ĐỀ CƯƠNG ÔN THI YSHPT

 Học thuyết trung tâm của SHPT, Điều hòa hoạt động gen
 Đột biến gen, đột biến NST và ứng dụng phát hiện bất thường NST trong
các bệnh lý
 Các enzyme thông dụng trong kỹ thuật SHPT;
 DNA tái tổ hợp, kỹ thuật tạo dòng và ứng dụng
 Phương pháp lai phân tử, PCR, Realtime PCR, Giải trình tự gen
 Ứng dụng SHPT trong giám định gen và pháp y; Liệu pháp gen và liệu
pháp tế bào
 Ứng dụng SHPT trong chẩn đoán bệnh di truyền và chẩn đoán trước sinh
 Ứng dụng SHPT trong chẩn đoán bệnh nhiễm trùng
 Gen sinh ung, gen ức chế khối u và ứng dụng SHPT trong chẩn đoán
bệnh ung thư
Ϩ1

1. So sánh sự khác nhau trong cấu trúc của RNA và DNA.

Enzym dùng cho quá trình nhân đôi DNA

DNA polymeraze Bổ sung nu mới có trình tự bắt cặp bổ sung với doạn
DNA mạch đơn để làm khuôn di chuyển theo chiều
3’-5’
Helicase Tháo xoắn chuỗi xoắn kép tại vị trí chạc sao chép
SSBP Liên kết và làm ổn định các mạch đơn DNA cho đến
khi các mạch này được dùng làm khuôn cho quá trình
sao chép
Topoisomerase Làm giảm áp lực xoắn căng phía trước chạc sao chép
bằng cách tách tạm thời các mạch DNA, cho quay
giảm xoắn rồi nối lại
Primase Tổng hợp đoạn mồi RNA tại đầu 5’ của mạch dẫn đầu
và tại mỗi đoạn Okazaki của mạch chậm
DNA pol III Sử dụng mạch khuôn để tổng hợp mạch bổ sung theo
chiều 5’ – 3’
DNA pol I Loại bỏ đoạn mồi RNA ở đầu 5’ và thay thế bằng các
nucleotide DNA
DNA ligase Nối đầu 3’ của đoạn DNA đã thay thế đoạn mồi với
phần còn lại của mạch dẫn đầu và nối các đoạn
Okazaki của mạch theo sau

2. Liệt kê được các loại RNA.

mRNA • Chiếm 5 – 10% tổng số RNA, có đời sống ngắn trong tế bào.
• Chuyển thông tin di truyền từ DNA sang protein.
• Codon (cụm 3 nucleotide)
tRNA • Chiếm 10 – 20% tổng số RNA tế bào.
• Vận chuyển các acid amin cần thiết đến bộ máy dịch mã để
tổng hợp protein từ mRNA tương ứng.
rRNA • Chiếm 50 – 80% tổng số RNA tế bào.
• Kết hợp với protein chuyên biệt tạo thành ribosome.

Phiên mã
• Quá trình phiên mã gồm: giai đoạn
khởi động, giai đoạn kéo dài và
giai đoạn kết thúc.
• Promoter là vùng trình tự trên
DNA, nơi enzyme RNA polymerase
gắn vào để khởi đầu phiên mã.
• RNA polymerase là enzyme tổng
hợp RNA từ mạch khuôn DNA.
• Các nhân tố phiên mã tham gia
trong quá trình tổng hợp RNA.
• Quá trình dịch mã tổng hợp protein
từ mRNA trong tế bào chất có sự
tham gia của 03 loại RNA:
mRNA được phiên mã từ mạch
khuôn (gen) chứa đựng thông tin về
số lượng, thành phần và trình tự sắp
xếp của các loại acid amin trong
chuỗi polypeptide
– mã bộ ba (codon).
tRNA vận chuyển các acid amin đã
được hoạt hóa vào ribosome để dịch
mã
(có các anti-codon tương ứng với mã
bộ ba trên mRNA).
rRNA cấu thành nên ribosome

