Chöông 5.

CAÙC COÂNG CUÏ:

Söû duïng hoaù sinh vaø

ñaùnh daáu phaân töû
 Giôùi thieäu

ƒ Caùc yeáu toá moâi tröôøng coù theå laøm aûnh

höôûng ñeán caùc ñaëc ñieåm veà hình thaùi
ƒ Ñaùnh daáu phaân töû taäp trung vaøo vaät
lieäu di truyeàn hoaëc caùc bieán dò ñöôïc
kieåm tra bôûi caùc gen
ƒ Ñaùnh daáu phaân töû ñöôc söû duïng cho
ƒ Ño ñeám vaøi chæ soá cuûa ña daïng di truyeàn
ƒ Baûn ñoà gen
ƒ Choïn caùc vaät lieäu di truyeàn cho caùc chöông
trình choïn gioáng
 Ñaùnh daáu phaân töû laø gì ?

ƒ Ñaùnh daáu phaân töû

ƒ Chuoãi DNA deã phaùt hieän vaø moät protein thöøa keá
coù theå giaùm saùt
ƒ Hieän töôïng ña hình trong protein
ƒ Gioáng chöùa caùc protein
ƒ Isozyme vaø allozyme
ƒ Hieän töôïng ña hình trong DNA
ƒ Nhaân
ƒ Teá baøo chaát (Chloroplast DNA vaø Mitochondrial
DNA)
 Söû duïng ñaùnh daáu phaân töû ñeå ño
ñeám bieán dò di truyeàn

ƒ Ñaùnh daáu döïa vaøo protein

ƒ Cô sôû DNA
ƒ Ñaùnh daáu döïa vaøo RFLP
ƒ PCR
ƒ RAPD
ƒ Ghi vò trí caùc chuoãi
ƒ AFLP
ƒ Caùc kyõ thuaät ñieän di
 Ñaùnh daáu döïa treân protein

ƒ Giôùi thieäu protein

ƒ Gioáng chöùa caùc protein
ƒ Isozyme vaø allozyme
Caáu truùc cô baûn cuûa protein
 Gioáng chöùa caùc protein
ƒ Taïi sao söû duïng protein chöùa trong haït
gioáng ?
ƒ Haït gioáng laø nguoàn chöùa protein phong phuù
ƒ Protein coù saún veà soá löôïng
ƒ Haït gioáng deã xaùc ñònh ñöôïc caùc giai ñoaïn phaùt trieån
ƒ Phöông phaùp
ƒ Trích protein (pH, acid)
ƒ Taùch protein rieâng leõ theo phöông phaùp ñieän di
(Polyacrynamide gel electrophoresis)
ƒ Coù theå nhìn thaáy protein treân gel baèng caùch nhuoäm
maøu (Coomassie blue, Imido black)
ƒ Phaân tích caùc kieåu daõi
 Isozyme vaø allozyme

ƒ Nhieàu hình daïng cuûa enzyme gioáng nhau

ƒ Allozyme: Moät enzyme, moät gen locus
ƒ Isozyme: Moät enzyme, nhieàu hôn moät gen
locus
ƒ Phöông phaùp
ƒ Ngaâm caùc moâ trong moâi tröôøng ñeäm laïnh
ƒ Taùch protein rieâng leõ theo pp ñieän di
ƒ Ñònh vò enzyme baèng nhuoäm moâ hoaù hoïc
ƒ Phaân tích caùc kieåu daõi
 Phaân tích caùc band

