Công nghệ sinh học thực phẩm

1
 Chương 2: Các kỹ thuật của công nghệ gen
2.1. DNA – Trung tâm của CNSH (The Heart of Biotechnology)

2.2. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology)

2.2.1. Sơ đồ khái quát

2.2.2. Các công cụ

2.3. Các phương pháp căn bản trong công nghệ gen

2.3.1. Phương pháp PCR

2.3.2. Phương pháp điện di trên gel agarose

2.3.3. Phương pháp xác định trình tự gen

2
2.3.4. Kỹ thuật lai DNA (Southern blot)
 2.1. DNA – Trung tâm của CNSH
2.1.1. Khái niệm
2.1.2. Thành phần hoá học
2.1.3. Cấu tạo
2.1.4. Sinh tổng hợp và phân giải nucleic acid

3
 2.1.1. Khái niệm
- Là polynucleotides, được tạo thành bởi các mononucleotide kết
hợp với nhau bằng liên kết phosphodiester

- Bao gồm

+ DNA (deoxyribonucleic acid)

+ RNA (ribonucleic acid)

Hàm lượng

- Trong cơ thể sống, tổng nucleic acid chỉ chiếm vài phần trăm

- Trong tế bào của các mô khác nhau của cùng cơ thể thì số lượng
DNA giống nhau.
4
 Sự phân giải của nucleic acids
Nucleic acid
(DNA, RNA)

Ribonuclease
Desoxyribonuclease

Mononucleotide
Nucleotidase

H3PO4 Nucleoside
Nucleosidase

Base nit¬ §-êng pentose

Base pyrimidine Base purin Deoxyribose Ribose

DNA RNA
5
 2.1.2. Thành phần hoá học

2.1.2.1. Các base nitơ

2.1.2..2. Đường pentose

2.1.2.3. Các nucleoside

2.1.2.4. Các nucleotide

6
 2.1.2. Thành phần hoá học
Base nitơ

- Là dẫn xuất của purines hoặc pyrimidines

+ Purines: Adenine (A) và Guanine (G). Cả 2 base này gặp trong

cả DNA và RNA

+ Pyrimidines:

++ DNA là Cytosine (C) và Thymine (T)

++ RNA là cytosine (C) và Uracil (U)

Đường pentose

- Đường Ribose có trong RNA

- Đường deoxyribose có trong DNA 7

 2.1.2. Thành phần hoá học
Nucleoside

- Là lk giữa base nitơ với đường bằng lk N- Glucoside (C1 của đường
với N3 của base pyrimidine và với N9 của base purin)

Nucleotides

- Là liên kết giữa nucleoside với acid phosphoric, giữa nhóm OH ở vị trí
C5` của đường với acid phosphoric

8
Base nitơ

9
Đường pentose

10
Nucleoside và nucleotide

11
Nucleoside và nucleotides trong DNA
và RNA

12
 2.1.3. Cấu tạo
- Liên kết phosphodiester

- Cấu trúc bậc 1 của nucleic acid

- Cấu trúc bậc 2 của nucleic acid

- Cấu trúc bậc 3 của nucleic acid

- Cấu trúc bậc 4 của nucleic acid

13
 Liên kết phosphodiester
- Liên kết giữa các mononucleotides trong chuỗi polynucleotide

- Liên kết này được tạo thành giữa nhóm OH đường của
mononucleotide nay gốc phosphate của một mononucleotide kế tiếp

- Liên kết phosphodieste được tạo thành giữa các vị trí 3` và 5`. Đầu
5` thường có gốc phosphate và đầu 3` có nhóm OH tự do

14
 Cấu trúc bậc 1 của nucleic acid
- Là trình tự của các nucleotides trong chuỗi polynucleotide (DNA
và RNA)
- Các (dNTP) tham gia tạo thành các DNA gồm dATP, dGTP,
dCTP, dTTP
- Các NTP tham gia tạo thành các RNA gồm ATP, GTP, CTP, UTP

15
Cấu trúc bậc 1 của nucleic acid

16
 Cấu trúc bậc 2 của nucleic acid
* DNA (Deoxyribonucleic acid )
- Là cấu trúc vòng xoắn kép của 2 chuỗi polydeoxyribonucleotide
nhờ liên kết hydro giữa các cặp base tương ứng