Sinh vật nhân sơ
Nhân tố phiên mã: σ
Một loại RNA polymerase
Phiên mã cùng lúc nhiều gen
(nhóm gen cấu trúc – operon)
Ϩ2
So sánh bộ gen tế bào nhân thật và nhân sơ
ĐỘT BIẾN GEN, ĐỘT BIẾN NST
gồm một tiểu đơn vị lớn chứa phân tử
rRNA lớn và một tiểu đơn vị nhỏ
chứa một phân tử rRNA nhỏ. Sự dịch
mã trong ribosome tạo ra không gian
tiếp xúc giữa mRNA và tRNA.
Sinh vật nhân thực
Nhiều nhân tố phiên mã
(Transcription factors – TF)
Nhiều loại RNA polymerase (loại
I tổng hợp rRNA, loại II tổng hợp
mRNA, loại III tổng hợp tRNA)
Phiên mã chỉ diễn ra ở một gen.
Hình thành mRNA trưởng thành
“tel” có cấu trúc đặc biệt gồm DNA (trình tự lặp lại TTAGGG) và protein, là
tận cùng của NST. Có các chức năng:
Duy trì cấu trúc nguyên vẹn của NST (bảo vệ thông tin di truyền)
Đảm bảo việc sao mã DNA hoàn tất -> phân chia tế bào
Giúp định vị NST
Telomere ngắn lại sau mỗi chu kỳ tế bào
“cen” là vị trí gắn kết của 2 nhiễm sắc tử chị em.
Có vai trò trong quá trình phân bào: Vị trí gắn của các thoi vô sắc.
Quy định hình dạng của NST: tâm lệch, tâm cân, tâm mút
Ở người, centromere gồm hàng trăm kb các trình tự DNA lặp lại, thành phần
chính là α-satellite DNA.
Chu kỳ tế bào
Interphase: là các giai đoạn của chu kỳ tế bào gồm giai đoạn G1, giai đoạn S
và G2, lúc này NST không quan sát được.
 Metaphase: là một giai đoạn của sự phân chia tế bào (kỳ giữa), lúc này NST
đóng xoắn cực đại và dễ phân biệt nhất.
 22 cặp NST thường được chia thành 7 nhóm, ký hiệu bằng các chữ cái A, B,
C, D, E, F, G.  Mỗi nhóm các NST có kích thước gần giống nhau và dễ nhầm
lẫn với nhau khi phân loại.
Nhóm A: 3 cặp NST 1, 2, 3 – 3 cặp lớn nhất, tâm giữa
Nhóm B: 2 cặp NST 4, 5 – 2 cặp lớn, tâm lệch
Nhóm C: 7 căp NST 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 – chiều dài trung bình, tâm lệch
(NST X)
Nhóm D: 3 cặp NST 13, 14, 15 – chiều dài trung bình, tâm đầu
Nhóm E: 3 cặp NST 16, 17, 18 – chiều dài bé, tâm lệch/giữa
Nhóm F: 2 cặp NST 19, 20 – chiều dài bé, tâm lệch
Nhóm G: 2 cặp NST 21, 22 – chiều dài bé, tâm đầu (NST Y)
Các tác nhân đột biến
• Tác nhân đột biến: tác nhân gây ra đột biến (mutagen)
+Rối loạn sinh lý, sinh hóa trong tế bào cơ thể
+Các tác nhân hóa học: ethidium bromur, 5-bromouracil,...
+Các tác nhân vật lý: tia X, UV
+Các tác nhân sinh học: các yếu tố di truyền vận động (transposable
elements/gen nhảy - transposon), HPV, H.pylori,...
• Đột biến gen phụ thuộc vào:
+Loại tác nhân
+Liều lượng, cường độ của tác nhân
+Đặc điểm của cấu trúc gen
• Phát sinh đột biến: sự sinh ra các đột biến (mutagenesis)
+Đồng hoán (transition): cặp base purin-pyrimidine đổi thành cặp
purin-pyrimidine khác (VD: GC -> AT)
+Dị hoán :AT->TA
+Đột biến ngẫu nhiên/tự sinh: không có sự tham gia của tác nhân đột biến
(VD: adenine chuyển dạng -> liên kết với cytosine)
+Đột biến gây tạo: có sự tác động của tác nhân đột biến (VD: tia A, tia gamma,
