KỸ THUẬT THAO TÁC TRÊN GEN

GVHD: TS. Đặng Thị Phương Thảo

1. Mở đầu: Ý nghĩa của thao tác trên gen
2. Thể mang gen (vector) và tế bào chủ
3. Thu nhận và tinh chế DNA từ tế bào
4. Enzyme dùng trong thao tác DNA
5. Thao tác trên DNA tinh chế
6. Chuyển gen vào trong tế bào
7. Kỹ thuật PCR
8. Tạo dòng gen của prokaryote và eukaryote
9. Tuyển chọn dòng mang gen mục tiêu
10. Sản xuất protein tái tổ hợp
11. Nghiên cứu sự hiện diện và cấu trúc của gen
12. Nghiên cứu sự biểu hiện và chức năng của gen
13. Nghiên cứu bộ gen
14. Các ứng dụng khác của kỹ thuật thao tác trên gen

2
THỂ MANG GEN (VECTOR) VÀ TẾ BÀO CHỦ

3
 NỘI DUNG
-Plasmid vectors
-Phage vectors
-Cosmids
-Phagemids
-Vectors sử dụng trong nấm men
-Vectors sử dụng trong tế bào động vật hữu nhũ
-Vectors sử dụng trong tế bào động vật không xương
sống
-Vectors sử dụng trong tế bào thực vật
-Chủng chủ E. coli

4
 Theå mang gen: vector
- Vector: phaân töû DNA kích thöôùc nhoû duøng ñeå mang
gen, sao cheùp, thao taùc treân gen
- Ñaëc ñieåm:
+ Coù trình töï ñieàu khieån sao maõ ñoäc laäp
+ Mang gen chæ thò cho quaù trình saøng loïc hoaëc tuyeån
choïn
+ Coù theå ñöôïc thu nhaän vôùi soá löôïng lôùn töø teá
baøo

5
Theå mang gen: vector

Vector taïo doøng vaø vector bieåu hieän

+ Vector taïo doøng: chuyeån vaø löu tröõ gen taùi toå hôïp trong
teá baøo chuû, nhaân baûn, thao taùc, phaân tích sau ñoù treân
DNA taùi toå hôïp seõ deã daøng hôn

+ Vector bieåu hieän: taïo saûn phaåm cuûa gen taùi toå hôïp ôû
möùc phieân maõ, dòch maõ, phaân tích trình töï ñieàu hoøa söï
bieåu hieän cuûa gen
1. Vector dùng cho Escherichia coli

Plasmid vectors

Phage vectors

Cosmids

Phagemids

7
Plasmid

- Yếu tố di truyền DNA độc lập hiện diện trong tế bào chủ
- Chứa một vài gen cần cho tế bào chủ

8
 Plasmid mang gen
kháng kháng sinh

- Plasmid mang gen kháng kháng

sinh giúp tế bào có thể tăng
trưởng được trong môi trường
chứa kháng sinh tương ứng

9
 Phân loại plasmid tự nhiên
- Plasmid F (fertility): chứa gen tra tạo pilus cần cho quá trình tiếp hợp
(plasmid F ở E. coli)

- Plasmid R (resistance): chứa các gen kháng kháng sinh, có vai trò
quan trọng trong lan truyền tính kháng thuốc ở vi khuẩn gây bệnh
(plasmid RP4 ở Pseudomonas)

- Plasmid Col: chứa gen mã hóa protein colicin tiêu diệt các vi khuẩn
khác (ColE1 ở E. coli)

- Plasmid phân hủy (degradative plasmid): mang gen giúp thủy phân
các hợp chất dị sinh (TOL ở Pseudomonas putida)

- Plasmid ác tính (virulence plasmid): gây bệnh (Ti plasmid ở

Agrobacterium tumefaciens)
10
 Các đặc tính của plasmid

- Tiếp hợp (conjugative) – được vận chuyển (mobilizable)

- Nhóm không tương thích (incompatibility group)