+A liên kết T bằng 2lk hydro

+ G liên kết C bằng 3 lk hydro

- Hai chuỗi polynucleotides với cực trái ngược nhau, xoắn song song
xung quanh 1 trục chung

17
 Cấu trúc bậc 2 của DNA
- Gốc base quay vào phía trong của xoắn còn các gốc phosphat và
đường quay ra phía ngoài
- Chiều cao của mỗi vòng xoắn là 34Ao gồm 10 bậc thang tức là mỗi
vòng xoắn gồm 10 nucleotide. Hai base kề nhau cách nhau 3,4Ao
- Đường kính của xoắn là 20Ao
- Biết trinh tự sắp xếp của deoxyribonucleotides trên một chuỗi có thể
thiết lập chính xác trình tự sắp xếp của các deoxyribonucleotides trên
chuỗi kia.

18
Cấu trúc bậc 2 DNA

19
Cấu trúc bậc 2 DNA

20
A và T liên kết với nhau trong DNA

21
G và C liên kết với nhau trong DNA

22
 Cấu trúc bậc 2 của RNA

* RNA (ribonucleic acid )

Cấu trúc xoắn nhưng vì có một sợi nên có cấu trúc xoắn từng đoạn

23
 Cấu trúc bậc 3 của nucleic acid
* DNA (Deoxyribonucleic acid)
- Dạng vòng 1 sợi
+ Gặp trong DNA của thực khuẩn thể
- Dạng vòng của DNA sợi kép 2 sợi
+ DNA của tế bào ty thể, plasmid, lục lạp.
* RNA (ribonucleic acid)
Cấu trúc cuộn trong không gian tạo ra các thuỳ (tRNA)

24
25
Cấu trúc bậc 3 của nucleic acid

26
 2.2. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (DNA
recombinant technology)
2.2.1. Khái niệm DNA tái tổ hợp và các bước tạo DNA tái tổ
hợp
2.2.2. Các công cụ

27
2.2.1. Sơ đồ khái quát

28
 Khái niệm về DNA tái tổ hợp

DNA tái tổ hợp: DNA được tạo ra có thể từ nhiều nguồn vật liệu di
truyền khác nhau (nhờ kỹ thuật ghép nối các đoan DNA cùng một loài
hoặc các loài khác nhau)
VD. Chuyển một gene mã hóa một enzyme nào đó từ tế bào cho đến tế
bào nhận nhờ vectơ chuyển gene

29
30
 Các bước để tạo DNA tái tổ hợp
B1: - Có tế bào cho chứa đoạn DNA mong muốn

- Có vectơ chuyển gen (plasmid)

B2: Tách chiết DNA tế bào cho

B3: Cắt DNA plasmid và DNA tế bào cho bằng cùng một enzyme giới
hạn

B4: Trộn chung DNA plasmid và DNA có đoạn gene mong muốn từ tế
bào cho

B5: Bổ sung enzyme nối ligase để tạo ra DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh

B6: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân lên

B7: Theo dõi hoạt động biểu hiện của gen đó. Chọn lọc và tạo dòng tế
bào chủ mang DNA tái tổ hợp
 Protease tái tổ hợp trong sản xuất nước
mắm
- Tuyển chọn Bacillus subtilis được phân lập tại Thừa Thiên Huế.

- Gene nprC10 có khả năng tổng hợp protease

- Chuyển gene này vào vector plasmid pET 200/D.

- Biến nạp vector này vào tế bào nhận là E.coli BL21 (chu kỳ ngắn
và môi trường đơn giản)

- Tìm được điều kiện nuôi cấy tối ưu cho E.coli BL21 là 370C trong
môi trường LB với bổ sung thêm kanamycine tốc độ lắc 200v/phút.

