Chương 3: Công nghệ DNA tái tổ hợp.

Định nghĩa:
DNA tái tổ hợp là phân tử DNA được tạo thành từ sự kết hợp giữa các
đoạn DNA có nguồn gốc khác nhau ( từ loài khác nhau)
- Công nghệ tái tổ hợp DNA là tập hợp các các kỹ thuật liên quan đến
xác định phân lập chèn gen quan tâm vào 1 vector(plasmid) để tạo thành
1 phân tử.
DNA tái tổ hợp và sản xuất một lượng lớn đoạn gen đó hoặc sản phẩm
được mã hoá bởi gen đó.
- DNA tái tổ hợp có thể kết hợp của các loài khác nhau vì chúng có cùng
cấu trúc hoá học.

Emzyme cắt giới hạn:

- Các enzyme có thể cắt các đoạn DNA có kích thước lớn thành một tập
hợp các đoạn ngắn hơn.
- Mỗi enzyme giới hạn đều có tính đặc thù cao có khả năng nhận biết và
cắt 1 trình tự DNA đặc trưng thường cứa 4-6 cặp nucleotide.(các vị trí
cắt giới hạn.
- Có thứ tự đối xứng nghĩa là trình tự các nucleotide trên 2 mạch đi đọc
theo chiều 5’ 3’ giống hệt nhau.
- Cắt các liên kết phosphodiester theo 2 cách:
+ Cắt theo 1 đường thẳng đối xứng để tạo ra dầu bằng “Blunt” ends.
+ Cắt trên những vị trí nằm đối xứng quanh 1 đường thẳng đối xứng để
tạo ra những đầu so le “sticky” or “cohesive” ends.

Vecter thể truyền:

- Vector các phân tử DNA có thể mang đoạn phân tử DNA ngoại ai vào
tế bào chủ và sao chép ở đó.
- Các loại vector khác nhau được phát triển chọn lựa vector nào tuỳ
thuộc vào phạm vi kích thước của các đoạn DNA đc tạo dòng và ứng
dụng.

Nhân dòng Gen:

- NDG là quá trình tạo ra nhiều bản sao của một gen được quan tâm
- UD sản xuất các sản phẩm protiein do gen mã hoá, tạo sinh vật chuyển
gen, sử dụng nghiên cứu.

Các kĩ thuật nhân dòng GEN.

- Tạo thư viện DNA
- Tạo thư viện cDNA
- Nhân dòng gen bằng kỹ thuật PCR

Tạo thư viện DNA:

- Tập hợp các vector chứa các đoạn DNA của gen tạo thành thư viện
DNA. Mỗi đoạn DNA chứa trong vector của thư viện được gọi là một
dòng (clone).
- DNA hệ gen của 1 một sinh vật được cắt thành các đoạn nhỏ bằng
enzyme cắt giới hạn.
- Gắn các đoạn DNA đã được cắt vào vector tạo các vector tái tổ hợp.
- Biến nạp các vector tái tổ hợp ào các tế bào vi khuẩn nhân lên với số
lượng lớn các vector tái tổ hợp.

Tạo thư viện cDNA:

- Tạo ra dựa trên khuôn mẫu phân tử mRNA được tách ra từ tế bào.
- Tổng hợp phân tử DNA bổ sung (cDNA) ( Đoạn DNA được tổng hợp
dựa trên khuôn mẫu mRNA đgl cDNA).
- Sợ đôi cDNA sau khi được tổng hợp sẽ được gắn vào các vector để xây
dựng thư viện cDNA.

Qui trình:
+ Bổ sung enzyme phiên mã ngược vào ống nghiệm chứa mARN tách từ
tế bào.
+ Enzyme phiên mã ngược TH sợi DNA thứ nhất dựa trên khuôn mẫu
của mARN
+ mRNA bị phân giải bởi 1 Ezyme khác.
+ DNA polymerase TH mạch thứ 2.
+ Thu được cDNA mạch đôi không chứa các đoạn nitron.