- Sát nhập (intergrative) và không sát nhập

- Kích thước và số lượng bản sao/tế bào

- Dải tế bào chủ

11
 Plasmid tiếp hợp và plasmid được vận chuyển
- Plasmid tiếp hợp: plasmid có
thể chuyển từ tế bào (donor)
cho qua tế bào nhận
(recipient) trong quá trình tiếp
hợp: chứa oriT, tra (tạo pilus),
mob (tạo protein chuyển)
- Plasmid được vận chuyển:
chứa oriT, mob, thiếu gen tra;
chỉ chuyển từ tế bào cho sang
tế bào nhận nhờ một plasmid
tiếp hợp
- Đa số plasmid tự nhiên thuộc
nhóm được vận chuyển
12
Tính không tương thích, nhóm không tương thích
- Tính không tương thích: hai plasmid khác nhau là không tương
thích nhau khi không thể cùng tồn tại bền vững trong cùng một tế
bào khi không có áp lực chọn lọc
- Hai plasmid khác nhau có thể cùng tồn tại trong cùng một tế bào
được gọi là tương thích với nhau
- Các plasmid không tương thích nhau được xếp chung vào một
nhóm không tương thích:
+ hai plasmid khác nhau trong cùng nhóm không tương thích thì
không có thể cùng tồn tại chung trong tế bào
+ hai plasmid khác nhau có thể cùng tồn tại trong cùng một tế bào
khi thuộc hai nhóm không tương thích khác nhau
+ các plasmid thuộc các nhóm không tương thích khác nhau:
ColE1, p15A, pSC101, F, R6K, RP4
13
 Plasmid sát nhập và không sát nhập

- Sát nhập
(intergrative plasmid,
episome): có khả năng
sát nhập, gắn vào bộ
gen của tế bào chủ

- Plasmid không sát

nhập (non-
intergrative plasmid):
hiện diện ở dạng phân
tử vòng trong tế bào,
độc lập với bộ gen tế
bào chủ

14
Kích thước các loại plasmid

15
Số lượng bảo sao plasmid trong một tế bào
- Số bản sao thấp: 1-2/tế bào (mini-F, pSC101)
- Số bản sao trung bình: 2-10/tế bào (pACYC177, 184)
- Số bản sao cao: 20-50/tế bào (pBR322)
- Số bản sao rất cao: ~100/tế bào (pUC plasmids)

16
 Dải (biên độ) tế bào chủ
- Hầu hết plasmid có dải tế bào chủ rất hẹp: chỉ nhân
bản được trong chỉ vài loài tế bào chủ gần nhau

- Một số plasmid có dải tế bào chủ trung bình: có thể

nhân bản trong một số loài tế bào chủ khác nhau

- Dải tế bào chủ rộng: nhân bản được trong nhiều

loài tế bào chủ, có trường hợp trong tất cả tế bào

17
 Vector tạo dòng là plasmid
- Tất cả plasmid vector đều là dạng biến đổi của plasmid tự nhiên
- Được chuyển vào tế bào bằng sự biến nạp
- Tự sao chép độc lập với bộ gene tế bào chủ
- Một số ở trạng thái đa bản sao làm tăng số lượng DNA tái tổ hợp trong
tế bào
- Mang các dấu hiệu
di truyền chọn lọc
- Có multiple cloning site
- Cấu trúc cho phép tạo
đột biến, bất họat chèn
dành cho mục đích
chọn lọc

18
19
20
21
22
Plasmid vector
có nguồn gốc từ
ColE1
- pBR322
- pUC
- pGEM3Z

23
 Plasmid pBR322
- Vector đầu
tiên từ ColE1

- Do Bolivar
và Rodinguez
thiết lập

- Đa bản sao

24
 Plasmid pUC18/19
- Rất nhiều bản sao (500-700)
- Chứa PCS tương tự như M13 giúp dễ giải trình tự và tạo đột biến
- Sàng lọc bằng bất hoạt chèn

25
Polycloning site của pUC

26
 pGEM3Z
- Dẫn xuất của pUC
- Chứa hai promoter giúp
cho sự biểu hiện của gen
- Khi bổ sung RNA
polymerase, plasmid này
có thể tạo ra mRNA

27
Bacteriophage (Phage) và Phage vectors

- Phage 
- Phage P1
- Phage M13

28
So sánh vector theo kích thước DNA mục tiêu
- M13: nhỏ hơn 3kb
- Plasmid: nhỏ hơn 8kb (trừ plasmid từ F – BAC)
- Phage : đến 20kb
- Phage P1: đến 100kb
- Plasmid từ F (BAC): đến 300kb

- Vector mang được đoạn gen lớn cần cho việc thiết lập các
ngân hàng gen

29
Hai dạng cấu trúc phổ biến của Phage

30
 Phage 
- ds DNA thẳng, 49kb, hai đầu
dính: cos site
- Trong tế bào DNA đóng vòng
nhờ cos site
- Phage ôn hòa: prophage gắn vào
DNA bộ gen tế bào chủ

31
Sự đóng vòng DNA của  sau khi vào tế bào chủ

32
Phage  và sự gắn vào bộ gen của vi khuẩn

33
Đặc điểm sao mã và đóng gói tạo các  mới

34
Nhược điểm
của  trong
tạo dòng
- Kích thước bộ
gen tái tổ hợp
không được quá
5% so với bộ
gen tự nhiên
- Chứa nhiều
trình tự nhận
diện của RE