- Thu nhận protease tái tổ hợp

32
 2.2.2. Các công cụ
- Các enzyme chủ yếu dùng trong DNA tái tổ hợp
- Các vectơ sử dụng trong DNA tái tổ hợp
- Các loại tế bào chủ
- Đưa DNA vào tế bào

33
 Các enzyme chủ yếu dùng trong DNA tái tổ
hợp
* Các enzyme giới hạn
- Có khả năng nhận biết những đoạn trình tự DNA nhất định (4, 5, 6
nucleotides)
- Cắt DNA ngay điểm này hay điểm kế cận
- Có hai kiểu cắt của enzyme giới hạn
+ Tạo đầu bằng
+ Tạo đầu sole
- Tên gọi. Chi + Loài + Chủng + Thứ tự dòng
Ví dụ: BamHI Bacillus + amyloliquefacien + H+I

34
Các enzyme giới hạn

35
Kết thúc của DNA khi dùng enzyme giới
hạn cắt

36
 Các enzyme khác
* Các enzyme nối (ligase)
- Sửa chữa các mối liên kết phosphodiester (nối các phân tử DNA từ
các nguồn khác nhau)
- Enzyme được sử dụng nhiều nhất trong thí nghiệm là enzyme DNA
ligase của T4, nó được tách chiết từ E.coli bị nhiễm phage T4)
- Enzyme này hoạt động tốt ở nhiệt độ 37oC
* Các enzyme nuclease
- Phân hủy nucleic acid bằng cách làm đứt mối liên kết
phosphodiester nối các nucleotid trong cùng một mạch với nhau
- Endonuclease có tác dụng cắt bên trong sợi
- Exonuclease cắt DNA từ các đầu của phân tử
37

- Ribonuclease chuyên tác động lên RNA

 Các enzyme khác
* Các enzyme polymerase
Các enzyme xúc tác cho quá trình sao chép các nucleic acids (DNA,
RNA)
- Các DNA polymerase: xúc tác cho việc lấp đầy chỗ trống trên
phân tử DNA
- Xúc tác cho việc tổng hợp mạch đơn mới
- Sửa chữa các sai sót trong quá trình sao chép DNA
- Tap polymerase: sử dụng trong việc nhân gen trong kỹ thuật
PCR
- RNA polymerase: được sử dụng trong tổng hợp RNA

38
 Các vectơ sử dụng trong ADN tái
tổ hợp
- Các vectơ plasmid
- Các vectơ phage
- Cosmid
- Plasmid Ti

39
 Các vectơ plasmid
*Ở một số vi khuẩn và nấm men

- Phân tử DNA có kích thước nhỏ (2-5Kb), dạng vòng, nằm độc lập
trong tế bào chất.

- Có khả năng sao chép độc lập, không phụ thuộc vào sự sao chép
DNA NST của vi khuẩn

- Có nhiều cách phân loại plasmid khác nhau

- Tùy theo chức năng và các gen có trên đó người ta chia plasmid
thành nhiều loại khác nhau như

+ Plasmid giới tính (F), Plasmid kháng chất kháng sinh ký hiệu R
40
 Các vectơ plasmid
- Ký hiệu một plasmid: có chữ cái đầu tiên là p (plasmid) + chữ tiếp
theo là (tên tác giả phát hiện hoặc tên loài vi khuẩn có plasmid + chữ
số sau cùng chỉ thứ tự chủng vi khuẩn
- Ví dụ: pBR322, B (Bolivon) và R (Rodriquez) là 2 tác giả tạo lên,
322 là thứ tự chủng vi khuẩn tách chiết plasmid
- Có kích thước 4,36 kb mang 2 gen kháng chất kháng chất kháng sinh
ampicillin và tetracycline
- Một trình tự khởi đầu sao chép (ori)
- Nhiều trình tự nhận biết của enzyme giới hạn
- Có khả năng sao chép độc lập với tế bào E.coli
- Cho phép gắn đoạn gen có kích thước 6kb
41
pBR322

42
 Các vectơ plasmid
Ở một số vi khuẩn và nấm men
- Phân tử DNA có kích thước nhỏ (2-5Kb), dạng vòng, nằm
độc lập trong tế bào chất.
- Có khả năng sao chép độc lập, không phụ thuộc vào sự sao
chép DNA NST của vi khuẩn
- Mỗi tế bào vi khuẩn có khoảng 20 plasmids
- Có nhiều cách phân loại plasmid khác nhau.
* Tùy theo chức năng và các gen có trên đó người ta chia
plasmid thành nhiều loại khác nhau như
+ Plasmid giới tính (F), Plasmid kháng chất kháng sinh ký
hiệu R
VD. Plasmid pBR 322 có kích thước 4.2 kb có chứa
gen kháng tetracilin và ampecillin