Nhân dòng bằng kĩ thuật PCR:

- Quy trình : xác định gen mục tiêu → khuếch đại gen mục tiêu bằng kỹ
thuật.
PCR → Gắn gen mục tiêu vào vector chuyển vào tbao chủ
- PCR là kỹ thuật khuếch đại in vitro các đoạn DNA mục tiêu. PCR cho
phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu bản sao DNA mục tiêu
trong thời gian ngắn.
- Các thành phần cần thiết : DNA chứa trình tự đích, Enzyme
polymerase chịu nhiệt, 4 loại nuleotide, mồi ( đoạn DNAdài khoảng 15-
20 nu).

Mỗi chu kì PCR gồm 3 giai đoạn:

+ Gây biến tính (90-95 độ) các liên kết Hidro mạch đôi DNA bị phá
vỡ→ phân tử DNA tách thành 2 mạch đơn.
+ Gắn mồi (55-65độ ) các đoạn mồi gắn vào gắn vào vị trí có trình tự
tương đồng DNA khuôn mãu và enzyme Taq polymerase bắt đầu sao
chép khuôn mẫu.
+ Kéo dài phân tử (70-72 độ )Khoảng nhiệt tối ưu cho enzyme Taq
polymerase tiến hành TH DNA bắt đầu từ các vị trí mòi theo chiều 5’
3’Các enzyme Taq polymerase bổ sung các dNTP từ 5’3’.

Ứng dụng
- Khuếch đại nguồn gen hiếm, gen từ các mẫu thu được hiện trường vụ
án, nghiên cứu biểu hiện gen chuẩn đoán bệnh.
- Sàng lọc các dòng gen mong muốn.
- Phát hiện gen/ trình tự DNA mong muốn bằn pp lai khuẩn lạc với mẫu
dò acid nucleic.
- Mẫu dò acid nucleic thường là các đoạn acid nuleic mạch đơn (DNA or
RNA ) có trình tự bổ sung với mạch DNA cần phát hiện.
- Quy trình:
+ Các khuẩn lạc chứa gen khác nhau được chuyên sang 1 màng nylon
đặc biệt.
+ Màng nylon được xử lý để phá vỡ các tế bào và biến tính DNA tạo
mạch đơn DNA.
+ Bổ sung dung dịch chứa mẫu dò đánh dấu phóng xạ. Mẫu dò liên kết
với mạch đơn của DNA mục tiêu theo nguyên tắc bổ sung . Màng được
rửa để loại bỏ các đoạn DNA thừa.
+ Chụp hình phóng xạ để phát hiện vị trí mà tại chỗ DNA lai với mẫu
dò.
+ So sánh hình phóng xạ với đĩa chứa khuẩn lạc ban đầu để xác định
khuẩn lạc chứa gen mong muốn.

Biểu hiện nhân dòng gen

- Các gen nhân dòng có thể được biểu hiện thành sản phẩm pro của nó
trong tế bào vi khuẩn hoặc tế bào nhân thực .Cấu tạo vector có đủ các
yếu tố phiên mã dịch mã Các vector này được gọi là vector biểu hiện.
- Các vector biểu hiện là các vector có thể mang các gen ngoại lai mong
muốn cho phép thực hiện sự phiên mã của các bản sao tạo dòng và sự
dịch mã mRNA của chúng trong tế bào chủ.
- Vector biểu hiện cần phải có đầy đủ các cấu trúc cần thiết:
+ Các trình tự ma hoá gen chỉ thị chọn lọc.
+ Một promoter kiểm soát phiên mã …. cho phép sản xuất lượng lớn
mRNA từ các gen được tạo dòng.
+ Các trình tự kiểm soát dịch mã như vùng liên kết ribosome … được bố
trí thích hợp và codon khởi đầu ATG.
+ Một polyinker … để dưa gen ngoại lai vào trong 1 hướng chính xác
với prmoter.