35
 Đột biến ở 
- Loại bỏ vùng gen không cần cho chu trình tan của phage 
- Chọn lọc dạng đột biến tự nhiên không chứa trình tự nhận diện của
RE

36
Chọn lọc  đột
biến không chứa
trình tự nhận
diện của EcoRI

37
38
 Vector  chèn ( Insertion vector)
- Vector  (35 – 40kb) mất vùng gen không cần cho chu trình tan
- Chứa ít nhất một trình tự nhận diện của RE để cắt và chèn gen
mục tiêu vào vector tạo vector tái tổ hợp
- Có thể mang đoạn gen mục tiêu 8 - 10kb

39
 Vector  chèn: gt10, ZAPII
- gt10: 8kb gen mục tiêu, chèn vào EcoRI ở gen cI, chọn lọc dòng
tái tổ hợp dựa trên kiểu hình vệt tan trong

- ZAPII: 10kb gen mục tiêu, được chèn vào vùng MCS của lacZ‘,
chọn lọc dòng tái tổ hợp dựa trên vệt tan xanh-trắng

40
41
42
 Vector  thay thế ( Replacement vector)
- Chứa hai trình tự nhận diện của 2 RE khác nhau nằm hai bên vùng
gen không cần thiết của 
- Có thể mang đoạn gen mục tiêu 20kb, được thay vào vùng gen bị
cắt

43
 Vector  thay thế: EMBL4, GEM11
- EBBL4: 20kb gen mục tiêu, thay thế vào đoạn giữa các vị trí R,
B, S, chọn lọc dòng tái tổ hợp dựa trên kích thước bộ gen
- GEM11, 12: 23kb gen mục tiêu, chứa vùng PCS, chọn lọc
dòng tái tổ
hợp dựa
trên kích
thước bộ
gen

44
45
 Tạo dòng bằng vector  dạng vòng
- Vector  ở dạng vòng được dùng để tạo dòng với qui trình tương tự
như vector plasmid

46
 Tạo dòng bằng vector  dạng thẳng
- Cắt vector  dạng thẳng để tạo thành vai trái và vai phải
- Trộn với gen mục tiêu đã được xử lý bằng RE tương ứng và thực hiện phản
ứng nối
- Bổ sung các protein cần cho sự nạp gen in vitro (in vitro packaging)
- Chọn lọc
dòng có
sự tái tổ
hợp đúng
thông qua
nhiễm nạp
vào tế bào
chủ

47
 Phage ôn hòa P1
- ds DNA thẳng, 110kb, hai đầu có vùng
trùng lắp (redundant)
- Trong tế bào DNA đóng vòng nhờ các
đầu trùng lắp
- Sao chép theo cơ chế cuộn vòng
- Phage ôn hòa: prophage ở dạng vòng
không gắn vào DNA bộ gen tế bào chủ
- Bộ gen được nạp theo cơ chế „nạp đầy“
(headful packaging):
+ Pacase của P1 cắt concatemer
+ Protein vỏ (đầu) nhận diện và gắn vào trình tự pac, bắt đầu nạp
bộ gen từ đầu gần pac cho đến khi đầy vỏ (110kb)
+ Concatemer bị cắt và bắt đầu một quá trình nạp (packaging mới)

48
 P1 vector: pAd10
- P1 vector: plasmid pAd10, chứa hai trình tự loxP cùng chiều, pac,
plasmid ori, phage ori, KanR, đoạn đệm (stuffer)
- Dùng với E. coli chứa Cre
- Cho phép mang đoạn gen mục tiêu 75 - 100kb
loxP

Stuffer KanR

Sac
pac Bam

loxP

KanR

pac loxP loxP

49
Các vector tái tổ hợp theo cơ chế nạp đầy

50
Qui trình tạo dòng
bằng P1 vector

51
 Hình thành P1 dimer và cơ chế tách phụ thuộc loxP-Cre

loxP (locus of X-over phage): 34 bp; Cre (cyclization recombination) recombinase

52
Đảo đoạn, sát nhập và ly tách đoạn do tái tổ hợp DNA

53
 Phage ôn hòa M13

- ss DNA vòng, 6,4kb

- Xâm nhiễm E. coli qua pilus
- Phage fd và f1 có đặc điểm tương tự M13

54
 Cấu trúc M13

gene VIII: major

structural protein

gene III: minor coat

protein; necessary for
adsorption
55
Bộ gen của M13

56
Xâm nhiễm và nhân bản
của M13 trong E. coli
- Trong tế bào, hình thành
dsDNA, sau đó sao mã thành
ssDNA
- M13 thoát khỏi tế bào, không
làm tan tế bào chủ
- dsDNA của M13 được thu nhận
từ E. coli như thu nhận plasmid
- ssDNA của M13 được thu nhận
từ M13 trong dịch nuôi cấy
E. coli
- Có thể dùng làm vector nhằm
thu nhận DNA mục tiêu ở dạng
mạch đơn
57
Cơ chế sao mã của M13