43
 Các vectơ plasmid
* Plasmid được cải tiến dần:
- Mang các đặc điểm của plasmid tự nhiên
- Gắn thêm gen chỉ thị
- Có kích thưóc nhỏ
- Có một đoạn đa liên kết (là đoạn polynucleotide mang một chuỗi
các vị trí nhận biết của nhiều loại enzyme giới hạn)
- Gen lacZ dễ dàng nhận biết vectơ tái tổ hợp trên môi trường
thạch.
+ Tổng hợp enzyme β – galactosidase. Enzyme này chuyển hợp chất
Xgal thành hợp chất có màu xanh. Do đó sẽ có khuẩn lạc màu xanh
mọc lên.
+ Khi gen cần chuyển đã gắn vào vectơ ở vị trí gần với gen lacZ thì
sẽ có khuẩn lạc màu trắng do không tổng hợp được enzyme
44
Plasmid cải tiến

45
Gen lacZ

46
1. Cut
2. Add foreign DNA

3. Ligate
4. Transform

47
 Các vectơ Phage
- Cũng như plasmid cũng thực hiện cùng một chức năng là các phân
tử mang các đoạn DNA
- Là những virut của vi khuẩn. Chúng chỉ nhân lên được bên trong vi
khuẩn
- Vật chất di truyền có thể là DNA mạch đơn, mạch kép, hoặc RNA.
Thường thấy là DNA mạch kép.
- Phage có thể mang đoạn DNA có kích thước tới 30 kb

48
 Phage lamda (λ)
- Chúng có đầu capsid chứa hệ gen ADN mạch kép
- Vùng đuôi để cắm vào tế bào chủ
- Quá trình xâm nhiễm của phage vào tế bào vi khuẩn bắt đầu bằng
việc hấp phụ. Phage sẽ bám vào các điểm nhận trên bề mặt vi khuẩn.
- Chúng chia thành phage độc và phage ôn hòa tùy thuộc vào chu trình
sống của chúng.
+ Khi phage chui vào tế bào vi khuẩn, nó có thể sinh ra nhiều
phage và giết chết tế bào vi khuẩn đó (gọi là chu trình sinh tan - lytic)
đây là phage độc
+ Khi phage vào tế bào nó có thể nhập vào NST của vi khuẩn và
ở lại đó mà không giết chết tế bào (gọi là chu trình tiềm tan -
lysogenic). Phage ôn hòa
49
 Phage lamda (λ)
- Hệ gen của phage lamda có chiều dài là 48.5 kb. Toàn bộ hệ gen đã
được giải trình tự.

- Ở hai đầu của hệ gen mạch dài có đoạn ngắn 12bp sợi đơn, chúng bổ
trợ cho nhau. Những đoạn này gọi là những đầu dính, chúng tạo
điều kiện cho hệ gen trở thành mạch vòng sau khi nhiễm vào vi
khuẩn. Được gọi là điểm cos

50
51
Chu trình Phage lamda (λ)

52
Chu trình Phage lamda (λ)

53
 Phage 13
- Hệ gen là phân tử ADN mạch vòng sợi đơn dài 6407 bp

- Phage chỉ xâm nhiễm vào E.Coli có lông F

- Khi ADN chui vào tế bào vi khuẩn thì nó chuyển sang phân tử mạch
đôi gọi là dạng sao chép (replication form - RF)

- Nó sao chép cho đến khi có khoảng 100 bản sao chép trong tế bào

- Các bản sao mạch đơn đó cuộn lại và đóng gói trở thành dạng trưởng
thành và thoát ra khỏi tế bào

- Vi khuẩn vẫn còn sống trong suốt quá trình này mặc dù quá trình sinh
sản và phân chia có chậm hơn so với các tế bào không xâm nhiễm
54
Phage 13

55
 Cosmid vectơ
- Để ghép đoạn ADN lớn (khoảng 30 – 45 kb)

- Có đặc tính kết hợp của plasmid và phage

- Đặc tính của phage là kỹ thuật bọc gói

- Có chứa đầu cos (đầu dính) giúp ADN của phage từ dạng thẳng
nối lại thành dạng vòng tròn nên có thể gói gọn lại trong tế bào

- Có đặc điểm của plasmid nên nó có khả năng tự nhân đôi như
những plasmid của vi khuẩn

