Phương pháp phân tích ADN

1
 CÔNG CỤ CƠ BẢN
MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP & KỸ THUẬT CƠ BẢN

2
 Các enzym làm biến đổi acid nucleic - Enzym cắt hạn chế - RE
 Cấu tạo:
– Enzym cắt hạn chế (restriction enzym - RE): các
endonuclease cắt ADN tại hay gần một trình tự
nhận diện đặc hiệu.
 Chức năng
– Cắt và thoái hóa các ADN ngoại lai (ví dụ ADN
phage)  bộ gen của vi khuẩn được ổn định.

3
 Các enzym làm biến đổi acid nucleic - Enzym cắt hạn chế - RE

I & III II
Hoạt tính Endonuclease Endonuclease
Metyl hóa
ATP Cần Không
Vị trí cắt Khá xa điểm nhận diện Tại hoặc rất gần vị trí nhận diện
Ứng dụng Ít Phổ biến trong nghiên cứu
Danh pháp 3 ký tự Latin (in nghiêng) - tên chi và loài (ký tự thứ tư để chỉ
chủng (strain) hoặc plasmid), 1 số La mã - thứ tự phát hiện
enzym.
VD: BamHI: là RE của Bacillus amyloliquefaciens chủng H,
được phát hiện đầu tiên.

4
 Các enzym làm biến đổi acid nucleic - Enzym cắt hạn chế - RE

● RE loại II
 Trình tự nhận diện cắt gồm 4-8 nucleotid,
thường có kiểu palindrome (2 mạch của tt hoàn
toàn giống nhau khi đọc theo chiều 5’ – 3’),
Kiểu cắt:
– Đầu tù: cắt hai mạch tại cùng một điểm
– Đầu so le/dính: cắt mỗi mạch tại một điểm khác nhau
 Ứng dụng
– Cắt ADN trong kỹ thuật tái tổ hợp di truyền
– Phân tích đa hình cắt giới hạn  định danh, phân biệt

5
 Các enzym làm biến đổi acid nucleic - Enzym cắt hạn chế - RE

-AATCAGCTGTTA- -TAAGGATCCAAA-
-TTAGTCGACAAT- -ATTCCTAGGTTT-

Cắt với HaeIII Cắt với BamHI

-AATCAG CTGTTA- -TAAG GATCCAAA-

-TTAGTC GACAAT- -ATTCCTAG GTTT-
Đầu tà (tù) Đầu so le (dính)

6
 Các enzym làm biến đổi acid nucleic - Enzym cắt hạn chế - RE

7
 Polymerase – Phân loại
 Dựa trên sản phẩm và khuôn mẫu:
– ADN polymerase phụ thuộc ADN: enzym sao chép
– ARN polymerase phụ thuộc ADN: enzym phiên mã
– ADN Polymerase phụ thuộc ARN: reverse transcriptase
– Polymerase không phụ thuộc khuôn mẫu: primase

8
 Polymerase – đặc tính chung
 Là enzym tổng hợp acid nucleic từ các đơn vị nucleotid
 Đặc tính chung:
– Hoạt tính tổng hợp 5’- 3’: kéo dài. Gắn thêm dNTP vào đầu 3’-OH của
mồi và phóng thích pyrophosphate. Tùy theo enzym, phản ứng cần có khuôn
mẫu ADN, ARN, hay không.
– Hoạt tính exonuclease 3'- 5': “sửa lỗi”
– Hoạt tính exonuclease 5’- 3’: phân hủy đoạn mồi hay khuôn mẫu.
– Hoạt tính ribonuclease H: Chỉ có ở một số polymerase, nó phân hủy đặc
hiệu ARN khi có sự hiện diện của phức lai ARN/ADN.
– Dịch chuyển sợi: Một số polymerase có khả năng chuyển sợi cũ từ vai trò
khuôn mẫu thành sợi mới đang được tổng hợp.
– Khả năng xử lý: Là giá trị chỉ khả năng của 1 phân tử polymerase có thể
tiếp tục tổng hợp trên sợi khuôn trước khi tách ra và có thể bị thay thế bởi
một polymerase khác.
– Tần suất lỗi: Khi sử dụng in vitro tần suất này thường cao hơn in vivo, phụ
thuộc vào điều kiện tiến hành, khả năng “sửa lỗi” và xử lý của polymerase.
9
 Các hoạt tính của polymerase

ARN RNase H
ADN
Khía (nick)

A T C A G T C C A T C A
T A G T C A G G T A G T
10
 Ligase - ứng dụng
 Là
enzyme tạo liên kết phosphodiester giữa 3’-
OH và 5’-P của hai sợi acid nucleic

ADN ligase ARN ligase

Đối tượng ADN đôi ADN đơn, ARN

ADN ligase của phage T4 ADN ligase của

E.coli
Năng lượng ATP NAD
Cơ chế Nối đầu dính & đầu tù Chỉ nối đầu dính

11
 Phản ứng nối của ligase

A T C A G T C C A T C A
T A G T C A G G T A G T

12
 Công cụ cơ bản – Chủng VSV
 Thường sử dụng E.coli vì
 Bộ máy di truyền được nghiên cứu khá đầy đủ
 Tốc độ tăng trưởng nhanh
 Khả năng gây bệnh thấp

