Công nghệ thao tác

trên các vật liệu di

truyền: ADN, ARN,
NST,…

Gene technology
Gene manipulation
Genetic engineering

 Làm thế nào để thao tác được trên các vật liệu
di truyền (ADN, ARN, NST, phage ADN,
plasmid,…)?

 Sử dụng công cụ nào để thao tác trên các vật
liệu di truyền?

1
 2.1. Cơ sở sinh học phân tử của CN gene
2.2. Các kỹ thuật, thao tác và quy trình cơ sở
trong công nghệ gene

2.3. Công nghệ ADN tái tổ hợp – Công nghệ

nền tảng trong Công nghệ gene
 Ứng dụng của Công nghệ gene

2.1.1. Mã di truyền cơ sở của sinh vật trong

gene
2.1.2. Từ gene tới protein: sao chép, sao
mã/sao mã ngược, dịch mã
2.1.3. Bộ gene và các nhân tố ảnh hưởng tới
quá trình biểu hiện một gene

2
Insulin - hoocmone được sinh ra trong tụy động vật

 Insulin sản xuất trong Escherichia coli

3
4
 Tự sao/phiên mã
5`- TTT GTT AAT CAG -3` (replication)
ADN
3`- AAA CAA TTA GTC -5`

Phiên mã/sao mã (transcription)

mRNA 5`- UUU GUU AAU CAG -3`

Dịch mã (Translation) (rRNA, tRNA)

Protein N- Phe Val Asn Gln -C

 Điều khiển phiên mã/sao mã: gene nằm

trong ORF, Cassette, Operon

 Điều khiển dịch mã

5
2.2.1. Kỹ thuật điện di, tách chiết và làm
việc với ADN/gene
2.2.1.1. Tách chiết bộ gene của ĐV, TV, VSV
2.2.1.2. Tách chiết plasmid
2.2.1.3. Kỹ thuật điện di

6
 ADN/gene nằm ở đâu?

 Muốn tách chiết được

gene/ADN thì phải làm
gì?

 Làm thế nào để nhìn thấy

được gene/ADN?

1) Phá thành/màng tế bào

Sử dụng phương pháp vật lý, hóa học, enzyme hoặc
phối hợp nhiều phương pháp.
2) Tách chiết, dung giải, loại bỏ các thành
phần không cần thiết (protein, saccharide…)
Sử dụng dung môi hữu cơ, nhiệt và enzyme
3) Kết tủa và tinh sạch ADN
Kết tủa bằng ethanol, izo-propanol
Tinh sạch bằng 70% ethanol

7
1) Phá vỡ tế bào bằng
nhiệt và các chất tẩy
rửa ở môi trường kiềm
(pH=12)
2) Kết tủa protein và
ADN genome ở môi
trường axít (pH = 3)
3) Thu hồi ADN plasmid
trong dich nổi sau khi
li tâm. Kết tủa, tinh
sach ADN plasmid
bằng ethanol

8
 Kỹ thuật sử dụng điện trường để phân tách
ADN, ARN, Protein trên gel (Agarose,
polyacrilamide)
 Điều kiện: Các phân tử (ADN, ARN hoặc
Protein) phải cùng mang một loại điện tích 
cùng di chuyển về một cực của điện trường.
 Kết quả: phân tách dựa trên kích thước phân tử
 Mức độ phân tách dựa vào kích thước lỗ gel
 Hiển thị kết quả: sử dụng tính phát huỳnh
quang của Ethidiumbromide dưới tia UV

9
• Là polymer mạch thẳng của
các đơn phân agarobiose
• Trạng thái Sol-Gel phụ thuộc
nhiệt độ
• Kích thước lỗ phụ thuộc
nồng độ agarose

10
Là polymer của 2 đơn phân acrylamide và bis-acrylamide
Tính Sol-Gel phụ thuộc sự có mặt của chất kích hoạt
(TEMED, APS)
Kích thước lỗ phụ thuộc nồng độ
acrylamide+bisacrylamide và tỷ lệ của chúng

11
12
  2.2.2.1. Các enzyme cắt giới hạn
(restriction enzyme)
 2.2.2.2. Ghép nối ADN bằng ligases

 Loại 1: cắt phía sau  Enzyme cắt giới hạn

vùng nhận biết 1000- loại 2
5000 bps
 Loại 2: cắt tại vị trí
nhận biết (restriction
endonuclease)
 Loại 3: cắt phía trước
vùng nhận biết 20 bps
về phía trước

