Taïo doøng DNA

DNA cloning
Kích thöôùc boä gen cuûa moät vaøi sinh vaät
(bp)
 
Escherichia coli : 4 x 106
Saccharomyces cerevisiae : 1,4 x 107
Drosophila melanogaster : 1,6 x 108
Caenorhabditis elegans : 108
Homo sapiens : 3,5 x 109
Arabidopsis thaliana : 108
Oryza sativa 4,3 x 108
Phaseolus vulgaris : 2 x 109
Triticum vulgare 7 x 109
Tulipa gesneriana L. 3,5 x 1010
Vaán ñeà
Laøm sao bieát ñöôïc trình töï cuûa boä gen  ?
Laøm sao phaân laäp ñöôïc gen ? 

Laøm sao caét DNA boä gen moät caùch chính xaùc ?
Laøm sao coù ñöôïc moät soá löôïng lôùn (coù theå thao
taùc ñöôïc) moät gen ñaëc bieät ?

Giaûi phaùp
Taïo doøng DNA nhôø moät loaït phaùt minh kyõ
thuaät
cuûa nhöõng naêm 1970
Taïo doøng DNA =

1) Phaân laäp DNA muïc tieâu nhôø men

giôùi haïn (restriction enzymes)
2) Noái DNA vôùi moät vector

3) Ñöa vector taùi toå hôïp (recombinant)

vaøo moät teá baøo soáng (teá baøo chuû,
host cell)
4) Khuyeách ñaïi DNA (amplify) nhôø nhaân
leân teá baøo chuû
 Men giôùi haïn laø gì ?

1950 : Nhaän xeùt cuûa Luria, Bertani : Thöïc

khuaånkhoâng xaâm nhieãm ñöôïc moät soá chuûng
E.coli

1965 : Werner Arber (Nobel

1978) chöùng minh raèng DNA
cuûa thöïc khuaån bò phaân
huyû : oâng ñöa ra giaû thuyeát
laø do hoaït tính cuûa moät men
töø vi khuaån tieát ra (men ñöôïc
ñaët teân laø men giôùi haïn)
 Men giôùi haïn laø gì ?

1970 : Hamilton Smith vaø Daniel Nathans (Nobel

1978) tinh saïch töø Haemophilus influenzae moät
men endonuclease coù khaû naêng caét ADN ngoaïi
(ADN cuûa viruùt SV40) ôû nhöõng vò trí chuyeân
bieät : men giôùi haïn ñaàu tieân ñöôïc khaùm phaù

Smith H.
Nathans D.
 Ñaëc tính cuûa men giôùi haïn
   
EcoRI ….GAATTC… …G AATTC….
….CTTAAG… …CTTAA G….

EcoRV ….GATATC…. …GAT ATC….

….CTATAG…. …CTA TAG….

Phaân thuyû DNA maïch ñoâi ôû nhöõng vò trí nhaát ñònh

Nhaän bieát moät trình töï ñaëc tröng goàm vaøi nucleotide (4-10)
(trình töï giôùi haïn, restriction site) . Trình töï caøng daøi, caùc
ñoaïn DNA ñöôïc caét caøng lôùn.
Caét DNA , taïo ñoaïn coù ñaàu baèng (blunt ends) hoaëc ñaàu so
le (hay ñaàu dính) (sticky, cohesive ends)
 Vaøi thí duï men giôùi haïn

RsaI GTAC Sau3AI GATC

CATG ATAG
  

BamHI GGATCC PstI CTGCAG

CCTAGG GACGTC
 
  
HindIII AAGCTT NotI GCGGCCGC
TTCGAA CGCCGGCG

Rsa : Rhodopseudomonas sphaeroides; Sau : Streptomyces aureus; Bam : Bacillus

amyloliquefaciens; Pst : Providencia stuartii ; Hin : Haemophilus influenzae;
Not : Nocardia otitidis caviarum
 Cô sôû cuûa taïo doøng DNA :
Caét baèng men giôùi haïn vaø noái baèng ligase
 

..ATCCTAGAATTCCAAT... ..ACTGAATTCTATCCG...
..TAGGATCTTAAGGTTA... ..TGACTTAAGATAGGC...  

Caét baèng EcoRI

 
..ATCCTAG AATTCTATCCG...
..TAGGATCTTAA GATAGGC...

Noái
 
  ..ATCCTAGAATTCTATCCG...
..TAGGATCTTAAGATAGGC...
 Vi khuaån Escherichia coli

Trong moâi tröôøng thích öùng, vi khuaån E.coli

nhaân ñoâi 20 phuùt moät laàn. Sau 12h, töø 1 vi
khuaån ta seõ coù 236 vi khuaån con hoaøn toaøn
gioáng nhau (moät doøng)
 Bieán naïp Escherichia coli

Bieán naïp vi khuaån (transformation) = Chuyeån

DNA ngoaïi vaøo teá baøo E.coli

Hai phöông phaùp chính ñeå bieán naïp E.coli:

 phöông phaùp soác nhieät :
- UÛû E.coli trong CaCl2 laïnh  E.coli khaû naïp
(competent)
- Cho soác nhieät  DNA ngoaïi seõ chui qua maøng teá

baøoPhöông phaùp gaây loã baèng ñieän cao theá
(electroporation)
Daïng sieâu xoaén Daïng thaû
(supercoiled) loûng
(relaxed) Plasmid