ƒ Ñoàng hôïp töû hay dò hôïp töû

ƒ Caáu truùc thöù tö cuûa enzyme
ƒ Soá löôïng gen loci
ƒ Soá nhieãm saéc theå
ƒ Phaân tích di truyeàn ñoâi khi caàn thieát
Ví duï
Ñaùnh
nh daáu treân cô sôû DNA
DNA cô baûn
Toång hôïp DNA
Toå chöùc cuûa DNA
 Ñaùnh daáu döïa vaøo RFLP
ƒ Ña hình caùc ñoaïn caét (Restriction
Fragment Length Polymorphism –
RFLP) goàm caùc böôùc:
ƒ Taùch coâ laäp DNA
ƒ Duøng caùc enzyme giôùi haïn ñeå caét thaønh caùc
ñoaïn nhoû
ƒ Taùch caùc ñoaïn caét cuûa DNA baèng gel ñieän di
ƒ Chuyeån caùc DNA caét qua boä loïc
ƒ Duøng caùc cöïc doø nhaûn phoùng xaï ñeå ñoïc DNA
ƒ Phaân tích keát quaû
Taùch caùc ñoaïn caét cuûa DNA baèng gel ñieän di
Chuyeån caùc DNA caét qua boä loïc
RFLP
Ví duï: RFLP cuûa Brassica
Phaân tích keát quaû (single-Locus probes)
Phaân tích keát quaû
(Multi-Locus probes)
 Phaûn öùng chuoãi polymera
Polymerase Chain Reaction (PCR)

ƒ Kyõ thuaät trong sinh hoïc phaân töû maø moät ñoaïn DNA nhoû coù
theå nhaân thaønh nhieàu baûn.
ƒ Polymerase Chain Reaction (PCR) söû duïng moät enzyme
ñöôïc bieát ñeán nhö laø polymerase ñeå nhanh choùng nhaân
leân töø moät ñoaïn DNA nhoû maø mang caùc ñaëc ñieåm di
truyeàn cuûa sinh vaät.
ƒ Moãi chu kyø PCR goàm coù 3 pha:
ƒ Pha 1: Laøm bieán tính cuûa DNA thoâng qua nhieät ñeå caùc sôïi taùch ra
ƒ Pha 2: Nhieät ñoä cuûa hoãn hôïp ñöôïc haï thaáp ñeå cho caùc mieáng
Primer gaén vaøo vôùi caùc DNA ñaõ taùch ra
ƒ Pha 3: Söï truøng hôïp . Nhieät ñoä noùng leân ñeå polymerase enzyme
sao cheùp nhanh DNA.
ƒ Moãi chu kyø PCR nhaân ñoâi soá löôïng DNA, khoaûng 1 tæ baûn sao cuûa
1 ñoaïn DNA coù theå taïo neân trong vaøi giôø
ƒ PCR ñöôïc duøng ñeå xaùc ñònh moät caù nhaân naøo ñoù töø moät ít
moâ hoaëc maùu, ñeå chaån ñoaùn beänh di truyeàn vaø nghieân
cöùu tieán hoaù
 PCR

94-960C

50-650C

720C

Chu kyø laäp laïi töø 25 – 50 laàn

 Taùi toå hôïp DNA
(Recombinant DNA)