56
 plasmid Ti

- Được sử dụng rộng rãi trong việc chuyển gen ở tế bào thực vật
- Bắt nguồn từ vi khuẩn ở trong đất (Agrobacterium tumifaciens) vi
khuẩn tạo khối u ở tế bào thực vật
- Có chứa đoạn gen T – ADN cho phép xâm nhập vào hệ gen của tế
bào chủ

57
 Khả năng mang đoạn gen của một
số vectơ
Hệ thống vectơ TB chủ Độ dài đoạn xen vào
(kb)

Plasmid E.coli 0,1 – 10

Phage E.coli 10 – 30

Cosmid E.coli 30 – 45

58
 Các loại tế bào chủ
- Nhiều loại tế bào chủ khác nhau được sử dụng phụ thuộc vào mục
đích sử dụng

+ Dùng để biểu hiện gen, đặc biệt ở sinh vật nhân chuẩn bậc cao
như động vật và thực vật. Hệ thống tế bào chủ này cần mang tính đặc
thù

+ Tế bào chủ lý tưởng là tế bào dễ nuôi cấy, dễ giữ, và nhân

giống, lại có thể chấp nhận được nhiều vectơ.

- Có thể chia thành hai hệ thống chính

59
 Các tế bào chủ dùng trong kỹ thuật
di truyền
Các nhóm chính Kiểu loại Kiểu loại tế Thí dụ
nhân bào
Vi Khuẩn Nhân sơ Gram âm Escherichia coli
Gram dương Bacillus subtilis
Streptomyces spp
Nấm Nhân chuẩn Vi sinh vật có Sacchromyces
khuẩn ty cerevisiae
Aspergillus
nidulans
Thực vật Nhân chuẩn Tế bào trần Các loại khác nhau
Tế bào nguyên Các loại khác nhau
Cả cơ thể Các loại khác nhau
Động vật Nhân chuẩn Tế bào côn Drosophila
trùng melanogaster
Tế bào động vật Các loại khác nhau
60
Tế bào trứng Các loại khác nhau
 Tế bào chủ nhân sơ
- Vi khuẩn E.coli là tế bào chủ được sử dụng nhiều

+ Dễ nuôi cấy, dễ giữ và nhân giống và chấp nhận

được nhiều loại vectơ

+ Nghiên cứu tỷ mỷ về cơ chế di truyền

+ Phân lập và tạo được nhiều chủng khác nhau

+ Thường gặp ở ruột người

+ Có một NST dạng vòng nằm ở vùng nhân

+ Quá trình phiên mã và dịch mã xảy ra đồng thời

(mRNA được sử dụng ngay để dịch mã mà không qua các bước
sửa đổi sau phiên mã vì gen của chúng không có intron). 61
 Tế bào chủ nhân sơ

- Ngoài E.Coli ra một số vi khuẩn khác cũng được sử dụng

Ví dụ Bacillus, Streptomyces...

- Nhưng tế bào chủ này có những hạn chế nhất định. Chúng đòi hỏi
những vectơ thích hợp nên đưa DNA tái tổ hợp vào chúng gặp
nhiều khó khăn

62
 Tế bào chủ nhân sơ
- Nhược điểm của việc sử dụng tế bào nhân sơ làm tế bào chủ là:

+ Vật liệu di truyền của chúng không có màng nhân bao bọc nên một số
gen ở sinh vật nhân chuẩn không thể biểu hiện được ở vi khuẩn E.coli
vì môi trường bình thường của chúng khác với môi trường bình thường
của gen ở SV nhân chuẩn

+ DNA tái tổ hợp không thể sản sinh ra protein đầy đủ chức năng như ở
SV nhân chuẩn

63
 Tế bào chủ nhân chuẩn
VSV nhân chuẩn bậc thấp như nấm men nấm mốc, tảo

Cho đến các sinh vật đa bào phức tạp như động vật, thực vật.