UV, chất hóa học,...)
• Lỗi bắt nhầm nucleotide trong quá trình sao chép DNA
• Tác động của tác nhân đột biến vào thời điểm DNA nhân đôi
Ϩ ENZYM THÔNG DỤNG TRONG KĨ THUẬT DI TRUYỀN
- thuộc nhóm endonuclease,
cắt các liên kết
phosphodiester trong phân
tử DNA ở những vị trí nhất
định thành những đoạn
ngắn.
→hệ thống bảo vệ tế bào
prokaryote khỏi tác động
của phage(thể thực khuẩn)
- RE cắt DNA phage ở
những vị trí chuyên biệt,
tạo thành những trình tự có
RE kích thước xác định.
- Methylase gắn nhóm
methyl vào A/C ở vị trí cắt
của các RE → không nhận
biết được vị trí cắt → DNA
vi khuẩn không bị chính
RE của chúng cắt.
Đặc tính của RE
➢Cắt DNA không đặc hiệu
loài
➢Số lượng và kích thước
đoạn cắt: tùy thuộc vào số
lượng điểm giới hạn trên
phân tử DNA.
Ứng dụng
- phát triển SHPT nhân thực
- tạo dòng: tạo slg lớn bản
sao của 1 trình tự DNA xđ
-lập bản đồ cắt gh thông qua
kĩ thuật RFLP
Các nuclease • Là enzyme cắt DNA • Dựa vào bản chất
 (DNase) và RNA (RNase). của cơ chất mà
• Thường gặp: DNase, enzyme tác dụng:
Nuclease S1, Exonuclease DNase và RNase.
III, RNase A, RNase H. • Dựa theo kiểu liên
kết mà enzyme thủy
phân:
➢Nuclease “a”: thủy
phân đặc hiệu
liên kết
phosphodiester giữa
C3’ và nhóm
phosphate
➢Nuclease “b”: thủy
phân đặc hiệu liên kết
phosphodiester giữa
C5’ và nhóm
phosphate.
• Dựa vào hoạt tính
enzyme:
➢Exonuclease: cắt
các liên kết
phosphodiester từ
hai đầu của chuỗi
polynucleotide, đòi
hỏi phải có nhóm OH
(3’) hoặc OH (5’) tự
do ở 2 đầu chuỗi.
➢Endonuclease: thủy
phân liên kết
phosphodiester ở vị
trí bất kỳ bên trong
chuỗi tạo ra các
oligonucleotide.
DNA polymerase • Xúc tác sự tổng hợp DNA,
theo chiều 5’-3’.
• Cơ chất:
• Phần lớn là DNA làm
khuôn (DNA polymerase I,
T4 DNA polymerase,
Taq DNA polymerase).
• Transcriptase ngược
(Reverse Transcriptase):
khuôn là RNA để tổng hợp
 DNA.
• Terminal transferase:
không tổng hợp một đoạn
DNA mới từ khuôn
mà chỉ thêm các N vào đầu
DNA có sẵn.
- Các DNA polymerase khi
hoạt động cần có mồi
(primer).
Các Ligase • Xúc tác sự tạo liên kết
nối 2 đoạn DNA (DNA
ligase) hay RNA (RNA
ligase) với sự hiện diện của
ATP, tạo cầu nối ester giữa
5’P và 3’OH.
• Sự nối 2 đoạn DNA đầu
dính thường dễ hơn 2 đoạn
đầu bằng.
• Thường gặp các
ligase: E.coli
DNA ligase, T4 DNA
ligase, T4 RNA
ligase.
➢T4 DNA ligase
✓Nguồn gốc: từ
phage T4 xâm nhiễm
E.coli.
✓Có khả năng nối 2
trình tự DNA đầu
so le và đặc biệt là hai
trình tự đầu bằng,
được ưa chuộng nhất
trong kỹ thuật tạo
dòng (khả năng gắn
mạnh hơn E.coli
DNA ligase 10 lần).
➢T4 RNA ligase
✓Trích từ phage T4
xâm nhiễm E.coli.
✓Có khả năng nối 2
trình tự RNA bằng
các liên kết
phosphodiester.
 RI &RIII
➢Loại I: cắt 1 cách ngẫu nhiên
tại vị trí cách vị trí nhận biết
1.000 – 5.000 bp (khoảng cách
không nhất định)
➢Loại III: cắt cách 20 - 25 bp từ
vị trí nhận biết (khó đoán trước
được các điểm cắt).