13
 Công cụ cơ bản - Chủng VSV từ E. coli K12
 JM109:
– Có đặc tính bổ sung alpha.
– Nhân bản các vector của phage M13,
– Có thể dùng với plasmid pUC
– Mất gen β-galactosidase trên nhiễm sắc thể, có mang gen
cho đoạn omega của β-galactosidase trên plasmid F, cho
phép nó bị nhiễm bởi các phage dạng sợi như M13.
– Có đột biến trên gen recA mất khả năng tái tổ hợp
tương đồng.
 DH5-α
– Có đặc tính bổ sung alpha.
– Mang gen recA1 đột biến.
– Mang đột biến deoR thu nhận các mảnh ADN lớn
dễ dàng
14
 Công cụ cơ bản - Vector tạo dòng
 Là VLDT trung gian để chuyển gen giữa các tế bào
 Yêu cầu:
 Được sao chép bởi tế bào nhận nó.
 Có trình tự nhận diện của enzym giới hạn để cắt và
đưa gen ngoại lai vào.
 Mang một hay nhiều yếu tố chọn lọc nào đó để phân
biệt hoặc chọn lọc tế bào nhận được vector với tế
bào không nhận được
● Phân loại:
 Plasmid
 Vector từ phage λ
 Cosmid
 Vector từ phage dạng sợi (ít dùng)
15
 Công cụ cơ bản - Vector tạo dòng

16
 Đặc điểm và yêu cầu của vector plasmid
 Plasmid là một phân tử ADN sợi đôi, dạng vòng kín, nhỏ có thể nhân
bản độc lập với nhiễm sắc thể trong tế bào.
 Yêu cầu:
– Có yếu tố đánh dấu để chọn lọc dòng tái tổ hợp, thường là một hay
nhiều gen kháng kháng sinh.
– Có điểm khởi đầu sao chép (Ori) cho phép nhân bản plasmid trong tế
bào chất không phụ thuộc NST. Trình tự của Ori quyết định số bản sao
của plasmid trong một tế bào.
– Có vùng tạo dòng (Multiple Cloning Site - MCS): là một trình tự ADN
ngắn, mang nhiều trình tự nhận diện duy nhất của các RE khác nhau
nằm liên tiếp (polylinker), cho phép cắt để mở vòng plasmid và nối
đoạn gen mong muốn vào.
 1 số plasmid có thể mang yếu tố đánh dấu chèn để nhận biết
plasmid sau khi đưa vào tế bào đã được nối với gen ngoại lai trong
vùng tạo dòng hay chưa.
 Plasmid được đưa vào tế bào chủ bằng cách biến nạp
(transformation) hay thẩm điện (electroporation).

17
 Công cụ cơ bản - Vector tạo dòng

18
 Plasmid
pUC
Kích thước nhỏ (2,7 kb), có gen kháng ampicillin, điểm Ori của
pBR322 và một phần gen lacZ của E. coli. MCS (tương tự M13) nằm
trong đoạn lacZ nên có thể dùng kỹ thuật bổ sung alpha để làm yếu
tố đánh dấu chèn. Cho số bản sao cao, và có thể được khuếch đại
bằng chloramphenicol.

19
 Plasmid

pBR322
Plasmid dài 4363 bp,
dùng để tạo dòng nhanh
và đơn giản các đoạn
ADN. Có gen kháng
tetracycline và
ampicillin. Hiệu suất tạo
dòng thấp hơn các
vector sau này.

20
 Plasmid
pGEM và pBluescript II
Mang nhiều yếu tố thuận tiện cho thao tác. Kích thước khá nhỏ (2,9
kb), cho số bản sao cao trong tế bào E. coli thích hợp. MCS nằm
giữa 2 promoter T7 và T3 cho phép phiên mã từ trình tự được chèn
vào.

21
 Đặc điểm của vector phage lambda
 Phage tiêu giải

22
 Đặc điểm vector phage lambda
 Vector:
– Cắt bỏ một phần bộ gen của phage không
liên quan đến quá trình tiêu giải và thay
thế bằng đoạn ADN cần tạo dòng.
– Kích thước sau tái tổ hợp phải > 78% (38
kb) và < 102% (51 kb) so với dạng hoang
dại (50 kb) thì mới đóng gói dễ dàng thành
phage được.

● Ưu điểm trong xây dựng các thư viện tái tổ hợp.

Đóng gói in vitro. Điều này rất có ý nghĩa vì khi đó chỉ cần một lượng ít
vector và ADN cần chèn. Đóng gói in vitro là cách đơn giản nhất để đưa
ADN tái tổ hợp vào tế bào E. coli chủ.
Các thư viện phage có thể dễ dàng phát hiện với mẫu dò, khuếch đại và
bảo quản trong một thời gian dài.