ƒ Enzyme giôùi haïn (restriction enzymes) coù trong

vi khuaån coù nhieäm vuï nhö chieác keùo phaân töû ñeå
caét caùc coät Phosphat cuûa phaân töû DNA ôû caùc
chuoãi bazô cuï theå.
ƒ Chuoãi DNA bò caét vôùi caùc enzyme giôùi haïn ñeå laïi
1 ñuoâi ñöôïc goïi laø ñieåm dính taän cuøng (sticky
ends) do noù coù theå noái laïi vôùi caùc ñuoâi khaùc cuûa
caùc maûnh vôõ cuûa DNA naøo ñoù.
ƒ Caùc nhaø khoa hoïc lôïi duïng caùc enzyme giôùi haïn
vaø ñieåm dính ñöôïc taïo ra bôûi enzyme ñeå thöïc
hieän vieäc taùi toå hôïp kyõ thuaät DNA
Polymerase Chain Reaction (PCR)
VCD: DNA Structure and Replication
Ñieän di gel (Gel electrophoresis)
ƒ Kyõ thuaät PCR vaø taùi toå hôïp DNA taïo neân nhieàu ñoaõn
DNA. Ñeå nghieân cöùu caáu truùc cuûa caùc ñoaïn naøy ngöôøi
ta duøng phöông phaùp ñieän di gel
ƒ Trong ñieän di gel, caùc restriction enzymes taùch caùc
DNA nghieân cöùu thaønh nhöõng ñoaïn coù chieàu daøi khaùc
nhau. Caùc dung dòch chöùa nhöïng ñoaïn naøy ñöôïc ñaët
trong chaát gel daøy vaø cho doøng ñieän chaïy qua, moät ñaàu
laø aâm moät ñaàu laø döông. Taát caû caùc ñoaïn haïn cheá baét
ñaàu di chuyeån töø cöïc aâm sang cöïc döông. Nhöõng ñoaïn
nhoû hôn di chuyeån nhanh hôn nhöõng ñoaïn lôùn hôn.Sau
vaøi giôø ngaét doøng ñieän thì caùc ñoaïn DNA traõi suoát xuyeân
qua chaát gel, caùc ñoaïn nhoû hôn thì gaàn phía cöïc döông.
Söï phaân taùn caùc ñoaïn trình baøy 1 kieåu töông töï vôùi soïc
maõ soá. Moãi soïc trong kieåu naøy chöùa caùc ñoaïn DNA cuûa
1 kích thöôùc naøo ñoù. Ngöôøi ta xaùc ñònh caùc ñoaïn giôùi
haïn cuï theå baèng caùc vò trí cuûa noù treân gel.
ƒ Moät chuoåi DNA boå sung coù theå ñöôïc duøng thaêm doø ñeå
tìm kieám moät ñoaïn giôùi haïn trong gel maø coù chuoãi
nucleotid coù lieân quan.
ƒ Caùc nhaø khoa hoïc duøng caùc DNA thaáy ñöôïc trong maùu
ñeå so saùnh DNA trong ñieän di gel ñeå so saùnh baèng
chöùng cuûa toäi phaïm
Öùng duïng ñaùnh daáu phaân töû trong
laâm nghieäp
Ñaùnh daáu phaân töû (Molecular markers)
ƒ Ñaùnh daáu phaân töû laø caùc coâng cuï di truyeàn cho pheùp
chuùng ta nghieân cöùu söï khaùc nhau giöõa caùc caù theå ôû
nhieàu vò trí trong khoâng gian thoâng qua boä gen. Ñaùnh
daáu ñöôïc söû duïng ñeå ghi ñaïi chæ caùc gen kieåm soaùt
caùc tính traïng. Nhaän bieát vò trí cuûa caùc gen roài cho
pheùp taùch vaø moâ taû theo quy luaät töï nhieân. Caùc daáu
naøy cuõng cho caùc yù töôûng ñeå kieåm tra nghieân cöùu caùc
moái quan heä trong giöõa caùc caù theå, caùc quaàn theå vaø
phaân loaïi phaùt sinh loaøi.
ƒ Ñaùnh daáu phaân töû thöôøng söû duïng trong laâm nghieäp
laø:
ƒ Ñieän di protein (Protein electrophoresis - Isozymes)
ƒ Ña hình ñoä daøi caùc ñoaïn caét (restriction fragment length
polymorphism – RFLP)
ƒ Vi veä tinh (Simple sequence repeats - SSR or
microsatellites),
ƒ Ña hình DNA nhaân baûn ngaãu nhieân (Random amplified
polymorphic DNA - RAPD),
ƒ Ña hình chieàu daøi caùc ñoaïn DNA ñöôïc nhaân baûn
(amplified fragment length polymorphism - AFLP)
ƒ
Theo Daniel Plat, 2004
 Moâ hình tính traïng
ng di truyeàn soá löôïng
ng cuûa 1 locus

Caùc aûnh höôûng trung bình cuûa Caùc aûnh höôûng töông taùc giöõa
caùc Allen A1 vaø A2 Allen A1 vaø A2
THEÂM VAØO ÖU THEÁ
Theo Daniel Plat, 2004
 Moâ hình tính traïng
ng di truyeàn soá löôïng
ng cuûa 2 loci

Töôngtaùc
Töông taùc trong caùc loci
trong caùc loci

Theo Daniel Plat, 2004 Tính gen troäi

 Phaân tích caùc locus tính traïng
ng soá löôïng
ng
(QTL Analysis)