* Tế bào chủ nấm men: được sử dụng rộng rãi vì

+ Vi sinh vật nhân chuẩn đơn bào

+ Dễ nuôi cấy để thu sinh khối

+ Đặc điểm di truyền đã được nghiên cứu tỷ mỷ

+ Có khởi điểm promoter mạnh

+ Loài nấm men được sử dụng rộng rãi trong lên men bánh mỳ, lên
men rượu bia được coi là vi sinh vật an toàn không tạo ra độc tố.
64
 Tế bào chủ nhân chuẩn
* Tế bào chủ động vật

+ Tế bào động vật nuôi rất phức tạp

+ Nhưng trong điều kiện cần thiết cho sự biểu hiện ra các protein có
hoạt tính sinh học người ta vẫn sử dụng tế bào chủ động vật

* Tế bào chủ thực vật

65
 Đưa DNA vào tế bào
- Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ để nhân lên

- Có nhiều kỹ thuật để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ phụ
thuộc vào hệ thống vật chủ và vectơ

- Có những kỹ thuật đơn giản đến những kỹ thuật phức tạp

* Biến nạp

- Biến nạp các tế bào khả biến: tự nhiên, cảm ứng hóa học, biến
nạp bằng xung điện.

66
 Biến nạp các tế bào khả biến tự nhiên
- Có một số chủng giống vi sinh vật có khả năng thu nhận DNA
ngoại lai vào những thời điểm nhất định trong quá trình phát triển
của chúng ở trong một điều kiện nuôi cấy nhất định.

- Có thể điều khiển được và kiểm tra được. Giai đoạn phát triển đó
được gọi là khả biến.

- Để tạo điều kiện này thông thường người ta dùng phương pháp
điều khiển chế độ dinh dưỡng.

VD. Bacillus subtilis, Pseudomonas

67
Biến nạp tế bào bằng cảm ứng hóa học (xử
lý với CaCl2)
- Thực hiện điều này người ta ngâm tế bào vào dung dịch CaCl2 ở
nhiệt độ thấp tạo ra tế bào khả biến

- Thực hiện bằng cách trộn DNA plasmid với các tế bào rồi ủ trong
dung dịch calcium chlorid lạnh đóng đá 20 đến 30 phút

- Tạo sốc nhiệt ngắn khoảng 2 phút ở 42oC. ADN sẽ chui vào tế
bào.

- Điển hình là tế bào E.coli, Pseudomonas

68
69
 Biến nạp tế bào bằng xung điện
(electroporation)
- Biến nạp bằng sự trợ giúp của dòng điện

- Gây ra các biến dạng của màng tế bào, do đó tạo ra khả năng ngoại
lai của các tế bào vi sinh vật

- Do tác động của dòng điện nó sẽ tạo ra các lỗ nhỏ ở trên cấu trúc
màng sinh học, màng tế bào

70
71
 Ứng dụng của công nghệ ADN tái
tổ hợp
* DNA tái tổ hợp phát triển rất nhanh và nó được ứng dụng trong nhiều
công trình nghiên cứu

- Nhiều gen của người đã được chuyển vào vectơ thích hợp và đưa vào
vi khuẩn hoặc nấm men để tổng hợp lên các sản phẩm của gen

* Ví dụ:

- Insuline của người đã được tổng hợp bằng phương pháp DNA tái tổ
hợp để chữa các bệnh đái tháo đường

- Interferon cũng đã được sản xuất để chống khối u và virut

- Hormon sinh trưởng của bò cũng được sản xuất để tăng sản lượng
72
sữa
 2.3. Các phương pháp căn bản trong công
nghệ gen
2.3.1. Phương pháp PCR
2.3.2. Phương pháp điện di trên gel
2.3.3. Phương pháp xác định trình tự gen
2.3.4. Kỹ thuật lai DNA (Southern blot)

73
 2.3.1. Phương pháp PCR
2.3.1.1. Khái niệm

2.3.1.2. Nguyên lý

2.3.1.3. Sự sao chép của DNA

2.3.1.4. Các thành phần tham gia phản ứng

2.3.1.5. Các chu kỳ của phản ứng PCR

2.3.1.6. Thiết kế mồi oligonucleotid tối ưu cho phản ứng PCR

2.3.1.7. Ứng dụng của phản ứng PCR

74
 2.3.1.1. Khái niệm
- PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp - polymerase chain reaction)
- Là kỹ thuật tổng hợp DNA nhân tạo với tốc độ nhanh, độ chính
xác cao
- Được thực hiện bằng máy chu trình nhiệt (máy PCR)
- Máy PCR ngày càng được hoàn thiện cho phép thay đổi nhanh
chóng, chính xác nhiệt độ cho từng giai đoạn phản ứng nhân bản
DNA

75
 2.3.1.2. Nguyên lý
- Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên
tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể
+ Đoạn DNA mở xoắn thành 2 mạch đơn
+ Cần cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược)
+ Cần nguyên liệu và điều kiện môi trường thích hợp và enzyme
DNA polymerase
- Điểm khác là cần nhiệt độ 94oC để tháo xoắn thay cho dùng
enzyme helicase

76
2.3.1.3. Sự sao chép của DNA

77
 2.3.1.4. Các thành phần tham gia phản ứng

* DNA khuôn:

- DNA kép hoặc đơn.