13
 Cách viết tên: Tên chi (1 chữ đầu), tên loài (2 chữ
tiếp theo)  viết nghiêng (= tên loài).

 Trình tự nhận biết 3-10 nucleotide, xác xuất cắt

4n (n = số nucleotide của trình tự nhận biết)

 Các kiểu cắt giới hạn: cắt

đầu bằng và cắt đầu dính
(đầu so le) với đầu 3’
hoặc 5’ nhô ra (trình tự
nhận biết đối xứng bổ
sung).
 Các đoạn ADN cùng bị
cắt bởi 1 enzyme cắt giới
hạn đầu dính, có thể tự
nối với nhau khi ủ chung
ở điều kiện thích hợp.

14
 Thường được dùng
trong CN gene do
xác xuất cắt (46 =
4096 nucleotides)
phù hợp với độ dài
của phần lớn các
gene.

 Xúc tác quá trình nối

nucleotide có đầu 5’P
với nucleotide có đầu
3’OH trên các đoạn
ADN mạch kép.

15
 Ligase mạnh thường tìm thấy ở các virus và
thực khuẩn thể.
 Loại thường được dùng trong CN gene: T4
ligase được tách chiết từ thực khuẩn thể T4.
 Phản ứng ghép nối 2 đoạn ADN đầu dính
nhanh và dễ dàng hơn 2 đoạn ADN đầu bằng.

 Ngăn ngừa hai đoạn ADN ghép nối tự nhiên

bằng cách loại bỏ gốc 5’P ở đầu phân tử ADN

16
2.2.4.1. Chuyển gene vào cơ thể/tế bào chủ để
nhân gene (vector tách dòng)

2.2.4.2. Kỹ thuật nhân gene bằng PCR – kỹ thuật

đột phá của CN gene

 Sử dụng tế bào chủ

VSV để
nhân/khuyếch đại
gene

17
B1: BIẾN TÍNH ADN B2: GẮN MỒI B3: KÉO
DÀI CHUỖI

18
CÁC THÀNH PHẦN CỦA SẢN PHẨM PHẢN
PHẢN ỨNG ỨNG
 ADN khuôn
 Mồi
 dNTPs
 Taq DNA-polymerase
 Dung dịch đệm thích
hợp

 Tại sao lại cần phải có một cặp primer trong
phản ứng PCR thông thường?

 Điều kiện cần cho một cặp primers trong

phản ứng PCR?

 Điều kiện cần đối với ADN khuôn trong

phản ứng PCR

19
 Phản ứng PCR cổ điển
 Kỹ thuật PCR ngược
 Kỹ thuật PCR lồng
 Kỹ thuật PCR đảo
 Kỹ thuật PCR phức
 Kỹ thuật PCR tại chỗ
 Kỹ thuật PCR xác định số lượng bản sao

20
 Khi nào thì ta nên dùng nhân gene trong tế
bào chủ?

 Khi nào thì ta nên dùng PCR để nhân gene?

 Ưu nhược điểm của hai phương pháp trên?

2.2.5.1. Đánh dấu phóng xạ

2.2.5.2. Đánh dấu huỳnh quang

21
 Tại sao phải đánh dấu axít nucleic?

 Ứng dụng của kỹ thuật đánh dấu axít

nucleic?

22
23
 Khi nào ta cần đánh dấu toàn bộ đoạn
ADN?
 Khi nào chỉ cần đánh dấu một phần hoặc
chỉ axít nucleic ở đầu sợi ADN?

2.1.6.1. Phương pháp Maxam-Gilbert (đọc trình tự

bằng phương pháp hóa học)

2.1.6.2. Phương pháp Sanger-Coulson (đọc trình

tự bằng phương pháp
enzyme/dideoxy)

24
TẠO CÁC ĐOẠN XẾP CHẠY ĐIỆN DI ĐỨNG
AND KHÁC NHAU 1 TRÊN GEL
NUCLEOTIDE POLYACRYLAMIDE

25
26
2.2.7.1. Chuyển và biểu hiện gene vào tế bào VSV

2.2.7.2. Chuyển và biểu hiện gene vào thực vật

2.2.7.3. Chuyển và biểu hiện gene vào động vật

 Dễ dàng biến nạp/bắn gene/tải nạp các vector

plasmid/phage vào tế bào chủ.
 Thời gian biểu hiện nhanh
 Khó khăn trong biểu hiện gene có nguồn gốc từ
sinh vật bậc cao.