Trong caùc loaøi caây, caùc baûn ñoà lieân keát raát
thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå xaùc ñònh caùc vuøng
nhieãm saéc theå moät caùch cuï theå maø kieåm tra
tính traïng coù giaù trò kinh teá quan troïng nhö
tình khaùng beänh, tæ troïng goã hay sinh
tröôûng. Caùc tính traïng bieán ñoäng theo soá
löôïng trong moãi loaøi caây vaø caùc vuøng
ñöôïc xaùc ñònh ñöôïc goïi laø vò trí tính traïng soá
löôïng (QTC).
 Baûn ñoà lieân keát (Linkage Maps)
ƒ Xaây döïng baûn ñoà gen laø moät coâng cuï maïnh vaø môùi trong nghieân
cöùu di truyeàn khoâng nhöõng cho con ngöôøi nhöng cuõng cho caây
noâng nghieäp, laâm nghieäp vaø ñoäng vaät.
ƒ Baûn ñoà lieân keát gen cung caáp thoâng tin vò trí töông ñoái cuûa caùc
gen caùc tính traïng theo caùc nhieãm saéc theå cuûa moät loaøi. Bôiû vì coù
raát ít thoâng tin veà caùc gen cuï theå hay caùc tính traïng maø coù theå xaùc
ñònh tröïc tieáp töø moät caây caù theå, chuùng ta söû duïng ñaùnh daáu phaân
töû DNA nhö caùc baûng daãn ñöôøng cuøng vôùi baûn ñoà gen.
ƒ Baûn ñoà ñöôïc phaùt trieån baèng caùch xeùt nghieäm moät soá DNA
marker coù lieân quan maät thieát cuûa caùc caù theå. Moãi marker xaùc ñònh
moät vò trí treân baûn ñoà goïi laø moät locus.
ƒ Nhieàu baûn ñoà lieân keát cho moät loaøi caây kinh teá ñöôïc phaùt trieån ñeå
xaùc ñònh vò trí tính traïng soá löôïng (QLT loci) vaø ñeå cung caáp cô baûn
cho vieäc giuùp ñôû choïn löïa caùc marker.
ƒ Vieäc ñaùnh daáu tính traïng coù tính thöông maïi caàn phaûi traûi qua vaøi
naêm, choïn loïc ñaàu tieân laø duøng caùc ñaùnh daáu phaân töû ñeå cung caáp
thay theá tính traïng haáp daãn hôn cho caây lai taïo.
 Caùc gen thích hôïp (Candidate Genes)
ƒ Ngöôøi ta thöôøng bieät laäp moät soá gen maø aûnh höôûng
ñeán caùc tính traïng naøo ñoù cuûa caây nhö söï ra hoa,
phaùt trieån sôïi goã. Ngöôøi ta xaây döïng baûn ñoà caùc gen
naøy vaø xaùc ñònh caùc gen thích hôïp maø cuøng vò trí vôùi
QLT cho caùc tính traïng thöông maïi quan troïng. Leân
baûn ñoà gen thích hôïp giuùp chuùng ta hieãu vai troø cuûa
moät gen trong vieäc xaùc ñònh cuûa moät tính traïng vaø
trong caûi thieän hieäu quûa cuûa vieäc lai taïo caùc tính
traïng
ƒ Vôùi Eucalyptus globulus ngöôøi ta ñaõ xaây döïng ñöôïc
baûn ñoà cho 4 loaïi baïch ñaøn töông ñoàng cuûa gen
thöïc vaät Arabidopsis , 4 gen naøy ñoùng vai troø trong
vieäc toång hôïp vaùch teá baøo vaø 6 gen trong con ñöôøng
toång hôïp sinh cuûa monolignol.
 Candidate Genes
Locus Full name
4CL 4-Coumarate:Coenzyme A ligase
AGE1 Agamous homologue 1
AGE2 Agamous homologue 2
CCoAOMT Caffeoyl Coenzyme A O-methyltransferase
CCR Cinnamoyl Coenzyme A reductase
COMT Caffeate O-methyltransferase
EAP1 Squamosa homologue
ECA1 Cellulase homologue
ECS1 Cellulose synthase homologue
ELF1 Leafy homologue
EXS1 Xylan synthase homologue 1
EXS2 Xylan synthase homologue 2
MsaS2 S-adenosyl-homocysteine hydrolase
PAL Phenylalanine ammonia-lyase
 Primer sequences of 33 A. mangium microsatellite loci