AmpR
Ori

Daïng thaúng
(linearised)
 Trình töï giôùi haïn Plasmid ñöôïc söû duïng
laøm vector ñeå taïo doøng
AmpR
DNA caàn phaûi coù :
 Trình töï ori
Ori  Gen choïn loïc (selectable
gene)
Plasmid theá heä 1  1 hoaëc nhieàu trình töï
giôùi haïn
 Taïo doøng DNA trong plasmid
Caét plasmid vaø DNA
baèng men giôùi haïn

Noái
baèng
ligase

Bieán naïp E.coli vaø

nuoâi caáy treân ñóa
Petri

Vi khuaån Khuaån Khuaån

cheát laïc laïc
 Gen Lac Z maõ hoaù cho men -galactosidase

-galactosidase
Lactose laø moät -galactoside
gal glu Lactose glucose + galactose

-galactosidase X-gal laø moät galactoside

nhaân taïo
(5-bromo-4-indoyl-B-D-
gal X
galactopyranoside)
 LacZ Polylinker
LacZ Polylinker ñaët giöõa
gen Lac-Z
AmpR
: khoâng aûnh höôûng ñeán
hoaït tính cuûa men
Ori - galactosidase

Gen lac-Z bò giaùn ñoaïn

: proâteâin ñöôïc toång
hôïp khoâng coøn hoaït
tính - galactosidase
 Taïo doøng DNA trong plasmid
Caét plasmid vaø DNA
baèng men giôùi haïn

Noái
baèng
ligase

Bieán naïp E.coli vaø

nuoâi caáy treân moâi
tröôøng coù khaùng sinh
vaø X-gal

Vi khuaån Khuaån Khuaån

cheát laïc xanh laïc traéng
Thöïc khuaån lambda

Chu trình Chu trình

Ñaàu Ñuoâi tieàm tan tan
 Taïo doøng DNA trong thöïc khuaån 
DNA caét baèng men
giôùi haïn
DNA thöïc khuaån caét baèng MGH

Noái baèng ligase

DNA taùi toå hôïp

Ñoùng goùi in
vitro (packaging)
Thöïc khuaån
taùi toå hôïp

Nhieãm E.coli,
Traûi treân hoäp
Petri

Ñóa phaân giaûi

(lysis plaque)
 Cosmid
Trình töï cos
CCCGCCGCTGGA
GGGCGGCGACCT

polylinker
cos

Cosmid laø moät

ampR
plasmid mang trình töï
cos cuûa thöïc khuaån
ori
lambda
 Taïo doøng trong cosmid
polylinker
Cos
Caét cosmid
vôùi MGH
ampR Caét ADN vôùi MGH
ori Saøng loïc ñoaïn kích
thöôùc 35-45 kb

Noái
concatemer

Ñoùng goùi in vitro

Bieán naïp E.coli

Thöïc khuaån lambda taùi toå hôïp

Baûn ñoà vector YAC (Yeast Artificial Chromosome)

URA3 Vò trí taïo doøng

(gen choïn loïc) (EcoRI)

CEN

ARS

TRP1
(gen choïn loïc)
TEL

BamHI
BamHI
 Taïo doøng trong YAC

Caét dôû dang vôùi EcoR1

Saøng loïc ñoaïn ADN kích
Caét BamHI-EcoRI
thöôùc 100-500kb

TEL ARS URA3 EcoRI

EcoRI CEN TRP1 TEL

Noái, bieán naïp teá baøo men

Choïn loïc treân moâi tröôøng Trp-, Ura-
HAC (Human Artificial Chromosome)
 Caùc loaïi vector
Vector Kích thöôùc DNA
ñöôïc tieáp nhaän
Plasmid <10kb
Thöïc khuaån 10-25kb
Cosmid 30-50kb
BAC 75-125kb
YAC 100-1000kb

Cosmid = vector nhaân taïo, laø moät plasmid mang trình töï cos cuûa
phage lambda, cho pheùp ñoùng goùi DNA taùi toå hôïp.
BAC : bacterial artificial chromosome, nhieãm saéc theå vi khuaån nhaân
taïo
YAC : yeast artificial chromosome, nhieãm saéc theå naám men nhaân
 Toùm taét
ADN boä gen

Bieán naïp teá

baøo
Caét baèng
RE

Noái baèng ligase

vaøo vector
Nhaân teá baøo

Taùch chieát
vector
 Toùm taét
Ñaëc tính caàn phaûi coù cuûa moät vector:
 Moät vò trí ñeå gaén DNA ngoaïi = moät hoaëc nhieàu trình töï giôùi
haïn
(polylinker)
 Coù khaû naêng nhaân trong teá baøo chuû
 Moät heä thoáng cho pheùp choïn loïc teá baøo chuû taí toå hôïp
Caùc giai ñoaïn taïo doøng DNA :
 Xöû lyù vector vaø DNA muïc tieâu = caét baèng men giôùi haïn
 Noái DNA vaø vector nhôø men ligase
 Chuyeån vector taùi toå hôïp vaøo teá baøo chuû
 Phaùt hieän doøng taùi toå hôïp
 Nhaân teá baøo taùi toå hôïp ñeå khuyeách ñaïi DNA muïc tieâu
 Thö vieän DNA (DNA library)
Thö vieän cDNA Thö vieän boä gen
complementary Genomic library
DNA library

Taùch chieát RNA Taùch chieát DNA boä gen

Tinh saïch mRNA Caét DNA baèng men giôùi haïn
Phieân maõ ngöôïc cDNA Taïo doøng trong vector
Taïo doøng trong plasmid thích hôïp
Phaùt hieän doøng trong thö vieän
DNA

 : Laáy daáu caùc

doøng vôùi maøng
nylon

 : Lai maøng vôùi maãu doø

ñöôïc
ñaùnh daáu (hybridization)

 : Phaùt hieän doøng

lai