Chương 7 SỰ TẠO DÒNG GENE

I. Các vector
1. Khái niệm
Phân tử DNA có kích thước nhỏ, thường có dạng vòng, dùng để mang
gene.
2. Đặc điểm:
- Có khả năng sao chép độc lập.
- Có thể thu nhận lượng lớn từ tế bào.
- Mang gene chỉ thị cho quá trình sàng lọc (gene kháng kháng sinh, gene
mã hóa cho enzyme chuyển hóa cơ chất).
- Có kích thước càng nhỏ càng tốt, dễ xâm nhập, sao chép nhanh, hiệu quả.
- Có số lượng bản sao trong tế bào lớn.
- Có những vị trí duy nhất của enzyme giới hạn.
I. Các vector (tt)
3. Vector tạo dòng và vector biểu hiện
- Vector tạo dòng: chuyển và lưu trữ gene tái tổ hợp trong tế bào
chủ.
- Vector biểu hiện: tạo ra sản phẩm của gene tái tổ hợp ở mức phiên
mã, dịch mã, phân tích trình tự điều hòa sự biểu hiện của gene.
Sự khác nhau của các vector tạo dòng
• Loại tế bào mà chúng có thể vào
• Cách thức mà chúng xâm nhập (bằng biến nạp hay bằng
cách xâm nhiểm của virus/phage)
• Độ lớn của đoạn DNA ngoại lai mà chúng có thể mang
• Vị trí cắt giới hạn chính xác của enzyme cắt giới hạn
• Sự ổn định của DNA khi được chèn vào
• Những khía cạnh quan tâm
– Hiệu quả tạo dòng
– Số lượng bản sao (trên một tế bào chủ)
– Khả năng tầm soát (ví dụ hệ thống Lac Z)
 4. Phân loại:
- Có nhiều loại vector: plasmid, cosmid, phage…
- Dựa vào kích thước DNA mục tiêu và mục đích tạo dòng → chọn
loại vector phù hợp.
Plasmid: DNA ngắn, dạng vòng, nằm ngoài nhiễm sắc thể, được tìm thấy
đầu tiên ở vi khuẩn.
Plasmid thế hệ thứ I: plasmid tìm thấy trong tự nhiên.
Plasmid thế hệ thứ II: plasmid nhân tạo, điển hình là pBR322.
Plasmid thế hệ thứ III: plasmid mạnh nhất, có 2 đặc tính cơ bản:
- Kích thước nhỏ → sao chép nhanh chóng.
- Có mang polylinker (vị trí chứa các trình tự nhận biết duy nhất
của enzyme cắt giới)
Phage: virus xâm nhiễm và làm tan vi khuẩn. Hiệu quả xâm nhiễm
cao hơn chuyển plasmid vào vi khuẩn, nhưng thao tác phức tạp.

Cosmid: vector nhân tạo, có thêm trình tự cos của phage λ.

Các vector là virus của Eukaryote như: retrovirus, SV 40, vaccinia,

adenovirus…

Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men (YAC): vector tạo dòng những
đoạn DNA có kích thước lớn.
Vector tạo dòng là phage
 Eukaryotic vector
– Ti plasmid của Agrobacterium tumefaciens dùng
để tạo dòng ở thực vật. Kích thước từ 180 – 205 kb, có
thể mang đoạn DNA kích thước khá lớn, lên đến khoảng
từ 30 - 150 kb.
– YAC (Yeast artificial chromosome – NST nhân
tạo nấm men) Kích thước 10kb mang được DNA 100 –
1000kb. Sao chép như một nhiễm sắc thể bình thường
của nấm men. Dùng để tạo bản đồ vật lý bộ gen ví dụ bộ
gen người (nhưng không bền như BAC).
– MAC (mammalian artificial chromosome – NST
nhân tạo động vật hữu nhũ): gồm có tâm động, telomere
và ORI của động vật hữu nhũ, mang được đoạn gene từ
10 kb đến nhỏ hơn 1000kb.
II. Các tế bào chủ

- Tế bào tiếp nhận vector:

+ Duy trì vector bền vũng trong tế bào
+ Cho phép sao mã (nhân bản sao) vector bên trong tế bào
+ Cho phép biểu hiện gen được mang bởi vector
- Tế bào chủ và vector phải tương thích với nhau về quá trình sao
mã, phiên mã và dịch mã
- Tế bào chủ thường không ở dạng tự nhiên mà là dạng đột biến
chứa kiểu gen đáp ứng với vector và mục đích tạo dòng hoặc biểu
hiện gen.
- Tế bào chủ: tế bào vi khuẩn hoặc tế bào Eukaryote (tế bào động
vật, thực vật, nấm men).
 Cải tiến tế bào chủ E. coli
• Thông thường E. coli dùng để tạo dòng thường
được cải tiến:
– Loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế bằng cách
gây đột biến trong hệ thống sửa đổi hạn chế nội sinh
– Hệ thống tái tổ hợp DNA được sửa đổi để ngăn
chặn sự tái tổ hợp
– Thay đổi hoạt tính endonuclease nhằm làm tăng
lượng plasmid tích lũy trong tế bào
III. Sự tạo dòng
Mục đích: thu được lượng lớn bản sao một trình tự DNA xác định.
Các bước cơ bản:

1. Chọn và xử lí vector:
2. Xử lí DNA cần tạo dòng.
3. Tạo vector tái tổ hợp.
4. Chuyển vector tái tổ hợp vào
tế bào chủ
5. Phát hiện dòng cần tìm
1. Chọn và xử lí vector:

Chọn vector phụ thuộc vào: kích thước DNA tạo dòng và mục đích

Sử dụng enzyme cắt hạn chế thích hợp để cắt mở vòng.