Loại I→ sản phẩm không đồng
nhất, không phát hiện được bằng
điện di trên gel.
- Phức hợp enzyme cắt, các bán
đơn vị không giống nhau.
- Nhận biết trình tự cắt đặc hiệu
- Vị trí cắt cách xa vị trí nhận
biết.
- Cần Mg2+ làm cofactor và
ATP để cung cấp năng lượng
cho enzyme chuyển động dọc
phân tử DNA từ điểm nhận biết
đến điểm cắt.
RII
➢Loại II: cắt DNA ngay tại vị
trí nhận biết đặc hiệu
➢Mỗi enzyme cắt DNA tại 1
trình tự đặc trưng (restriction site)
bao gồm 4-8 cặp base, trình tự
lặp đảo
➢Các RE khác nhau có cùng
trình tự nhận biết được gọi là
isochizomers.
• Cho phép phát hiện các đoạn
DNA (sản phẩm thủy phân đặc
hiệu) bằng điện di trên gel
agarose.
• Cắt ngay vị trí nhận biết đặc
hiệu, cần Mg2+ làm cofactor,
không cần ATP
Các kiểu cắt của RE loại II
➢Cắt tạo đầu bằng: cắt 2 mạch tại
cùng 1 điểm → sau khi cắt, 2 đầu
bằng không có khả năng tự kết
hợp trở lại → dùng enzyme T4
ligase.
➢Cắt tạo đầu dính: vị trí cắt lệch
nhau trên 2 mạch → các đầu
dính bổ sung có thể bắt cặp trở
lại.
➔ Hai phân tử DNA khác nhau
được cắt bởi cùng một RE thì có
thể nối với nhau nhờ xúc tác của
DNA ligase.
DNase Nuclease S1 Exonuclease Rnase A Rnase H
III
✓Được tách ✓Được ly ✓Được tách ✓Được ly trích ✓Enzyme
chiết từ tụy bò. trích từ nấm chiết từ từ tụy bò. xúc tác
✓Xúc tác phản Aspergillus E.coli. ✓Có hoạt tính loại bỏ
ứng thủy phân oryzae, có ✓Xúc tác rất cao, hiện RNA
các liên kết nằm khả năng phản ứng diện mọi nơi và sau khi
ngay sau một phân cắt thủy phân cực kỳ bền phiên mã
base DNA mạch tuần tự các vững (không ngược để
pyrimidine trên đơn/đôi, nucleotide mất hoạt tính tiếp tục
chuỗi DNA không có khả từ đầu khi bị xử lý ở tổng hợp
mạch đơn năng phân 3’OH tự do 90oC/1h). mạch thứ
(Mn2+) hay cắt phân tử của một ✓Có khả năng hai của
mạch đôi lai DNA- DNA, theo cắt đặc hiệu cDNA
(Mg2+) RNA. chiều 3’→5’ liên kết → hình
→ tạo hỗn hợp ➔ tạo nên phosphodiester thành
oligonucleotide một vùng nằm ngay sau cDNA
có nhóm mạch đơn pyrimidine (C sợi đôi.
phosphate ở dài trên và U) của RNA.
đầu 5’. phân tử
DNA mạch
đôi.
✓Các hoạt
tính 3’
phosphatase,
RNase H.
Ứng dụng: ✓Tạo các ✓Loại bỏ RNA
✓Phân tích cấu trúc còn sót lại trong
cấu trúc của mạch đơn ở các chế phẩm
các phân tử một số vùng DNA hay
lai DNA- trên DNA protein.
RNA. dùng làm cơ ✓Loại bỏ các
✓Loại bỏ các chất cho vùng không bắt
phần mạch đoạnKlenow cặp trên RNA
đơn ở đầu so của DNA trong phân tử
le (cắt bởi polymerase lai DNA-RNA.
RE) để tạo I (để sản
đầu bằng. xuất mẫu dò
 ✓Loại bỏ các đặc trưng
cấu trúc bậc cho từng
2 (cấu trúc mạch).
kẹp tóc) trên ✓Tạo ra các
RNA trong đột biến
quá trình “mất đoạn”
chuyển mã tại những
ngược tạo vùng đặc
cDNA. biệt trên
DNA khi
phối hợp với
nuclease S1.
✓Nuclease
BAL31 có
hoạt tính
tương tự
(hoạt tính
exonuclease
5’→3’ và
3’→5’) ➔
tạo DNA
mạch đôi
đầu bằng
mà không
cần sự hiện
diện của
nuclease S1.