27
 Bên cạnh các đặc
điểm của một vector
tách dòng, vector
biểu hiện cần phải có
vùng kiểm soát biểu
hiện gene: promoter
mạnh, vùng kiểm
soát biểu hiện, vị trí
gắn của ribosom…

 Sử dụng Ti vector của Agrobacterium

turmefaciens /vi tiêm qua ống phấn.
 Thời gian biểu hiện lâu
 Biểu hiện được các gene ở một số sinh vật bậc
cao

28
 Sử dụng virus để tải nạp ADN ngoại lai vào tế
bào chủ/bắn gene/kĩ thuật vi tiêm vào trứng.
 Thời gian biểu hiện lâu
 Có thể biểu hiện một số gene từ sinh vật bậc
cao.

29
Được sử dụng phổ biến để chuyển gene vào
tế bào động vật

30
2.3.1. Công nghệ ADN tái tổ hợp, vai trò trong
của nó trong nghiên cứu và các ứng dụng
CNSH
2.3. 2. Các công cụ của công nghệ ADN tái tổ
hợp
2.3.3. Kỹ thuật tuyển chọn dòng tái tổ hợp

Quy trình tạo ra phân tử ADN lai, trong

vectơ ADN mang gene/đoạn ADN ngoại
lai cho các mục đích nghiên cứu và ứng
dụng khác nhau.

31
Công nghệ ADN tái tổ hợp có vai trò gì trong
nghiên cứu và ứng dụng?

Tách dòng ADN cho các nghiên cứu về

(1) cấu trúc (phân tích trình tự ADN và
protein, tạo lượng lớn protein cho
nghiên cứu cấu trúc bậc 3, đột biến tìm
hiểu vai trò của các vùng/vị trí trên
protein đích, tạo thư viện gene)
(2) chức năng (hoạt động của gene, sự biểu
hiện protein)

32
(1) Tạo ĐK dễ dàng cho việc chuyển gene vào cơ
thể đích (để sản xuất protein tái tổ hợp; đưa
một tính trạng mới vào cơ thể chủ; điều hòa
một quá trình sinh lý, sinh hóa trong cơ thể
chủ)
(2) Tạo ra một lượng lớn các phân tử ADN cho
việc tạo mẫu dò (chẩn đoán bệnh, lai phân tử
xác định mối quan hệ ADN-Pr/Pr-Pr trong sản
xuất thuốc/vacxin, xác định nguồn gốc chủng
loại)

PCR Điện di trên gel Agarose Xác định đoạn ADN đích

VD1: Các bước chính trong quy trình

tạo và tách dòng ADN tái tổ hợp
Tách chiết ADN đích

Cắt giới hạn bằng RE

Lai ghép ADN với

vectơ bằngLigase

Nuôi cấy
Chuyển vào
tế bào chủ Vec tơ
tế bào chủ

33
Các vấn đề cần cân nhắc/lựa chọn trong từng
bước

34
 Các vấn đề gì cần phải cân nhắc khi tiến
hành quy trình tạo và tách dòng ADN tái
tổ hợp?

2.3.2.1. Véc tơ tách dòng gene – véc tơ biểu hiện

gene
- Véc tơ tách dòng và biểu hiện gene ở VSV
- Véc tơ tách dòng và biểu hiện gene ở TV
- Véc tơ tách dòng và biểu hiện gene ở ĐV

2.3.2.2. Sự phù hợp giữa véc tơ tách dòng, biểu

hiện gene và vật chủ mang gene ngoại lai

35
 VÉCTƠ TÁCH DÒNG
VÉCTƠ BIỂU HIỆN GENE
GENE

VÉCTƠ TÁCH DÒNG

VÉCTƠ BIỂU HIỆN GENE
GENE
 Kích thước nhỏ Ngoài các đặc điểm của
 Mang được đoạn gene véc tơ tách dòng cần có
lớn thêm các vùng điều
 Có điểm khởi đầu tái khiển biểu hiện gene:
bản (ori)  gene điều hòa

 Có gene chỉ thị (marker) (regulator)

 Các nhân tố điều khiển:
 Có vùng tập trung các
điểm cắt giới hạn operator, promotor
 Các điểm bám gắn của
ARN polymerase

36
 Vectơ tách dòng thế hệ
pBR322  Véc tơ tái tổ hợp 3 nguồn
gốc dùng cho E.coli: R1,
R6, pMB1
 Kích thước nhỏ, có nhiều
bản sao (10-15  1000 khi
có cloramphenicol.
 Các thế hệ sau (pBR327,
pBR331,…) đã loại bỏ
được tính tiếp hợp