+ Phân tử DNA có chứa đoạn gen cần nhân lên.

+ Nhiều khi không cần tách đoạn gen cần nhân lên việc này có thể do
đoạn mồi thực hiện

* Mồi (primer): Đoạn mồi là các oligonucleotid có độ dài 6- 30 nucleotid

+ Có trình tự bắt cặp bổ xung với trình tự 2 đầu mạch khuôn

+ Trình tự mồi xuôi mồi ngược không tự bổ sung cho nhau

+ Thời gian gắn mồi khoảng 30 đến 60 giây 78

 2.3.1.4. Các thành phần tham gia phản ứng

* DNA polymerase

- Là enzyme xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotide A, T, G, C vào
mạch DNA mới đang được tổng hợp

- Ngày nay người ta dùng nhiều DNA polymerase nhưng chủ yếu là Taq
DNA polymerase (được tách từ vi khuẩn suối nước nóng)

++ Không bi mất hoạt tính ở nhiệt độ DNA bị biến tính (92 -

940C)

++ Enzyme này hoạt tính ở nhiệt độ cao, làm cho phản ứng PCR
xảy ra nhanh, chính xác và đặc hiệu
79
 2.3.1.4. Các thành phần tham gia phản ứng
* Các deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP)
Gồm 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP là nguyên liệu tạo ra mạch
đơn mới
* Dung dịch đệm (buffer)

80
 2.3.1.5. Các chu kỳ của phản ứng PCR
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ gồm 3 bước chính

Bước 1: Biến tính (denaturing)

- Xử lý nhiệt để tách ADN mạch kép thành mạch đơn dùng làm
khuôn để tổng hợp mạch mới

- Nhiệt độ thường dùng là 94 - 95oC trong thời gian 2 - 5 phút

Bước 2: Gắn mồi (annealing)

- Hạ nhiệt độ xuống 30 - 65oC trong khoảng 20 giây đến 2 phút.

Các đoạn mồi sẽ bắt cặp với các mạch khuôn theo nguyên tắc bổ
sung

- Đây là giai đoạn quan trọng nhiệt độ gắn mồi phải đảm bảo để
81

khả năng gắn tốt nhất, tranh hiện tượng gắn không đặc hiệu
 2.3.1.5. Các chu kỳ của phản ứng PCR
Bước 3: Kéo dài (tổng hợp - extending)
- Các dNTP được lắp ráp để tạo thành mạch đơn ADN mới bổ sung
với ADN khuôn bắt đầu từ mồi
- Nhiệt độ 68 - 72oC
- Thời gian kéo dài phụ thuộc vào chiều dài đoạn cần nhân lên thời
gian
+ Khoảng 20 giây đối với đoạn ADN khuôn có chiều dài
< 500 nucleotid
+ Khoảng 40 giây đối với đoạn ADN khuôn < 1200
nucleotide
+ thường thì thời gian kéo dài 2 - 5 phút 82
 2.3.1.5. Các chu kỳ của phản ứng PCR
- Mỗi chu kỳ có 3 bước trên, lặp lại chu kỳ khoảng 25 đến 30 lần tùy
thuộc vào mục đích yêu cầu nghiên cứu

- Tuy nhiên không nên kéo dài quá 30 chu kỳ vì khả năng sai sót sẽ
tăng lên

- Số lượng bản sao sau n chu kỳ là = 2n

- Cuối chu kỳ một nhiệt độ lại được nâng lên 94oC nhưng lần này chỉ
để trong vòng 20 giây.

