TRƯỜNG ĐH SƯ PHẠM KỸ THUẬT TPHCM

THÍ NGHIỆM
KHOA CN HOÁ HỌC-THỰC PHẨM
HOÁ HỮU CƠ
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HOÁ HỌC

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM

BÀI 4 SẮC KÝ CỘT

Ngày thí nghiệm: ĐIỂM

Lớp: Nhóm:

Tên: MSSV:

Tên: MSSV: Chữ ký GVHD

Tên: MSSV:

A. CHUẨN BỊ BÀI THÍ NGHIỆM

(Sinh viên phải hoàn thành trước khi trước khi vào PTN làm thí
nghiệm)

1. Mục tiêu thí nghiệm

Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:

 Trình bày được nguyên tắc chung của ký sắc cột.

 Áp dụng được kĩ thuật sắc ký cột để tách và tinh chế các hợp chất
hữu cơ.

2. Tính chất vật lý và tính an toàn của các hoá chất

Tên Cấu trúc MW mp bp Tỷ trọng Tính
hợp chất (oC) (oC) an toàn

n-Hexane Dễ cháy
86,18 g/mol 68.7 - 95 0.655 g/ml Đôc hại

Acetone Dễ cháy
58,08 g/mol 56 -95 0.784 g/ml Gây kích
thích,
mẫn cảm

Ethyl 88,106 g/mol 77.1 -83,6 0.902 g/ cm3 Dễ cháy

acetate Gây khó
chịu

Methanol 32,04 g/mol 64.7 -97.6 0.7918 g/ cm3 Dễ cháy

Độc hại

Sodium 126,043 Phân 33.4 2.633 g/cm³ An toàn

sulfate g/mol hủy (khan)
1.561 g/cm³
(ngậm 7 nước)

Silica gel 60,08 g/mol 2230 1610 700 kg/m3 An toàn

3. Quy trình tiến hành thí nghiệm

a) Liệt kê các bước chính thực hiện sắc ký cột

Chuẩn bị các vật Chuẩn bị mẫu Chọn hệ dung Nhồi cột

dụng cần thiết nạp cột môi giải ly

b) tra
Kiểm Tiến trình
bằng thí và
TLC nghiệm sắc ký cột chi tiết
gộp các Nạp mẫu vào
Giải ly sắc ký cột
phân đoạn đầu cột
Giai đoạn 1: Chuẩn bị các dụng cụ cần thiết
Bước 1: Chuẩn bị peptit sạch và khô làm cột sắc ký.

Bước 2: Cho một cục bông cotton nhỏ vào cột, dùng cọng kẽm dài đưa
cục bông xuống cuối cột.

Bước 3: Dùng kẹp và giá đỡ để cố định cột thẳng đứng.

Bước 4: Chuẩn bị10 ống nghiệm có đánh số từ 1- 10 để hứng các phân

đoạn từ cột sắc ký.

*Lưu ý: Các dụng cụ thí nghiệm phải sạứ ch và khô.

Giai đoạn 2: Chuẩn bị mẫu nạp cột

Bước 1: Cân khoảng 1 g lá mồng tơ khô, dùng chày nghiền nhuyễn vào
10 ml Acetone, khuấy trộn đều. Gạn dịch chiết vào becher nhỏ. Dùng
thêm 2 ml Acetone để tráng phần bã và chày cối, rồi cho tất cả vào
becher.

Bước 2: Gạn phần dịch chiết, bỏ phần bã rắn. Làm bay hơi aceton trên
bếp cách thủy, thu được phần cặn làm mẫu.

Giai đoạn 3: Chọn hệ dung môi giải ly

Chọn hệ dung môi phù hợp là chọn hệ dung môi sao cho vết phân cực có
Rf khoảng 0,5.

Giai đoạn 4: Nhồi cột

Bước 1: Cho 2 g silica gel vào cốc nhỏ và rót hexane vào khuấy đều tạo
hỗn hợp sệt, để yên 5 phút cho silica gel tương nở trong hexane.

Bước 2: Cho hexane vào 1/2 cột. Khóa cột lại. Đặt ống nghiệm hứng
dưới cột.
Bước 3: Dùng pipet Pasteur chuyển từ từ hỗn dịch silica gel sệt vào cột,
mở khóa cho cột chảy liên tục. Dùng thêm dung môi vào cốc tráng rửa để
chuyển toàn bộ silica gel vào cột.