23
 Vector cosmid
 Đặc điểm
– Là một dạng lai giữa phage và plasmid
– Mang yếu tố chọn lọc, điểm Ori của plasmid,
– Vị trí tạo dòng
– Các trình tự của phage lambda mã hóa cho vị trí cos.

24
 Vector cosmid
● Hoạt động:
- Cắt vector bằng RE tại vị trí tạo dòng và trộn với đoạn
gen muốn chèn (có chiều dài từ 35 - 45 kb)
- Vector và đoạn chèn được nối lại bằng ligase, tạo thành
một sợi ADN thẳng với đoạn chèn bị kẹp giữa 2 phần của
vector và tận cùng với các vị trí cos ở 2 đầu.
- Đóng gói in vitro nhờ nhận diện 2 vị trí cos: Sợi ADN này
khi ủ với các protein vỏ sẽ tạo thành phage và được gây
nhiễm vào E. coli.
- Sau khi vào tế bào chủ, ADN tái tổ hợp sẽ tạo thành
vòng nhờ vị trí cos và hoạt động như một plasmid.

25
 Vector cosmid

26
 Các ưu điểm của cosmid
 Tạo dòng các đoạn gen có kích thước lớn đến
50 kb (plasmid & phage λ: <15kb)
 Có thể đóng gói in vitro và đưa gen vào tế bào
bằng cách gây nhiễm, do đó đơn giản, hiệu quả
và tiết kiệm ADN
 Trong tế bào hoạt động như plasmid: dễ thao
tác, duy trì

27
 Phương pháp chiết tách ADN

28
 Phương pháp chiết tách ADN
 Nguyên tắc chung: 3 bước
– Phá vỡ tế bào: vật lý, hóa học
– Chiết tách acid nucleic: Phenol-Chloroform  loại Protein trong
pha tủa, thu ADN trong pha tan
– Kết tủa acid nucleic: cồn tuyệt đối hoặc isopropanol, …

29
 Phương pháp chiết tách ADN

 Các trường hợp cụ thể:

– Plasmid: loại NST bằng sự khác nhau về cấu dạng - kích thước
– ADN thực khuẩn: tủa phage bằng PEG, loại bỏ capsid
– Tế bào Thực vật: phá tế bào bằng cách nghiền
– Tế bào Động vật: phá tế bào bằng enzym - chất tẩy

30
 Phương pháp chiết tách ADN plasmid
 Yêu cầu không lẫn ADN nhiễm sắc thể.
 Tách dựa trên kích thước
– Phá vỡ tế bào trong điều kiện được kiểm soát chặt chẻ và êm dịu,
– ADN nhiễm sắc thể không bị đứt đoạn nên có kích thước rất lớn và
thường gắn với màng tế bào → loại bỏ bằng cách ly tâm.
 Tách dựa trên cấu dạng - phương pháp thủy giải kiềm
– Tế bào bị phá vỡ với tác nhân tẩy ion hóa như SDS, khi đó các ADN lớn
như nhiễm sắc thể bị đứt đoạn.
– pH dung dịch được nâng lên 12 - 12,5 bằng NaOH làm cho các ADN
thẳng bị tách thành sợi đơn,
– ADN plasmid ở dạng supercoil (siêu xoắn) nên không bị tác động.
– Khi thêm acid để làm hạ pH, ADN sợi đơn lại tái hợp, nhưng vì sợi quá
dài nên kết hợp không chính xác tạo nên bó rối dày đặc, không tan và
có thể dễ dàng loại bỏ bằng ly tâm.
– Phương pháp này còn thuận lợi hơn vì trong điều kiện ly giải như vậy,
hầu hết protein và ARN cũng trở thành không tan và bị loại bỏ.

31
 Tinh chế acid nucleic
 Ly tâm phân đoạn: acid nucleic được siêu ly tâm trong thang tỷ
trọng saccarose hay CsCl2 (lượng acid nucleic cần tinh chế lớn)
 Sắc ký
• Lọc gel: tách acid nucleic theo kích thước phân tử ở qui mô lớn.
• Trao đổi ion trên vi cột  thu hồi những lượng ADN rất nhỏ
• HPLC:đối với các oligonucleotide, độ phân giải cao (1 nucleotid)
• Hấp phụ (ái lực): mARN được hấp phụ bằng resin có gắn oligo
dT hay dU.
• Điện di gel, polyacrylamid

32
 Định tính - định lượng acid nucleic
 Định lượng = Quang phổ kế:
– Nguyên tắc: sự hấp thụ mạnh của base ở λ = 260 nm
– 1 đơn vị OD260nm tương đương nồng độ:
 50 μg/ml dung dịch ADN (hoặc ARN) sợi đôi
 40 μg/ml dung dịch ARN (hoặc ADN) sợi đơn
 20 μg/ml oligonucleotid (tới 70 base)