Name Primer sequences (5' - 3') Repeat motif(s)

Dinucleotide microsatellites
CCACCCGTTACCCATTTATG
Am008 (TG)14
CCGTGATTGACTCTCAGCG
TGAGTCGATCGCTTAGCTTG
Am012 (TC)15(AC)7-(AC)10AG
TCCCGTTATTATGCCAAAGTG
GTACTAACGTTGCTATATGAGAAAGG (ATAC)3(AC)26(AT)3,(GTAT)2
Am014
CTGGTTGTTCGCTTATATGG (AT)3AC
CACGGCTGTTATTTCCTTCG
Am018 (AC)14
GGAAAGAGGTGTGACAGAGGAC
GAGGTAATATTTTGAATTCCTTGAAC
Am030 (AT)9(GT)15
GGTGTATACCTCTTTCCTGTGG
TAGGCTAATGGTCATATTCCTAG
Am041 (GT)36
AGAGATAGGGGTACACACTAAAAAAC
CCCATTGCCGTTTCTTTG
Am136 (CT)20
GCATTTCCCTTGGAACAGTC
ACCCGGACGTATAGAAATAAATACA
Am164 (TG)93
CGTGGAGGCAAGCAATATC
TTGGATGTCAAGATTTTACGG
Am173 (AC)18
CATTAGGCCACGTTTTGATAG
GGACCAAACTTATGCAACACC
Am326 (CA)20
GCATCAATGTACTAAACCATTTCC
CCATTCGAGCATCCTAAGAG
Am341 (CA)12(TA)2
CGTATGGCTGAGCTACTTAATCA
CCTCATGTCCTTGAATGTCAC
Am352 (TTC)2TA(AC)14
GACTAACCCACAAGGAAGAGTTAC
CGCAACTCCATCTGATTTACTG
Am367 (A)7G(A)6GG(A)14,(CA)14
TTATGTTGGGTTAATACGCTAACTG
CACAAGGAACTGAGCAATGG
 Microsatellites
ƒ Microsatellites, hay Simple Sequence Repeats (SSRs), goàm
nhieàu caëp laäp laïi töø 1 – 5 caëp motif
ƒ Ña hình chieàu daøi trong chuoãi thöôøng xuaát hieän thoâng qua
polymerase tröôït trong suoát quaù trình laäp laïi cuûa DNA, gia taêng
hoaëc giaûm soá löôïng laëp motif baèng moät ñôn vò toång quaùt.
ƒ Microsatellites coù chaát löôïng quan troïng maø chuùng taïo neân caùc
phaân töû ñaùnh daáu mong muoán.
ƒ Microsatellite markers thì bieán ñoäng cao hôn caùc marker khaùc.
ƒ Taát caû caùc alleles trong moät caù theå coù theå thaáy ñöôïc maø khoâng
phaûi tröôøng hôïp cho caùc marker troäi nhö trong RAPD.
ƒ Microsatellites raát linh hoaït trong öùng duïng noù coù theå söû duïng ñeå
phaùt hieän caùc khaùc bieät vaø bieán ñoåi di truyeàn trong caùc quaàn theå,
xaùc ñònh söï lai taïo giöõa caùc loaøi, kieåu thuï phaán vaø phaùt taùn haït
gioáng, cho pheùp phaân tích nguoàn goác cha vaø ñaùnh giaù lòch söû di
truyeàn vöøa qua nhö quaàn theå coå chai.
ƒ Ngöôøi ta duøng microsatellites ñaùnh daáu caùc caù theå vaø loaøi ñeå xaây
döïng baûn ñoà gen cho phaân tích QTL vaø hoã trôï ñaùnh daáu choïn loïc.
Theo Daniel Plat, 2004
Details of dinucleotide microsatellite loci characterised from
Eucalyptus nitens, E. globulus and E. sieberi
Locus Repeat motif Primers (5' - 3') Size