83
84
85
2.3.1.5. Các chu kỳ của phản ứng PCR

86
 2.3.1.6. Thiết kế mồi oligonucleotid tối
ưu cho phản ứng PCR
Trình tự mồi là chìa khóa thành công hay thất bại của phản ứng PCR

- Mồi thiết kế đúng chuẩn thì phản ứng PCR cho kết quả tốt

- Mồi không thiết kế đúng thì cho phản ứng PCR sẽ thất bại

+ Không diễn ra sự nhân bản nào

+ Do đoạn khác hoặc nhiều đoạn được nhân lên

- Độ dài đoạn cần nhân lên không nên >3kb. Lý tưởng là <1kb

- Đoạn càng dài thì hiệu qủa nhân lên càng thấp và càng khó khăn hơn
để đạt kết quả tốt 87
 2.3.1.6. Thiết kế mồi oligonucleotid tối ưu
cho phản ứng PCR
- Độ dài đoạn mồi quan trọng (nếu đoạn mồi quá ngắn thì nó dễ bắt
cặp với đoạn không mong muốn và cho sản phẩm nhân bản không
mong muốn)
- Độ dài đoạn mồi quá dài thì nó sẽ ảnh hưởng đến tốc độ mà nó bắt
cặp với khuôn ADN, đoạn mồi dài sẽ bắt cặp với tốc độ chậm hơn
- Đoạn mồi dài 30 nucleotit rất ít khi được sử dụng

88
 2.3.1.7. Ứng dụng của phản ứng PCR
- Tách nhanh chóng chính xác từng gen hoặc từng đoạn DNA riêng
biệt

- Là kỹ thuật nền cho các nghiên cứu di truyền phân tử như xác định
trình tự gen

- Chẩn đoán nhanh, nhạy các bệnh di truyền, bệnh nhiễm trùng (virus,
vi khuẩn, nấm….)

+ Ứng dụng thành công để chẩn đoán sớm mầm bệnh trên người,
vật nuôi và cây trồng

+ Xây dựng được quy trình PCR để xét nghiệm nhanh vi sinh vật
gây hư hỏng trong thực phẩm.
89

- Xác định nguồn gốc hài cốt, quan hệ họ hàng và huyết thống
 4.2.1.7. Điện di trên gel
- Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong phòng thí nghiệm để phân tích các đại
phân tử tích điện
- Thường sử dụng phương pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử DNA
nguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế, DNA của sản phẩm PCR.
- Nucleic acid nói chung là phân tử tích điện âm, chúng có thể di chuyển qua
bảng gel từ cực âm sang cực dương.
- Trên cùng một bảng gel có cùng một dòng điện những phân tử DNA khác
nhau về trọng lượng nên khác nhau về điện tích và chạy được những quãng
đường khác nhau sau một thời gian như nhau.
- Có hai loại gel được sử dụng phổ biến là agarose và polyacryamid. Gel
polyacryamid thường được dùng để phân tách các phân tử nucleic acid có
kích thước nhỏ hơn.
Bảng . Đặc tính phân tách của các gel
agarose và polyacryamid

Loại gel Phạm vi phân tách (cặp

base nitơ)
0,3% agarose 50 000 đến 1 000
0.7% agarose 20000 đến 300
1.4 % agarose 6000 đến 300
4% acryamid 1000 đến 100
10% acryamid 500 đến 25
20% acryamid 50 đến 1
 4.2.1.7. Điện di trên gel
- Trong điện di người ta hay sử dụng thang DNA chuẩn và
chúng sẽ được chạy cùng với các mẫu nghiên cứu qua đó
có thể so sánh DNA của mẫu cần phân tích với DNA
chuẩn để biết trọng lượng phân tử, hoặc tách ly được DNA
khác nhau.
- Hệ thống điện di bao gồm nguồn điện, buồng điện di,
khuôn để gel và hệ thống soi chụp ảnh.
Hệ thống điện di
 Các bước tiến hành như sau
- Điện di trong khoảng thời gian nhất định với điện thế nhất định
- Nhuộm ethidium bromid (EtBr) và chụp hình ảnh dưới ánh sáng
UV để xem kết quả.
- Chú ý: ethidium bromid (EtBr) là một thuốc nhuộm huỳnh quang
có thể nhận biết cả DNA sợi đơn và sợi kép. DNA nhuộm EtBr
được nhận biết bằng tia cực tím. EtBr là chất gây đột biến mạnh,
cần mang gang tay khi thao tác với dung dịch thuốc nhuộm này.
- Ngoài việc sử dụng để phân tích nucleic acid, điện di trên gel
polyacryamid (PAGE) còn được sử dụng rộng rãi để phân tích
các protein.