– Độ tinh khiết: OD260/230 hoặc OD260/280 và OD320nm(ADN tinh

khiết: 1.8 ≤ OD260/280 ≤ 2). Protein hấp thu ở λ = 280 nm

33
 Định tính - định lượng acid nucleic
 Điện di gel: phân tách acid nucleic bằng dòng điện trong
gel
– Định tính theo kích thước khi so với chuẩn
– Định lượng bằng so sánh với chuẩn
 Nguyên tắc:
 ADN tích điện âm, di chuyển về cực dương
 Hệ gel: agarose hay acrylamide
 Tốc độ điện di ADN qua gel tùy thuộc vào:
 Kích thước ADN
 Cấu dạng ADN: siêu xoắn, vòng, thẳng
 Nồng độ gel
 Điện thế
34
 Điện di

35
 Lai acid nucleic (lai phân tử)
 Lai hóa: 2 phân tử acid nucleic sợi đơn bắt cặp bổ sung với nhau
 phân tử sợi đôi = phân tử lai = duplex
 Biến tính: duplex tách ra thành các sợi đơn
 Phản ứng lai đặc hiệu: bắt cặp bổ sung hoàn toàn xảy ra trên
một vùng liên tục giữa hai mạch
 Phản ứng lai không đặc hiệu: một phân tử chỉ bắt cặp một phần
với phân tử kia

G-T-A-G-T-C-C Lai hóa G-T-A-G-T-C-C

+
T-C-A-G-G-T Biến tính T-C-A-G-G-T
36
 Lai acid nucleic - yếu tố ảnh hưởng
 Độ đặc hiệu và độ bền của duplex phụ thuộc vào:
– Nhiệt độ: quyết định độ bền của liên kết hydro
– Độ dài các trình tự lai: càng lớn duplex càng bền; thời gian
phản ứng càng lâu.
– Tỷ lệ GC trong duplex: càng cao duplex càng bền
– Nồng độ ion: ảnh hưởng đến độ bền của liên kết hydro
– Nồng độ các phân tử (ADN) và thời gian phản ứng

37
 Lai acid nucleic - yếu tố ảnh hưởng

 Nhiệt độ chảy (Tm): nhiệt độ mà 50% số duplex được hình

thành
 Phụ thuộc chiều dài và tỷ lệ GC của duplex, nồng độ ion

Tm (oC) = 4(GC) + 2(AT)

To > Tm: biến tính duplex
To < Tm: phản ứng lai (hồi tính)

38
 Các kỹ thuật lai acid nucleic và ứng dụng
 Phản ứng lai diễn ra giữa một phân tử đích (phân tử cần được phát
hiện) và một đoạn dò (probe).
 Kỹ thuật
– Lai trên màng rắn: kỹ thuật blot. Các biến thể của lai trên màng:
 Southern blot: đích ADN
Lai sau khi điện di, cố định trên màng cellulose
 Northern blot: đích ARN
 Dot blot: hh acid nucleic đích được chấm trực tiếp
– Lai tại chỗ
– Lai trong dung dịch: chẩn đoán phát hiện dựa trên acid nucleic.

39
 Đoạn dò

 Đoạn dò là oligonucleotid được đánh dấu:

– phóng xạ, huỳnh quang, enzyme, …
  phát hiện được sự lai có diễn ra hay không hay phân tử
đích có tồn tại hay không.

Ứng dụng:
• Trong shpt, phát hiện sự tồn tại của acid nucleic đích, nghiên
cứu sự biểu hiện gen.
• Trong y học : chẩn đoán phát hiện bệnh dựa trên acid nucleic và
nghiên cứu bệnh học.

40
Southern
blot
 Kỹ thuật PCR: sao chép ADN in vitro
 Khuôn ADN sợi đơn được gắn mồi nhờ lai hóa
đặc hiệu
 ADN polymerase kéo dài mồi theo nguyên tắc
bổ sung với khuôn ADN sợi đơn  ADN sợi đôi
 Phản ứng được quay vòng nhờ
• Mồi thừa
• Tái tạo khuôn ADN sợi đơn từ sản phẩm sợi đôi
bằng nhiệt độ cao

Polymerase nucleotid

5’-P 3’-OH
3’-OH 5’-P

42
 PCR
ADN đích
3’ 5’
5’ 3’ Sau mỗi chu kỳ số
3’ 5’ ADN sợi đơn làm
ADN đích biến tính
5’ 3’ khuôn mẫu cho việc
3’ 3’ gắn mồi tăng gấp đôi
Gắn mồi
Đoạn
3’ 3’
Đoạn  số sản phẩm tăng
đích Kéo dài đích
quay quay theo cấp số nhân
lại lại
Biến tính

Gắn mồi

Kéo dài

Biến tính và gắn mồi

Kéo dài

Tiếp tục biến tính, gắn mồi và kéo dài trong 20-40 chu kỳ
43
 Kỹ thuật PCR gồm 3 bước
 biến tính ADN sợi đôi thành các sợi đơn nhờ
nhiệt độ,
 ủ các đoạn mồi (chuỗi oligonucleotid tổng hợp
đặc hiệu) với các AND sợi đơn,
 enzym kéo dài các đoạn mồi theo nguyên tắc
bổ sung với khuôn mẫu.