GAG CTG GAA ATG GAG CAG AC

En6 (GA)15 102
TCA ATT TTT GCC TCT CCC C

ATC AAA TGG CTT TAG CTT TGT G

En10 (GA)10 135
CCC AGA GAC AAA CCG CTC

GAA CGC CCA CCA CAA AAG AG

En11 (GA)19A26 78
CTG AAT TCC TCC GAG CTC C

CAG AAC CCA GCG GAG GA

En12 (GA)15 220
GGA AAC GCC AAT GTA GCT CT

GCC AAA TTG ATG GTA GGC AT

En13 (GA)17 96
CCA GCA AAT TCA AAT TCA CA

CCC AAG AAA TCA CCG AAA AC

En14 (GA)18 153
GCT GAC GGA GGA GGA GAT GT

TCC TCG TGC TCA TAC TCA AA

En15 (GA)19 96
ATG GCT GGA AGT AAC CGA GA

TTT CCT CTT CAC GCA CTC G

En16 (CAGA)3 (GA)35 140
CTC CCG GGC CCT GTA

CGA CGT CAC AGT TAT GTG GG

Eg24 (CT)10 169
CCT GAG CTT TTG AAT ACG GG

GGAAGAAATCAAACTGGACACC
Es054 (CA)13 104
TTTGCGACTACCATTTTCACC

(TC)19(AC)4 AATGCTGCTGTAGACGATGC
Es076 157
AT(AC)15 AAGACAAATCAAGCAAGTCAGC

(ACAT)8(AC)19 ACAATGAAGGATGCAAGAAGC
Es115 151
(AT)6 TATGGCTAACTTTTAGCTGGAACA

GCTCATTGTACTGCACAGAGG
Es140 (GT)20(GA)10 151
AAGGCACCAACAGTACCTGG

ACCATCACGGCTTCGGAC
Es157 (CT)16 112
GGCATTATCGACCGAGGAAC

GGGAGAGCTGATTGAGTAATTG
Es211 (GA)17 100
GCTGAGAATGGAAGCACATC

TTTGCCATAGCGAAGTGTTG
Es255 (GT)12 98
GACCACTTACCAAACTCACCG

AAATGAAGGGCCTCTTGAAAG
Es266 (CT)18 118
CGACGAGCCTACCTAATAAATTG
Isozymes
ƒ Ñieän di Isozyme laø moät kyõ thuaät trong phoøng thí nghieäm cho
vieäc ñaùnh giaù bieán ñoäng protein trong thöïc vaø ñoäng vaät
ƒ DNA khaùc nhau giöõa caùc caây caù theå, trong caùc gen maø maõ
hoaù cho enzyme proteins daãn ñeán bieán ñoåi trong moät chuoãi
amino acid vaø bieán ñoåi trong thay ñoåi nhieäm vuï cuûa phaân töû
protein
ƒ Moät ñieän tröôøng ñöôïc duøng ñeå taïo caùc protein di truù thoâng
qua moät gel vaø naïp ñieän khaùc nhau nhö laø keát quaû thay ñoåi
khaùc nhau. Vì vaäy bieán ñoåi gen ñöôïc thaáy caùc baêng nhö
“chaäm” hay “nhanh” treân gel.
ƒ Taàn soá baêng xuaát hieän ñöôïc duøùng ñeå moâ taû caây caù theå hoaëc
quaàn theå thöïc vaät vaø coù theå duøng ñeå nghieân cöùu caùc moái
quan heä trong phaân loaïi, ña daïng loaøi vaø caùc heä thoáng lai
taïo hoaëc giaùm saùt caùc chöông trình caûi thieän gioáng caây
ƒ Kyõ thuaät ñöôïc duøng nhö laø moät phöông phaùp ñôn giaûn, reõ
cho vieäc ñaùnh giaù nhanh nhöng ñang ñöôïc thay theá nhöõng
kyõ thuaät maïnh hôn ñeå ñeå ñaùnh giaù bieán ñoåi tröïc tieáp cuûa
DNA.
Theo Daniel Plat, 2004
Theo Daniel Plat, 2004
Theo Daniel Plat, 2004
Theo Daniel Plat, 2004
Theo Daniel Plat, 2004
Theo Daniel Plat, 2004
Theo Daniel Plat, 2004