So sánh vector theo kích thước DNA mục tiêu

- Plasmid: nhỏ hơn 8kb (trừ plasmid từ F – BAC)

- Phage : đến 20kb
- Phage P1: đến 100kb
- Plasmid từ F (BAC): đến 300kb

Vector mang được đoạn gen lớn cần cho việc thiết lập các
ngân hàng gen
2. Xử lí DNA cần tạo dòng:
Cần xác định nguồn thu nhận DNA.
Sử dụng phương pháp đặc hiệu thu nhận DNA mục tiêu: tách
chiết DNA bộ gene; tổng hợp hóa học…
Xử lí DNA mục tiêu với enzyme cắt hạn chế thích hợp: sử dụng
enzyme cắt tạo đầu so le hoặc enzyme tạo đầu bằng để tạo đầu tương
thích với 2 đầu của vector đã xử lí.
3. Tạo vector tái tổ hợp

Thực hiện phản ứng nối giữa DNA mục tiêu và vector (theo tỉ lệ
3:1 hoặc 2:1).
4. Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ:
Sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp.
Phương pháp chuyển gene vào tế bào:

❖ Biến nạp (transformation):

- Biến nạp: sự tiếp nhận DNA trần bởi tế bào
- Các kĩ thuật sử dụng:
+ Sử dụng Calcium phosphate (hoặc Calcium clorua): hình thành
phức hợp DNA-calcium, chuyển vào tế bào qua cơ chế thực bào.
+ Điện biến nạp (electroporation): sử dụng dòng điện có điện áp
cao, tạo lỗ thủng trên màng tế bào, DNA dễ xâm nhập vào bên trong
tế bào.
+ Kĩ thuật tiêm (injection): DNA được bắn vào tế bào dưới dạng
bọc quanh những viên đạn cực nhỏ, hoặc được tiêm thẳng vào tế
bào.
 Tạo tế bào E. coli khả nạp (competent cell) và biến nạp DNA

- Đa số tế bào không có khả năng

biến nạp
- Tế bào có thể được xử lý để trở
nên có khả năng tiếp nhận DNA
trần: sự tạo tế bào khả nạp
(competent cell).
 Chuyển gen vào tế bào khác vi khuẩn
- Nấm men: tạo competent cell bằng xử lý với lithium chloride hoặc
lithium acetate; sử dụng xung điện (electroporation);
- Nấm mốc: electroporation, protoplast
- Tế bào thực vật: biến nạp bằng Agrobacterium tumefaciens
electroporation, súng bắn gene
- Tế bào động vật: biến nạp, vi tiêm...

a) Electroporation
Phương pháp chuyển gene vào tế bào (tt)

❖ Tải nạp (transduction):

Quá trình chuyển gene vào tế bào

nhờ vector là virus.

Ưu điểm: hiệu quả chuyển gene

cao.

Virus sử dụng trong quá trình tải

nạp được loại bỏ một phần bộ
gene, gắn thay vào đó đoạn DNA
cần nghiên cứu.
5. Phát hiện dòng cần tìm
Tách chiết thu nhận vector tái tổ hợp và kiểm tra bằng enzyme
cắt.
Vector tái tổ hợp sẽ có kích thước lớn hơn vector ban đầu.

Sử dụng mẫu dò:

- Kháng thể đặc trưng cho protein mã hóa bởi gene cần tìm.
- Trình tự DNA bổ sung cho gene cần tìm.
Phương pháp sử dụng kháng thể:
+ Có 1 kháng thể đặc trưng cho
protein mã hóa.

+ Vector sử dụng là vector cho

phép dịch mã DNA thành
protein.
Phương pháp sử dụng trình tự DNA bổ sung cho gene cần tìm.

• Tổng hợp các trình tự DNA ngắn và đánh dấu ở đầu 5’ bằng
đồng vị phóng xạ hoặc bằng hóa chất nhờ enzyme
polynucleotide kinase.

• Tiến hành lai các trình tự DNA ngắn trên với các dòng trong thư
viện gene. Dòng tái tổ hợp được phát hiện bằng kĩ thuật phóng
xạ hoặc tín hiệu màu.
IV. Thư viện gene
Dựa vào bản chất của DNA cần tạo dòng, có 2 loại thư viện gene
- Thư viện bộ gene (genomic library): tập hợp tất cả các trình tự
DNA cấu thành bộ gene đã được gắn vào vector.

Cách tiến hành:

Tách chiết DNA bộ gene → cắt bộ gene thành những đoạn có kích
thước xác định → dòng hóa vào vector → chuyển gene vào tế bào chủ
→ nuôi cấy trên môi trường và tạo thành các dòng (clone).

Ứng dụng:

- Giải mã bộ gene.

- Tạo dòng các trình tự DNA không mã hóa

-Thư viện cDNA (cDNA library): tập hợp các bản sao của cDNA từ tất
cả các mRNA của tế bào.
- Thư viện cDNA mang tính đặc trưng của tế bào rất cao vì chỉ có 1 số
gene được phiên mã thành mRNA
-Kích thước của cDNA không lớn → chọn vector dòng hóa dễ dàng.

Cách tiến hành: tách chiết, thu nhận mRNA → cDNA → dòng hóa
vào vector → chuyển gene vào tế bào chủ → nuôi cấy trên môi
trường và tạo thành các dòng (clone).
• Bài tập:
Cho gene A (kích thước 300 bp) có trình tự như sau:
Trình bày cách thu nhận và dòng hóa gene vào vector pEGFP-N1?

SalI EcoRI SalI

Xho
I
Gene A

HindIII BamHI