44
 PCR - Các yếu tố kỹ thuật
 Chương trình PCR
– Biến tính khởi đầu: 95oC / 5-10 phút
– Chu kỳ nhiệt: gồm 3 bước lặp lại 25-40 lần
 Biến tính: 94-95oC, 30 giây  vài phút
 Gắn mồi: 40-70oC (< Tm của mồi), 30 - 60 giây
 Kéo dài: nhiệt độ ≈ nhiệt độ tối thích của enzym (thường là 65-74oC
đối với enzym polymerase chịu nhiệt), thời gian tùy theo độ dài
khuôn (thường 1 phút cho mỗi kb)
– Kéo dài kết thúc: 72-74oC / vài lần thời gian kéo dài
 Thành phần phản ứng: 20-100 µl
– Khuôn mẫu: 1 pg - 1 μg, nồng độ cao sẽ ức chế phản ứng.
– Mồi: 0,1 - 1 μM, nồng độ quá cao sẽ dẫn đến bắt cặp sai và làm
giảm tính đặc hiệu.
– Đệm: cung cấp pH thích hợp cho phản ứng và có nồng độ Mg2+
thay đổi (cần tối ưu hóa), thường trong khoảng 0,5-5 mM.
– Hỗn hợp các dNTP: A, T, G và C, nồng độ 200-250 μM
– ADN polymerase chịu nhiệt: 0,5 - 2,5 đơn vị cho mỗi phản ứng
– Nước vừa đủ.
45
 Nguồn gốc và đặc điểm một số ADN polymerase chịu nhiệt

 Lựa chọn tùy theo

– Độ chính xác mong muốn
– Độ dài của khuôn mẫu
– Giá thành và tính sẵn có

46
 Yêu cầu của mồi (primer) trong PCR
 Chiều dài 18-30 nucleotid, có trình tự bổ sung đặc hiệu
với khuôn mẫu
 Khoảng cách các vị trí bắt cặp trên khuôn mẫu giữa hai
mồi không quá 10 kb (tốt nhất là < 3kb)
 Tỷ lệ GC chiếm 40-60%. Các nucleotid AT và GC được
phân bố đều, tránh dồn vào một chỗ. Trình tự của mồi
không tạo cấu trúc kẹp tóc và hai mồi không bắt cặp với
nhau
 Nhiệt độ chảy của hai mồi phải gần nhau và trong
khoảng 40-65oC, nhưng tốt nhất là 52-58oC

47
 Nồng độ mồi, nhiệt độ bắt cặp
 Nồng độ: 0,1 µM - 1 µM
 Công thức tính Tm = 2(A+T) + 4(G+C)
 Nhiệt độ bắt cặp = Tm - 5oC (cần được tối ưu)

48
 Các yếu tố cần được tối ưu hóa trong PCR
 Nồng độ Mg2+: liên quan đến khả năng xử lý
khuôn mẫu của polymerase, cần tối ưu hóa cho
từng khuôn mẫu khác nhau. Thường trong
khoảng 0,5-5 mM
 Nhiệt độ gắn mồi = Tm - 5oC (cần được tối ưu)
– quyết định tính đặc hiệu của phản ứng.
– quá cao phản ứng khó diễn ra, quá thấp → không đặc
hiệu.

49
 Yếu tố quyết định kích thước đoạn khuếch đại
 Khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngược
 Tối đa tùy theo khả năng xử lý của enzym
 Thường <3 kb đối với enzym thông thường. Có
thể đến 40 kb đối với một số enzym đặc biệt.

50
 Vai trò, nồng độ Mg++
 Liên quan đến cấu trúc, tính ổn định của khuôn,
nhiệt độ chảy và sự gắn mồi
 Thường được cung cấp dưới dạng muối chlorid
hay sulfat
 Mỗi phản ứng có nồng độ Mg++ tối ưu khác
nhau  cần khảo sát bằng thực nghiệm
 Nồng độ thường dùng: 0,5-5 mM

51
 Nồng độ dNTP trong PCR
 Nồng độ: 20-200 µM / mỗi loại
 Nồng độ quá cao làm tăng tỷ lệ lỗi hoặc ức chế
hoạt động enzym Taq polymerase
 Mất cân bằng về tỷ lệ các nucleotid  tăng lỗi
 Nồng độ quá thấp tạo các sản phẩm không
hoàn chỉnh

52
 Ưu nhược điểm
 Ưu
– Nhanh, Đơn giản, Nhạy, Đặc hiệu
 Nhược
– Phải biết trình tự 2 đầu để thiết kế mồi
– Ngoại nhiễm  mất tính đặc hiệu

