ lượng (NH4)2B4O7  thu được bằng dịch H2SO4 chuẩn, qua đó xác định được hàm
lượng N mẫu vật. Taxiro là chất chỉ thị được sử dụng cho phản ứng chuẩn độ này.

 (NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5 H2O = (NH4)2SO4+ 4 H3BO3 

          ( Xanh )                                                    ( Tím hồng)

Dấu hiệu kết thúc chuẩn độ: Dung dịch bắt đầu chuyển từ màu xanh sang hồng tím.

*Cũng có thể hấp thụ NH 3 bằng một lượng dư axit sunfuric hay clohydric chuẩn. Sau đó đem
định phân phần axit sunfuric dư không phản ứng với NH3 để tạo thành amon sunfat bằng
dung dịch NaOH chuẩn, rồi suy ra lượng H2SO4 đã tham gia phản ứng với NH3: 
2NH3  +  H2SO4  →  (NH4)2SO4
           H2SO4  +  2NaOH  →  Na2SO4  +  H2O

II. Cách tiến hành

Mẫu thí nghiệm: Dịch vô cơ hóa mẫu (PTN chuẩn bị sẵn)

1. Phần chuẩn bị
• Kiểm tra mức nước trong bình đun (tạo hơi nước).
• Kiểm tra các khoá của bộ cất
• Cho nước máy chạy qua sinh hàn (mở nhỏ và từ từ van nước).
• Đun sôi nước trong bình tạo hơi
• Rửa bộ cất đạm (ống sinh hàn, bình cất)

2. Cất đạm
a.Mẫu thí nghiệm
Chuẩn bị bình hấp thụ NH3:
Cho vào bình tam giác (cỡ 100ml, miệng rộng):
 20 ml H3BO3 3% (dùng ống đong)
 2-3 giọt chỉ thị Taxiro Lắp bình vào bộ cất đạm (đuôi ống sinh hàn ngập trong dung
dịch )
Cho vào bầu cất (lần lượt)
 5 ml NaOH 40% (dùng ống đong)
 2 ml H2O (để tráng phễu) (dùng micropipet);
Đóng khoá bầu cất 5 ml dịch vô cơ hoá mẫu (dùng micropipet hút dịch)
Tiến hành cất (khoảng 5-7 phút).
Sau khi thấy dung dịch trong bình hấp thụ NH3 chuyển từ màu tím hồng thành màu xanh
đợi khoảng 5 phút.
Hạ bình, dùng giấy quì tím hứng một giọt nước ngưng chảy ra từ ống sinh hàn. Thấy giấy đổi
màu, đặt bình hứng vào vị trí cũ. Khi không thấy đổi màu, lấy bình hấp thụ ra khỏi bộ cất, tia
nước cất tráng đuôi ống sinh hàn).

b.Mẫu kiểm chứng

Chuẩn bị bình hấp thụ NH3 :
Cho vào bình tam giác (cỡ 100ml):
 20 ml H3BO3 3% (dùng ống đong)
 2-3 giọt chỉ thị Taxiro Lắp bình vào bộ cất đạm (đuôi ống sinh hàn ngập trong dung
dịch)
Cho vào bầu cất:
 5 ml NaOH 40% (dùng ống đong)
 7 ml H2O (5 mL thay cho dịch vô cơ hoá);
Đóng khoá bầu cất 4 Tiến hành cất (khoảng 5-7 phút) và kiểm tra tương tự như mẫu thí
nghiệm, dùng giấy quì tím thử điểm kết thúc quá trình cất.

3. Định phân
Định phân lượng (NH4)2B4O7 tạo ra trong bình hấp thụ NH3 bằng H2SO4 0,1N.
Ghi lượng H2SO4 0,1N dùng định phân cho mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng.

Yêu cầu tính toán:

Tính tổng hàm lượng nito của dịch cất đạm (%) biết rằng 1 ml H 2SO4 0,1N tiêu tốn cho định
phân tương ứng với 1,4 mg nito có trong mẫu cất

III. Tính toán số liệu và nhận xét kết quả thí nghiệm
a. Số liệu thí nghiệm
 Loại mẫu: Dịch vô cơ hóa mẫu
 Lượng cân/Thể tích

5ml dịch vô cơ hóa mẫu, được định mức 100ml

 Thể tích dịch định mức

Thể tích H2SO4 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu thí nghiệm: 2,5 ml

Thể tích H2SO4 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu kiểm chứng: 0,1ml

b.Tính

 Thể tích H2SO4 dùng để định phân là: 2,5 – 0,1 = 2,4 (ml)
 Biết 1(ml) dung dịch H2SO4 0,1N tiêu tốn cho định phân ứng với 1,4mg N có trong
mẫu cất  thì nếu sử dụng 2,4 (ml) tiêu tốn cho định phân dung dịch H2SO4 0,1N thì lượng N
có trong mẫu là:
2,4*1,4=3,36(mg)
 Vậy trong 5ml dịch cất đạm chứa 3,36mg N thì trong 100ml dịch cất đạm chứa:
3,36*100/5= 67,2 mg= 0,0672g N
 Suy ra hàm lượng protein kết tủa là:
0,0672*6.25=0,42(g)
 Trong 5g mẫu có chứa 0,42g protein thì hàm lượng protein cần tìm là:
0,42*100/5=8,4%

Nhận xét:
 Trong quá trình cho dung dịch vô cơ hóa, dung dịch NaOH và nước vào bầu
cất có thể gây thất thoát một lượng nhỏ NH 3 do trong lúc cho nước cất vào và
đóng khóa NaOH đã tác dụng với NH 4+ trong dd vô cơ hóa làm thoát NH3 ra
ngoài. Vì vậy kết quả tính được sẽ thấp hơn so với lượng thực tế.