Vectơ tách dòng – biểu hiện gene thế hệ pUC

 Kích thước nhỏ hơn, mang được các đoạn gene lớn
hơn
 Được bổ sung vùng tập trung các điểm RE
(multicloning site)

37
Vectơ tách dòng – biểu hiện gene thế hệ pUC

Vectơ tách dòng – biểu hiện gene thế hệ pUC

38
 Vectơ tách dòng – biểu hiện gene thế hệ pUC

Hệ vectơ chị em pUC8/pUC9; pUC8/M13mp8

 đọctrình tự dễ dàng

Vectơ tách dòng dựa trên cấu trúc phage M13

 Có khả năng chuyển từ vòng
kép sang vòng đơn  thuận
lợi cho đọc trình tự
 Kích thước lớn nhưng mang
được đoạn gene nhỏ khoảng
500bp.
 pEMBL8 = pUC8 + 1 300
bp của M13  có khả năng
chuyển vòng kép/đơn

39
 Vectơ tách dòng dựa trên cấu trúc phage 

 Mang được đoạn gene lớn (5 -25 Kb)

 Tuyển chọn bằng kích thước phân tử (37 - 52 Kb)
 các véc tơ xen đoạn (Vectơ gt10, Vectơ ZAPII)
và thay thế đoạn (EMBL4, GEM11 và GEM12)
 Khắc phục nhược điểm kích thước bộ gene lớn, nhiều
điểm cắt RE bằng chọn lọc tự nhiên
 Cosmid = vùng cos của phage  + pBR322  ứng
dụng trong tạo thư viện gene

 BAC dựa trên plasmid F  mang được 300 Kb

 P1 dựa trên phage P1 (mang được 110 Kb) cũng có
vùng cos như phage 
 PAC dựa trên BAC và P1 (mang được 300 Kb)

40
 Loài Độ lớn của Số lượng dòng tái tổ hợp
bộ gene (bp) cần tạo raa
Đoạn xen Đoạn xen
17 kb b 35 kbc
E. coli 4,6 x 106 820 410
Saccharomyces 1,8 x 107 3 225 1 500
cerevisiae
Drosophila 1.2 x 108 21 500 10 000
melanogaster
Lúa 5,7 x 108 100 000 49 000
Loài người 3,2 x 109 564 000 274 000
Ếch 2.3 x 1010 4 053 000 1 969 000

 Dựa trên cấu trúc của plasmid 2µm, kích thước 6 Kb,
có gene chỉ thị LEU, có khả năng liên kết với ADN
nhân
 YEp = plasmid 2µm + pBR322  vector con thoi
 YIp = pBR322 + đoạn URA 3 của plasmid 2µm
 gene biểu hiện bền vững

YAC = plasmid 2µm + pBR322 + CEN4  có khả năng

nhân lên độc lập đồng thời hoạt động như một NST

41
 Sử dụng Ti và Ri plasmid có nguồn gốc từ
Agrobacterium
 Hệ vectơ nhị phân trong đó một vec tơ có vai trò xam
nhiễm, véc tơ còn lại mang T-ADN đóng vai trò
chuyển gene
 Sử dụng chiến lược đồng liên kết: Plasmid tái tổ hợp
giữa pBR322 mang đoạn gene ngoại lai nằm giữa T-
ADN với Ti/Ri plasmid trước khi chuyển gene vao TV

 Vật chủ tách dòng, biểu hiện gene phải phù hợp với
véc tơ tách dòng/biểu hiện gene sử dụng.

 Vật chủ tách dòng gene thường được dùng nhất là
E.coli : hệ gene được hiểu biết rõ, có các véc tơ tách
dòng đa dạng cho nhiều mục đích khác nhau

 Vật chủ biểu hiện gene: phụ thuộc vào nguồn gốc gene
ngoại lai để chọn lựa vật chủ thích hợp

42
 Vật chủ biểu hiện gene: phụ thuộc vào nguồn gốc
gene ngoại lai để chọn lựa vật chủ thích hợp

(1) Các gene có nguồn gốc Prokaryote: dùng E. coli,

Bacillus
(2) Các gene có nguồn gốc Eukaryote: cân nhắc lựa
chọn Nấm men Pichia, Saccharomyces; Nấm mốc
Aspergillus; các côn trùng

43