53
 Kiểm soát ngoại nhiễm trong PCR
 Phản ứng dễ bị nhiễm tạp của các đoạn ADN
ngoại lai và chúng có thể được khuếch đại cùng
với mẫu.
 Các ADN lạ này có thể được mang sang từ các
sự khuếch đại trước đó (amplicon) hoặc từ các
nguồn khác.
 Kiểm soát:
– qui trình thực hiện phải được tuân thủ chặt chẻ,
– kiểm tra chất lượng enzym một cách nghiêm ngặt
– sử dụng bộ pipet riêng
– các thành phần phản ứng nên được phân liều trước,
– khu vực chiết tách ADN, thực hiện phản ứng và phát
hiện sản phẩm nên tách biệt và thường xuyên được
54
chiếu UV để làm giảm acid nucleic trong không khí.
 Ứng dụng PCR
 Tạo đoạn ADN mong muốn
 Giải trình tự
 Gây đột biến
 Chẩn đoán, Phát hiện và định danh sinh vật
 Xác định quan hệ di truyền
 Nhận dạng tội phạm,…

55
 Tái tổ hợp ADN - Tạo dòng gen
 Địnhnghĩa: Đưa đoạn gen vào một tế bào chủ
sao cho nó có thể nhân bản được cô lập đoạn
gen tinh khiết với số lượng lớn nghiên cứu
cấu trúc, chức năng
● Bốn bước cơ bản:
- Tạo đoạn ADN,
- Nối đoạn ADN cần tạo dòng vào vector: ADN tái tổ hợp
- Đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ
- Chọn lọc dòng tái tổ hợp.

56
 Tái tổ hợp ADN - Tạo dòng gen

57
 Cách tạo đoạn gen mong muốn để tạo dòng
 Dùng RE
– Cắt phân tử ADN lớn (vd: ADN nhiễm sắc thể) thành
các đoạn nhỏ - thường được sử dụng khi xây dựng các
thư viện gen (genomic library).
– Sử dụng 2 loại RE khác nhau để các đoạn tạo ra có
kích thước vừa phải cho việc tạo dòng - phân tích các
đoạn thu được và lập bản đồ các vị trí cắt của bộ gen.
– RE được chọn để cắt cần lưu ý vị trí cắt sẽ tạo ra đầu
tù (blunt end) hay đầu dính (sticky end)
 Kỹ thuật PCR
– Nếu cấu trúc đoạn gen đã được biết
– Thông thường đoạn ADN thu được bằng PCR có các
đầu bị so le (lệch) không xác định về trình tự.
– Làm tà đầu sản phẩm PCR, gắn linker hoặc adaptor
– Thiết kế mồi có chứa trình tự nhận diện cắt của RE

58
 Nối ADN cần tạo dòng vào vector
 Dùng ligase của T4 (được tinh chế từ E. coli bị
nhiễm phage T4).
 Ủ vector đã duỗi thẳng và đoạn ADN với ligase
trong điều kiện thích hợp, phản ứng diễn ra tạo
liên kết phosphodiester và nối các ADN lại.
 Trong trường hợp tạo dòng, ADN tái tổ hợp phải
được nối hoàn chỉnh với các yếu tố của vector
để sẵn sàng được đưa vào và hoạt động trong
tế bào.

59
 Các giải pháp hỗ trợ việc nối ADN đầu tù
 Linker (đoạn nối)
– Oligonucleotid sợi đôi tổng hợp ngắn có đầu tà và chứa trình tự
cắt (đầu dính) của một RE.
– Ligase sẽ nối linker với đoạn ADN có đầu tù,
– Sau đó dùng RE cắt linker để tạo ra đầu dính.
 Adaptor
– Nhược điểm linker → Adaptor - đây là một oligonucleotid sợi đôi
tổng hợp có sẵn một đầu dính
– Ligase sẽ nối adaptor với đoạn ADN có đầu tù và tạo thành đoạn
mới có đầu dính.
– Phía 5’ của đầu dính trên adaptor bị thay nhóm phosphate bằng
nhóm hydroxyl để tránh các adpator tự nối với nhau. Do đó sau
khi nối adpator xong ta phải dùng polynucleotid kinase để trả lại
nhóm phosphate.
 Tạo đuôi homopolymer
– Sử dụng enzym doxynucleotidyl transferase để thêm một loạt
các nucleotid (cùng loại) vào đầu 3’-OH của sợi ADN tạo thành
đuôi homopolymer.
– Trên vector đã duỗi thẳng cũng thực hiện như vậy nhưng với
nucleotid bổ sung với các nucleotid trên sợi ADN. Kết quả cũng
sẽ tạo ra 2 đầu dính dễ dàng nối với nhau bằng ligase.
60
 Các giải pháp hỗ trợ việc nối ADN đầu tù

Cắt
Linker

Adaptor

Homopolymer TTTTTT
AAAAAA

Trên đoạn chèn Trên vector

61
 Nguyên tắc các phương pháp đưa gen vào tế bào
 Biến nạp: dựa vào khả năng đánh bắt ADN của
một số vi khuẩn
 Tải nạp: sử dụng thực khuẩn để gây nhiễm tế
bào đích
 Thẩm điện: dùng điện thế cao làm thủng màng
tế bào để ADN lọt qua
 Chuyển nhiễm: dựa trên khả năng đánh bắt
phức của ADN với một số chất trong chuyển
nhiễm, áp dụng chủ yếu cho tế bào động vật
 Đạn sinh học: gắn ADN vào hạt mang và bắn
xuyên qua màng tế bào.