58
Tạo vector
M13mp1,
M13mp2
- Chèn lacZ‘
vào M13

- Gây đột biến

điểm để
có 01 vị trí
EcoR1
- Chọn lọc
bằng khuẩn
lạc xanh –
trắng
59
 Tạo vector M13mp7 chứa PCS
- Thiết kế một polylinker tạo PCS đối xứng trong lacZ‘ không làm
bất hoạt gen này
- Việc xử lý bằng 1 RE sẽ làm mất đọan PCS

60
Tạo dòng bằng vector M13mp7 và sàng lọc xanh
– trắng

61
Thu nhận gen
mục tiêu từ
M13mp7 tái
tổ hợp

- Sử dụng kết hợp

Sau3A – BamH1
- Thu nhận gen
bằng RE khác
- Hạn chế của
vector M13: chỉ
mang 1,5 – 3kb

62
Cặp vector 2 chiều M13mp8/9

63
Chuyển chiều mạch DNA
từ M13mp8 sang M13mp9

64
Giải trình tự DNA bằng cặp
vector 2 chiều M13mp8/9

65
M13mp18/19

66
 Vector Cosmid: pHC79
- Cosmid:  cos +
plasmid
- Plasmid chứa
trình tự cos giúp
sự nạp gen vào vỏ
phage 
- Có kích thước
nhỏ khoảng 5kb
nhưng có thể
mang DNA có
kích thước đến
45kb
- Thường được
dùng làm vector
để thiết lập ngân
hàng gen
67
 Các bước trong tạo dòng bằng cosmid

- Cắt cosmid tạo

mạch thẳng
- Phân đoạn DNA
bằng RE thành
các đoạn 45kb
- Nối bằng ligase
- Các tổ hợp nối
concatemer chứa
ít nhất 2 trình tự
cos có thể được
packaging in
vitro
- Nhiễm nạp và
chọn lọc dòng tái
tổ hợp
68
 Vector Phagemid
- Phagemid: Phage + plasmid
- Plasmid có 2 trình tự ori (của plasmid và phage): có thể sao
mã như plasmid hoặc phage
: pUC 8 + 1.3kb M13 fragment

69
Chuyển pEMBL8
thành ssDNA
- Đoạn 1.3kp M13 chứa
trình tự nhận diện của
enzyme tổng hợp
ssDNA
- Tổng hợp vector tái tổ
hợp dạng ssDNA:
nhiễm E. coli bằng
M13w để cung cấp
enzyme sao mã +
protein vỏ và biến nạp
bằng vector tái tổ hợp
- Mang được DNA đến
10kb
- Chọn lọc xanh – trắng
70
Phagemid tạo dòng và biểu hiện: pBluescript SK

71
Tế bào chủ

 Tế bào tiếp nhận vector:

+ Duy trì vector bền vững trong tế bào
+ Cho phép sao mã (nhân bản sao) vector bên trong tế bào
+ Cho phép biểu hiện gen được mang bởi vector
 Tế bào chủ và vector phải tương thích với nhau về quá trình sao
mã, phiên mã và dịch mã
 Tế bào chủ thường không ở dạng tự nhiên mà là dạng đột biến
chứa kiểu gen đáp ứng với vector và mục đích tạo dòng hoặc biểu
hiện gen

72
 Teá baøo chuû
- E. coli:
+ Teá baøo chuû phoå bieán nhaát
+ Vi sinh vaät gaây beänh cô hoäi
+ Khoâng tieát enzyme
- Bacillus subtilis:
+ Khoâng gaây beänh, khoâng taïo noäi ñoäc toá, tieát protein
+ Pasmid khoâng oån ñònh trong teá baøo chuû
- Saccharomyces cerevisiae:
+ Teá baøo eukaryote ñöôïc nghieân cöùu di truyeàn kyõ nhaát
+ Söû duïng ñeå bieåu hieän gen eukaryote
- Viruùt ñoäng vaät (SV40, retrovirus…):
+ Duøng ñeå doøng hoùa gen vaøo teá baøo höõu nhuõ, cô cheá
tieàm tan
Establishment of transgenic flies by a P-element method

P5‘ white w w
duch-L1 dsRNA P3‘

Embryo microinjection

Drosophila chromosome w
P5‘ white P3‘
duch-L1 dsRNA
Insertion

Screening and establishment

of transgenic fly line

Analysis 74