Transcript
ase
DNA pol I T4 DNA pol Taq DNA ngược(p. Terminal Các RNA
pol mã transfera polymerase
ngược) se

✓Hoạt tính Nguồn gốc: từ ✓Trích từ vi ✓Do các ✓Ly ‒ Xúc tác
polymeras phage T4 xâm khuẩn retrovirus trích từ sự tổng
e: tổnghợp. nhiễm E.coli Thermus sản sinh tuyến ức hợp RNA
✓Hoạt tính Hoạt tính: aquaticus, nhằm sao của bê. từ một
exonucleas ✓Hoạt tính là một chép bộ ✓Xúc mạch của
e: thủy exonucleotide enzyme chịu gen RNA tác phản phân tử
phân các 3’-5’mạnh nên nhiệt nên của chúng ứng gắn DNA mạch
liên kết được sử dụng thường được trong tế các đôi
phosphodie nhiều hơn khi sử dụng bào ký deoxynu theo chiều
ster giữa cần tổng hợp trong kỹ chủ. vào đầu 5’→ 3’
các nu từ mẫu dò có độ thuật PCR 3’OH +Ko cần
đầu phân tử phóng xạ cao. ✓PCR là tự do mồi nhưng
DNA, ✓Giống hệt phản ứng của phân khuônDNA
phóng thích như hoạt tính khuếch đại tử DNA. phải có
từng nu của đoạn một đoạn ✓Gắn mang một
theo cả Klenow. DNA đặc ngẫu promoter
chiều 5’→ hiệu nhờ nhiên đặc trưng
3’ và enzyme nên của phage.
3’→5’. DNA pol thành ‒ Dùng để
trên máy phần tạo một
luân nhiệt. Nu của lượng lớn
chuỗi RNA từ
polynu một trình tự
mới hình DNA được
thành nối ngay
hoàn sau một
toàn phụ promoter
thuộc thích hợp.
nồng độ
của 4
loại nu
có trog
phản ứg.
✓Xúc tác •Sử dụng
sự tổng hợp nhiều nhất
một mạch là SP6
đơn DNA RNA
mới. polymerase
✓Sửa chữa , T3 và T7
sai sót RNA
trong quá polymerase
trình nhân ➢SP6
đôi DNA. RNA
polymerase
: được
 tách chiết
từ phage
xâm
nhiễm
Salmonella
typhimurium
➢T3 và T7
RNA
polymerase
được tách
chiết từ
phage
xâm nhiễm
E.coli.
✓Xác định ✓Thiết ✓Thêm ✓Tổng hợp
trình tự lập ngân đuôi mẫu dò
DNA bằng hàng polynu RNA đánh
phương cDNA (tailing) dấu phóng
pháp (cDNA để tạo xạ hay hóa
dideoxynuc library). đầu so le học.
leotide. ✓Phản cho phân ✓Xác định
✓Tổng hợp ứng RT- tử DNA, trình tự của
mẫu dò có PCR. dùng một DNA
độ phóng ✓Xác trong kỹ được dòng
xạ cao. định trình thuật hóa trong
✓Thiết kế tự acid tạo dòng một vector
các vector nucleic (cloning) có mang
từ DNA bằng ✓Đánh các
mạch đơn. phương dấu đầu promoter
✓Trong pháp sử 3’OH đặc trưng
thực tế, sử dụng các của các cho phage
dụng đoạn dideoxynu DNA SP6, T3,
Klenow có cleotide. trong T7.
hoạt tính ✓Trên thị phương ✓Nghiên
polymerase trường, pháp xác cứu bản sao
và transcripta định chép RNA
exonucleas se trình tự của một
e 3’→5’, ngược có acid DNA đã
không có nguồn gốc nucleic được
hoạt tính từ AMV Maxam dòng hóa.
exonucleas và và ✓Nhờ các
e 5’→ 3’. MMLV Gilbert. RNA
polymerase
người ta có
thể tổng
hợp một
số lượng
lớn RNA từ
một DNA
được dòng
hóa, dùng
trong các
nghiên cứu
về cấu trúc,
điều hòa và
các mối
tương tác
của RNA.