62
 Biến nạp để đưa gen vào tế bào
 Chuẩn bị tế bào khả nạp:
– Xử lý với CaCl2 (thường sử dụng nồng độ 50 - 100
mM). Tại thời điểm sau khi xử lý, ADN chỉ dính ở mặt
ngoài tế bào chứ chưa vào trong.
– Tế bào khả nạp phải được bảo quản lạnh và khi sử
dụng để ở nhiệt độ thấp (4oC).
 Đưa ADN vào tế bào chất:
– Gây sốc tế bào để việc đánh bắt ADN diễn ra.
– Sốc nhiệt: môi trường tế bào được nâng nhiệt độ lên
42oC trong thời gian ngắn (khoảng 2 phút) rồi làm lạnh
nhanh.

63
 Các phương pháp chọn lọc dòng tái tổ hợp
 Chọn lọc trực tiếp: đây là cách tốt nhất nhưng khó thực
hiện trên thực tế. Trong phương pháp này, đoạn chèn
sẽ mang đến cho tế bào nhận được nó các đặc điểm
kiểu hình mà các dòng khác không có và ta dễ dàng
nhận ra khi phân lập. Ví dụ đoạn chèn mang gen mã
hóa sắc tố hay enzym.
 Lai khóm (colony hybridization): áp dụng cho trường
hợp đoạn chèn đã biết trình tự. Các khóm sau khi phân
lập được in dấu lên màng nitrocellulose hay nylon, tế
bào trên màng bị phá huỷ để bộc lộ vật liệu di truyền.
Màng lọc lúc này được cho lai với đoạn dò được đánh
dấu tương ứng của đoạn chèn. Nếu khóm nào mang
đoạn chèn sẽ có tín hiệu, từ vị trí tín hiệu trên màng
lọc suy ra khóm tương ứng trên hộp thạch ban đầu.

64
 Kỹ thuật bổ sung alpha
 Dựa trên sự hiện diện của hoạt tính β-galactosidase
(chịu trách nhiệm thủy phân lactose thành galactose).
Enzym này là một tetramer, trong đó mỗi monomer có
2 mảnh (alpha và omega). Bộ gen của tế bào chủ bị
đột biến mất hoặc bất hoạt phần mã hóa cho mảnh
alpha, do đó chỉ sản xuất được mảnh omega của
enzym, không đủ để có hoạt tính (kiểu hình lac-, không
thủy phân được lactose). Trong khi đó, vector lại mang
trình tự mã hóa cho đoạn alpha và vị trí chèn gen
ngoại lai sẽ nằm trong trình tự này. Do đó nếu tế bào
nhận vector mang chưa tái tổ hợp thì sẽ được bổ sung
mảnh alpha và có kiểu hình lac+, ngược lại nếu vector
bị tái tổ hợp với gen lạ trong trình tự mã hóa mảnh
alpha thì mảnh alpha sẽ bị bất hoạt và tế bào sẽ có
kiểu hình lac-.
65
 Các phương pháp xác định trình tự ADN
 Phương pháp hóa học Maxam & Gilbert
 Phương pháp enzym Sanger & cộng sự

66
 Phương pháp giải trình tự Maxam và Gilbert
 Phương pháp hóa học: dựa vào sự thủy giải đặc trưng của
ADN (Allan Maxam và Walter Gilbert)
 Qui trình:
– Tạo ADN sợi đơn từ đoạn ADN cần giải trình tự
– Đánh dấu các phân tử ADN ở một đầu
– Thực hiện 4 (hoặc 5) ống phản ứng riêng biệt:
1. G: + dimethyl sulphate  Guanine bị methyl hóa
2. AG: + formic acid  Adenin và Guanine bị metyl hóa
3. TC: + Hydrazine  biến đổi Thymin và Cytosin
4. C: + Hydrazine + 1,5 M NaCl  biến đổi Cytosin
– Xử lý 4 ống trên với piperidine 1M/90oC để cắt ADN ở liên
kết phosphat kế nucleotid bị biến đổi
5. A>C: NaOH 1,2N/90oC cắt ADN ở Adenin > Cytosin
– Mỗi ống được nạp vào một giếng điện di
– Kết quả điện di được đọc và biện luận  trình tự