 Kết quả có sự sai lệch vì:

- Khi đun vô cơ hóa mẫu dung dịch sôi và bám trên thành bình vì vậy không
vô cơ hóa mẫu được hoàn toàn.
- Lượng H2SO4 đem đi hấp thụ dư không đủ lớn nên không hấp thụ triệt để
lượng NH3 bay ra.
 Các phương pháp giảm thiểu sai số:
- Khi đun lắc nhẹ để cho các vết đen trôi xuống dung dịch.
- Lắp thiết bị chắc chắn, không bị nghiêng để khí không thoát ra ngoài.
- Lượng H2SO4 đem hấp thụ phải đủ dư.

IV. Những lưu ý khi làm thí nghiệm

- Quá trình vô cơ hóa mẫu vật tiến hành trong tủ hút vì phản ứng làm thoát khí
SO2 độc. Và cần duy trì nhiệt độ trong khoảng từ 350 đến 380 độ C vì: Nếu
nhiệt độ nhỏ hơn, quá trình vô cơ hóa xảy ra không triệt để hoặc nếu nhiệt độ
lớn hơn, Nito có trong dung dịch vô cơ hóa sẽ chuyển thành dạng khí dễ bay
hơi, gây ra sai số trong kết quả. Nhiệt độ ban đầu cần tăng từ từ (<100°C) để
tránh bắn mẫu lên thành bình gây thất thoát mẫu.
- Rửa sạch bộ cất đạm, phễu bằng nước cất trước khi làm thí nghiệm để tránh lượng
đạm còn xót lại của các lần thí nghiệm trước
- Khi cho các hóa chất vào bầu cất phải mở khóa phễu trước, dung pipet đưa dung
dịch từu từ từ thành phễu nhỏ xuống, đặc biệt cẩn thận với NaOH 40%
- Chú ý không mở khóa phễu đột ngột do chênh lệch áp suất làm thất thoát đạm
- Quá trình cất đạm với mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng phải tiến hành đồng thời
- Phải đảm bảo ống sinh hàn đủ nguội để chuyển khí NH 3 từ khí ngưng tụ
thành lỏng.
 - Khi lắp bình hấp thụ vào bộ cất đạm, đuôi ống sinh hàn phải ngập trong dung dịch để
tránh khí NH3 thất thoát khoải dung dịch
- Khi cho hóa chất phải theo thứ tự: dung dịch cất đạm ➙ H2O ➙ NaOH 40% để tránh
nếu cho NaOH vào trước thì tác dụng với dung dịch cất đạm làm thất thoát khí NH3
- Cần phải xác định lượng NH3 bị lẫn này bằng mẫu kiểm chứng. Lượng NH 3
trong dung dịch vô cơ hóa bằng lượng NH3 trong mẫu thí nghiệm trừ đi lượng
NH3 trong mẫu kiểm chứng.

V. Phạm vi áp dụng của phương pháp

 Phương pháp này cho phép xác định hàm lượng N có trong hợp chất vô
cơ, hữu cơ tồn tại dưới dạng NH3/ NH4+.
 Không xác định N trong liên kết N-N, N-O,... và trong một số hợp chất dị
vòng thì chỉ xác định được một phần N trong đó.

1. Xác định nito protein, nito phi protein và hàm lượng protein trong
mẫu.

- Khi xác định nito trong thành phần của protein, người ta tách protein khỏi các
hợp chất chứa nito khác bằng phương pháp kết tủa, sau đó đem đốt kết tủa
protein thu được với axit sunfuric đậm đặc, rồi xác định nitơ protein theo
phương pháp Kjeldahl.
- Hàm lượng nito protein thường biểu thị bằng % so với chất khô của vật phẩm.
Nếu biết hàm lượng nitơ protein, nhân với hệ số 6,25 ta được hàm lượng
protein chứa trong mẫu vật nghiên cứu ( đối với sữa thì nhân hệ số 6,38 còn
đối với ngũ cốc, các loại đỗ, đậu nhân với hệ số 5,7). 
- Lấy lượng nitơ tổng số trừ đi lượng nitơ protein ta được lượng nitơ phi
protein hoặc xác định trực tiếp bằng cách vô cơ hóa nước lọc sau khi kết tủa
protein 

2. Xác định nitơ amoniac (đạm thối).

- Để giải phóng NH3 khỏi dung dịch, người ta dùng các kiềm yếu và ít tan trong
nước (MgO và CaO).
- Cất amoniac ở nhiệt độ 35-40 độ C và dưới áp suất thấp khoảng 15-20mmHg
(nếu dùng kiềm mạnh và cất ở nhiệt độ cao, thì khi đó cả NH 3 của các nhóm
amit và guanidin (của acginin) của các hợp chất hữu cơ như amin sẽ bị tách
theo)
- Sau đó thu nó bằng một lượng dư axit boric 3%.
- Định phân lượng tetraborat amon tạo thành bằng dung dịch H 2SO4.