Một số kĩ thuật Sinh Học Phân Tử cơ bản

Điện di trên GEL
- Kĩ thuật này dùng để phân tách các đoạn DNA có kích thước khác
nhau
+ Mỗi mẫu chứa n1 hỗn hợp nhiều phân tử DNA được cho vào các
giếng riêng biệt ở 1 đầu của bản gel . Bản gel được đặt tên trên 1 giá
nhựa và ngâm vào dung dịch đệm chứa trong 1 khay có cắm các điện
cực ở 2 đầu.
+ Khi bật dòng diện các phân tử DNA tích điện âm di chuyển về phía
điện cực dương. Các phân tử DNA ngắn di chuyển nhanh hơn các phân
tử dài.
- Quy trình :
+ Chuẩn bị các đoạn cắt giới hạn.
+ Điện di các đoạn DNA trong mẫu được phân tách khỏi nhau bằng điện
di tạo nên một kiểu hình với các băng điện di đặc thù.
+ Chuyển DNA len màng nitrocellulose thẩm tách.
+ Lai với mẫu dò phóng xạ.
+ Phát hiện mẫu dò.

Giải trình tự DNA

- Dùng để xác định trình tự các nucleotide ATGC của đoạn DNA quan
tâm.
- Các pp : giải tình tự Sanger, giải trình tự thế hệ mới .
Phân tích sự biểu hiện gen:
- Pp : Norther blot ( RNA blot, lai RNA) , DNA microarray ( phép thử vi
dãy, chíp DNA)
- DNA Microarray là 1 lam kính hiển vi trên đó các bản sao DNA mạch
đơn từ các gen của 1 cơ thể sinh vật được cố định sẵn mỗi gen chiếm 1
điểm trên microarray.
- Quy trình:
+ Phân lập mRNA
+ Tạo cDNA bằng phản ứng phiên mã sử dụng các nuleotide được dánh
dấu huỳnh quang.
+Chuyển hỗn hợp cDNA lên DNA Microarray . Các cDNA sẽ lai với
các trình tự DNA trên Microarray có trình tự bổ sung tương ứng.
+ Rửa trôi các cDNA dư thừa quét bằng Microarray để thu tín hiệu
huỳnh quang.
Mỗi điểm phát huỳnh quang phản ánh gen tương ứng được biểu hiện
trong mẫu mô phân tích.
Xác định chức năng gen :
- Tạo đột biến in vitro.
- Làm bất hoạt biểu hiện của gen bằng iRNA RNA can thiệp Genomics
- Là lĩnh vực khoa học liên ngành nghiên cứu về trình tự nucleotide của
bộ gen và chức năng của chúng.

Bioinformatics Tin sinh học.

- Là lĩnh vực KH ứng dụng KH máy tính và CNTT để giải quyết các vấn
đề sinh học.

Dự án hệ gen người
- 1990- 2003
- Mục tiêu:
+ Xác định tất cả các gen của hệ gen người.
+ Giải trình tự hệ gen.
+ Cải tiến các công cụ cho phân tích dữ liệu.
+ Phổ biến thông tin bộ gen đến các nhà KH và công chúng.
+ Vạch ra các vấn đề đạo đức pháp lý XH có thể xảy ra.
Các thông tin liên quan đến hệ gen người
- Gần 50% gen chưa có chức năng
- Bộ gen người bao gồm khoảng 3,1 tỷ cặp bazơ
- Bộ gen giống nhau khoảng 99,9% giữa các cá nhân thuộc mọi quốc
tịch
- Các đa hình đơn nucleotide (SNP) và các biến thể số lượng bản sao
(CNV) chẳng hạn như các lần xóa, chèn và sao chép dài trong bộ gen
chiếm phần lớn sự đa dạng của bộ gen được xác định giữa con người
- Dưới 2% số gen mã hóa gen.
- Phần lớn DNA của chúng ta là mã hóa không phải protein và các trình
tự DNA lặp lại chiếm ít nhất 50% DNA không mã hóa.
- Bộ gen chứa khoảng 20.000 gen mã hóa protein
- Nhiều gen của con người có khả năng tạo ra nhiều hơn một loại
protein, cho phép các tế bào của con người tạo ra ít nhất 100.000 protein
chỉ từ khoảng 20.000 gen.
- Nhiễm sắc thể 1 chứa số lượng gen nhiều nhất. Nhiễm sắc thể Y chứa
ít gen nhất.
- Nhiều gen trong bộ gen người có mức độ trình tự cao.
- Giống với gen ở các sinh vật khác.
- Hàng nghìn gen bệnh của con người đã được xác định và lập bản đồ
đến các vị trí nhiễm sắc thể của chúng.