16-Nov-21

16-Nov-21
16-Nov-21
DNA genomic library?
Thư viện DNA bộ gene
(DNA genomic library)
 DNA genomic library là gì?

• Tập hợp tất cả các đoạn DNA của bộ gene sinh

vật.
• Các đoạn DNA được tạo dòng trong các vector
• Sử dụng nhằm phân lập một đoạn DNA hoặc
xác định vị trí của đoạn DNA trên bộ gene
Thực hiện (phage hoặc cosmid)

RE
Siêu âm
-----------
B1. Cắt bộ gene bằng RE
• Sử dụng các RE có trình tự nhận biết gồm 4 nu
• Cắt từng phần để thu được lượng lớn gene
nguyên vẹn.
• Sử dụng DNA tách từ các loại mô khác nhau
• Cắt vector với cùng RE để tạo đầu cố kết
• Có thể sử dụng 2 RE để tránh tự kết nối.
B2. Tạo dòng
• Plasmid: hạn chế đối với đoạn DNA kích thước lớn,
hiệu suất biến nạp tương đối thấp.
• Phage : phổ biến nhất, mang DNA ~ 20 kb
• Cosmid: mang đoạn DNA ~ 40 – 50 kb
• BAC : hữu hiệu nhất
– Mang đoạn DNA lớn 100 – 300 kb
– Ít hình thành thể khảm
– Hiệu quả trong tạo dòng và thu hồi DNA
– Duy trì sự ổn định của DNA gắn trong vector
• YAC : nhận đoạn DNA lớn, khó thao tác.
B3. Chuyển nạp vào tế bào chủ
• Hóa biến nạp
• Điện biến nạp
• Đóng gói DNA tái tổ hợp (phage  hoặc
cosmid) và cho xâm nhiễm tế bào vi khuẩn
 cDNA library
Tại sao cần xây dựng thư viện cDNA ?
 Tách chiết, tinh sạch và phân tích RNA

1) Tách chiết RNA tổng số

- Nguyên lý: tách rời RNA ra khỏi hỗn hợp DNA ,
protein,…
- Kiểm soát ribonuclease (RNase) = chất ức chế
2) Tách chiết mRNA
- Đuôi poly A
- Tách bằng sắc ký ái lực oligo dT
- Thu nhận bằng ly tâm
 cDNA synthesis

16-Nov-21
 cDNA synthesis

16-Nov-21
 cDNA synthesis

16-Nov-21
Tổng hợp cDNA self priming
Tổng hợp cDNA self priming
Tổng hợp cDNA self priming
Tổng hợp cDNA theo pp RNaseH
Tổng hợp cDNA đuôi trùng hợp
Tổng hợp cDNA đuôi trùng hợp
Tổng hợp cDNA đuôi trùng hợp
Tạo dòng cDNA = hệ thống dG:dC
Tạo dòng cDNA = hệ thống dG:dC
Tạo dòng cDNA = hệ thống dG:dC
Tạo dòng cDNA bằng 1 linker
Tạo dòng cDNA bằng 2 linker
Tạo dòng cDNA bằng adapter

HindIII
Tạo dòng cDNA bằng primer-adapter
Tạo dòng cDNA bằng primer-adapter
Tạo dòng cDNA bằng primer-adapter
Tạo dòng cDNA bằng primer-adapter
1. Thư viện DNA là gì?
2. Thư viện cDNA là gì?
3. Mục đích và ứng dụng của 2 loại thư viện
này.
4. Tại sao cần tổng hợp cDNA?
5. Các loại primer sử dụng tổng hợp cDNA
6. Các phương pháp tổng hợp cDNA, đặc
điểm
7. Các phương pháp tạo dòng cDNA
8. Hãy tạo dòng có định hướng một cDNA
trong vector có chứa trình tự của enzyme
EcoRI và BamHI
16-Nov-21
 Tạo mẫu dò (probe)
a) Đánh dấu ở đầu 5’ đoạn DNA bằng đồng vị
phóng xạ
 Tạo mẫu dò (probe)
b) Dịch chuyển điểm đứt (Nick translation)

DNase I
 Tạo mẫu dò (probe)
c) Tổng hợp đoạn bổ sung

Hoặc DNA
polymerases
 Tạo mẫu dò (probe)
Đánh dấu với các phân tử phát sáng (fluorescently
labeled)
Sàng lọc dòng DNA bằng lai nucleic acid

1. Mẫu dò tương đồng (100 %, đã biết trình tự

- Chứa 1 phần trình tự giống hệt đoạn DNA
mục tiêu.
- Lai trong các điều kiện nghiêm ngặt để thu
được kết quả chính xác.
Sàng lọc dòng DNA bằng lai nucleic acid

1. Mẫu dò tương đồng (100 %, đã biết trình tự)

2. Mẫu dò tương đồng một phần (từ loài tương cận
đã biết trình tự DNA quan tâm)
- Dùng phát hiện DNA có quan hệ họ hàng,
nhưng không giống nhau hoàn toàn.
Sàng lọc dòng DNA bằng lai nucleic acid

1. Mẫu dò tương đồng (100 %, đã biết trình tự)

2. Mẫu dò tương đồng một phần (từ loài tương cận
đã biết trình tự DNA quan tâm)
3. Mẫu dò tổng hợp nhân tạo (từ trình tự protein
đã biết)
Mẫu dò nhân tạo từ trình tự protein đã biết
1. Các phương pháp lai nucleic acid
Lai tại chỗ (In situ hybridization)
1. Các phương pháp lai nucleic acid
Southern blotting
 1. Sàng lọc bằng lai nucleic acid
VD: Southern blotting

Phóng xạ tự ghi Digoxygenin dUTP

2. Sàng lọc dòng DNA bằng thử miễn dịch
(immunochemical screening)
3. Sàng lọc dòng DNA bằng thử hoạt tính protein

lipase chitinase

Trioleoylglycerol chitin
+ thuốc nhuộm huỳnh quang
 Dòng DNA có đúng là dòng mong muốn?

1. Open reading frame.

2. Dự đoán trình tự và chức năng
3. Đánh giá chức năng của sản phẩm DNA
4. Xem xét sự biểu hiện của DNA ở các loại mô
khác nhau
5. Đột biến và đánh giá chức năng