67
 Phương pháp giải trình tự Maxam và Gilbert

68
 Phương pháp giải trình tự Maxam và Gilbert

69
 Phương pháp giải trình tự Sanger
 Phương pháp enzym/dideoxy: dựa vào sự ngừng
tổng hợp ADN khi gặp phải dideoxy nucleotid
(Frederick Sanger)
 Qui trình:
– Thực hiện 4 phản ứng PCR riêng biệt với 1 mồi:
1. A: có dNTP + ddATP
2. T: có dNTP + ddTTP
3. G: có dNTP + ddGTP
4. C: có dNTP + ddCTP
– Mỗi ống sản phẩm được nạp vào một giếng điện di
– Kết quả điện di được đọc  trình tự

70
 Phương pháp giải trình tự Sanger

71
 Đọc kết quả Phương pháp Sanger
Trình tự cần giải:
5’-GGCCGCGTCTTCGCCGTAG-3’
Sản phẩm của các phản ứng:
5’-GGCCGCGTCTTCGCCGTAG-3’
Phản ứng với ddC (G): số nu Phản ứng với ddG (C): số nu
5’-C
5’-CC
1
2
5’-CCG
5’-CCGG
3
4
ddG ddA ddT ddC
5’-CCGGC 5 5’-CCGGCG 6
7 5’-CCGGCGCAG 9
5’-CCGGCGC
5’-CCGGCGCAGAAGC 13
5’-CCGGCGCAGAAG
5’-CCGGCGCAGAAGCG
12
14
3’
5’-CCGGCGCAGAAGCGGC 16 5’-CCGGCGCAGAAGCGG 15
5’-CCGGCGCAGAAGCGGCATC 19
Phản ứng với ddA (T): số nu
Phản ứng với ddT (A): số nu 5’-CCGGCGCA 8
5’-CCGGCGCAGAAGCGGCAT 18 5’-CCGGCGCAGA 10
5’-CCGGCGCAGAA 11
5’-CCGGCGCAGAAGCGGCA 17
Kết quả điện di các phản ứng:
Số nu G A T C
19
3’
18
17
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
5’
4
3
2
1 5’
72
 Đọc kết quả Phương pháp Sanger

73
 CÂU HỎI

1. Các bước tách chiết ADN/ ADN plasmid?

Chất biến tính protein? Chất kết tủa ADN?
PP tinh chế ADN?
2. Nguyên tắc định tính/ định lượng ADN?
3. Vai trò RE? Vị trí cắt? Các loại RE?
4. Ligase? ADN ligase?
5. Lai phân tử? Yếu tố quyết định độ bền
duplex? Các pp lai? Đặc điểm đoạn dò?
6. PCR? Thành phần 1 phản ứng PCR? Các
bước của chu kỳ nhiệt? Nhược điểm?
7. Đặc điểm mồi? Tm? T mồi?
8. Giải trình tự? Sanger/Maxam Gilbert?
9. Vector tạo dòng? Các loại vector tạo dòng?
Yêu cầu của 1 vector tạo dòng?Các bước
tạo dòng?

74
 Các Biến thể: Nested PCR (PCR tổ)
 Khi khuôn mẫu có chất lượng kém hoặc việc thiết kế mồi có tính
đặc hiệu gặp khó khăn → sản phẩm PCR không đặc hiệu
 PCR (tổ): thực hiện 2 phản ứng PCR liên tiếp với 2 bộ mồi khác
nhau:
– Phản ứng 1: thực hiện trên khuôn mẫu nguyên thủy, dùng bộ mồi
ngoài, cho sản phẩm chứa khuôn mẫu của bộ mồi thứ 2 (mồi trong)
– Phản ứng 2: dùng sản phẩm của phản ứng 1 làm khuôn mẫu, với bộ
mồi trong (1 trong 2 mồi trong có thể trùng với mồi ngoài)
 Tăng tính đặc hiệu hoặc khuếch đại các khuôn mẫu không tốt

Phản ứng 1

Sản phẩm 1

Phản ứng 2

75
Sản phẩm cuối cùng
 Biến thể PCR: Multiplex PCR
 Dùng nhiều bộ mồi của nhiều khuôn mẫu trong
một phản ứng
 Cho phép khuếch đại cùng lúc nhiều khuôn
mẫu, được ứng dụng trong chẩn đoán-phát
hiện, vd. phát hiện đề kháng đa kháng sinh
 Cần thiết kế mồi và điều kiện PCR để:
– Các phản ứng không ức chế hay cạnh tranh lẫn nhau
– Các sản phẩm của khuôn mẫu khác nhau có kích
thước hoặc đánh dấu khác nhau.

76
 Biến thể PCR: RT-PCR (PCR ngược)
 Khuôn mẫu là ARN
 Gồm 2 phản ứng liên tiếp trong 1 ống:
– Phiên mã ngược: sử dụng ARN làm khuôn, enzym
revese transcriptase, nhiệt độ thấp (40-50 oC): tạo bản
sao ADN
– PCR: sử dụng bản sao ADN làm khuôn
Khuôn ARN, phản ứng 1

Khuôn ADN, phản ứng

2, sản phẩm sợi đôi

Khuôn ADN, phản ứng

2, tiếp tục

Sản phẩm cuối cùng

77