Bước 4: Gõ nhẹ vào thành cột để đảm bảo không có bọt khí trong cột và
để lớp silica gel được phẳng.

Bước 5: Tiếp tục thêm dung môi vào đầu cột, không để khô cột. Để cột
chảy liên tục cho ổn định trước khi nạp mẫu.

Giai đoạn 5: Nạp mẫu vào đầu cột

Bước 1: Hòa tan mẫu chiết lá mồng tơi trong 1 ml hexane. Giữ lại một
vài giọt dịch chiết lá để so sánh kết quả TLC.

Bước 2: Mở khóa cột để dung môi chảy xuống đến mức sát bề mặt lớp
silica gel.

Bước 3: Dùng pepet hút dịch chiết đưa vào đầu cột bằng cách ria tròn
đều quanh thành cột.

Bước 4: Mỗi lần chuyển từng lượng nhỏ mẫu vào đầu cột thì mở khóa để
lớp dịch chiết chảy xuống thấm vào lớp silica gel. Khóa lại ngay khi lớp
dịch vừa thấm hết.

Bước 5: Thêm dung môi để tráng rửa bình chứa mẫu nhằm đảm bảo
chuyển toàn bộ mẫu vào đầu cột. Mỗi lần dùng từng lượng nhỏ dung
môi. Thục hiện nhiều lần đến khi lớp dung môi đầu cột sạch không còn
màu xanh của mẫu. Thêm dung môi sạch đầy đầu cột và bắt đầu mở khóa
để giải ly.
Giai đoạn 6: Giải ly sắc ký cột
Bước 1: Tiến hành giải ly cột với hexane

Bước 2: Theo dõi màu sắc các dải trên cột.

Bước 3: Khi dải màu thứ nhất (màu vàng- ß-carotene) xuống đến cột
cuối cùng, thay đổi dung môi hexane-acetone.

Bước 4: Nếu dải màu thứ hai (xanh- diệp lục) chuyển chậm, sử dụng
acetone để giải ly.

Bước 5: Liên tục hứng các phân đoạn bằng ống nghiệm đến khi toàn bộ
dải màu thứ hai ra khỏi cột.

Bước 6: Xả cột bằng acetone-methanol.

Giai đoạn 7: Kiểm tra bằng TLC và gộp các phân đoạn.
Bước 1: Dùng TLC để kiểm tra quá trình tách bằng cách trích dẫn mẫu
dịch và các phân đoạn lần lượt hứng trên cùng một bảng TLC.

Bước 2: Triển khai TLC với hệ dung môi phù hợp đã chọn ở bước 2.

Bước 3: Những phân đoạn nào có kết quả TLC giống nhau thì gom lại
chung.

Bước 4: Loại bỏ dung môi các phân đoạn chứa các chất đã được tinh chế
để thu được chất tinh khiết

Bước 5: Chấm lại TLC của 3 chất trên cùng một bảng: chất mẫu trước
khi chạy và 2 chất tinh sạch.

Bước 6: Quan sát màu sắc các vết ở điều kiện thường và dưới đèn UV
254 và 365 nm.

Bước 7: Lưu kết quả.

Bước 8: Tính toán Rf các vết.

B. BÁO CÁO QUÁ TRÌNH THÍ NGHIỆM
(Sinh viên hoàn thành phần này theo từng nhóm thí nghiệm)

1. Mô tả hiện tượng xảy ra trong quá trình thí nghiệm sắc ký cột
......................................................................................................................
......................................................................................................................
......................................................................................................................

2. Mô tả hiện tượng xảy ra trong quá trình thí nghiệm sắc ký lớp
mỏng sản phẩm tách ra từ sắc ký cột
......................................................................................................................
......................................................................................................................
......................................................................................................................

2. Kết quả sắc ký cột

a) Chất màu vàng
- Thể tích (mL):
- Màu sắc:
- Rf:
b) Chất màu xanh
- Thể tích (mL):
- Màu sắc:
- Rf:
3. Kết quả sắc ký lớp mỏng trên sản phẩm thu được
Dán hình TLC của các mẫu: dịch chiết lá mồng tơi, chất màu vàng, chất
màu xanh
Hệ dung môi giải ly:

d) Nhận xét
......................................................................................................................
......................................................................................................................
......................................................................................................................
......................................................................................................................