CHUYÊN ĐỀ:

MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA SINH HỌC PHÂN TỬ

1
 MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

Hiện nay, di truyền học đã, đang và tiếp tục được nghiên cứu và ứng
dụng vào rất nhiều lĩnh vực của khoa học và thực tiễn. Trong các ứng dụng
của di truyền học, theo tôi, ứng dụng của Sinh học phân tử là rất đa dạng,
phong phú và cũng có nhiều mới mẻ, hiện đại. Việc lựa chọn và biên tập
những nội dung cần thiết, những ứng dụng quan trọng, có tính mới và cập
nhật, vừa là cập nhật với những nghiên cứu mới, vừa tiếp cận với yêu cầu
của các đề thi học sinh giỏi các cấp, sẽ giúp học sinh có một cái nhìn tổng
quát hơn, tiếp cận sâu hơn với kiến thức về di truyền phân tử nói riêng và
di truyền học nói chung. Với lý do đó, tôi viết chuyên đề: “ Một số ứng dụng
của Sinh học phân tử” nhằm hướng học sinh tiếp cận những ứng dụng
quan trọng đã được nghiên cứu, đang nghiên cứu và tiếp tục nghiên cứu
trên cơ sở ứng dụng những hiểu biết về Sinh học phân tử.

2. Mục đích của đề tài

Đề tài đã đề cập đến những ứng dụng quan trọng đã, đang và tiếp tục
được nghiên cứu của di truyền học phân tử. Vì vậy, tôi viết đề tài này trước
hết là để giúp mình thống kê một cách đầy đủ, logic với nội dung này trong
giảng dạy; sau là để chia sẻ với học sinh không chỉ kiến thức về ứng dụng di
truyền học phân tử mà cả hướng nghiên cứu, tìm tòi và phát triển nội dung
bài học.

2
 PHẦN NỘI DUNG
I. LAI PHÂN TỬ

1. Lai phân tử là gì?

Khi một phân tử ADN mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá
“nhiệt độ nóng chảy” (Tm) thì hai mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các
liên kết hidro nối liền hai mạch.

Nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột thì sự bắt cặp sẽ không xảy ra.
Lúc đó phân tử ADN sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn dưới một
cấu hình vô trật tự.

Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được làm giảm từ từ
cộng với điều kiện thích hợp, chúng sẽ bắt cặp trở lại. Hiện tượng này được
gọi là lai phân tử.

Hai mạch ADN có nguồn gốc khác nhau nhưng có trình tự nucleotit bổ
trợ có thể liên kết với nhau trong điều kiện phù hợp (về nhiệt độ, độ pH,
nồng độ muối trong đệm) để tạo nên một phân tử ADN mới. Hiện tượng liên
kết như vậy cũng có thể xảy ra giữa hai mạch ADN với nhau, hoặc giữa hai
mạch ARN hoặc giữa ADN và ARN. Phân tử axit nucleic sợi kép mới hình
thành được gọi là phân tử lai và quá trình kết cặp giữa các bazơ thuộc hai
mạch đơn axit nucleic có nguồn gốc khác nhau theo nguyên tắc bổ sung như
vậy được gọi là quá trình lai phân tử.

2. Các phương pháp lai phân tử và ứng dụng

2.1. Phương pháp Southern blot

3
 Phương pháp Southern blot cho phép nghiên cứu ADN của bộ gen, kiểm
tra kết quả chuyển gen hoặc kiểm tra sự có mặt của một gen nào đó trong
bộ gen của tế bào.

Quy trình: - Tách ADN bộ gen của tế bào.

- Sử dụng enzyme cắt giới hạn để cắt phân tử ADN thành những
đoạn nhỏ, điện di trên gel agarose để tách những đoạn có kích thước khác
nhau.

- Gây biến tính ADN trên gel bằng dung dịch NaOH-0,5M, sau đó,
chuyển ADN từ gel sang màng lai. Trong quá trình chuyển, vị trí của ADN
phải được giữ nguyên.

- ADN cố định trên màng được lai với mẫu dò có đánh dấu phóng
xạ, ở nhiệt độ 65°C và thời gian lai khoảng 3- 8 giờ. Sau quá trình lai người
ta rửa màng lai để loại bỏ những mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt với
ADN cố định trên màng lai.

- Dùng kĩ thuật phóng xạ tự ghi để định vị các phân tử lai. Trong kĩ

thuật này, người ta đặt một phim nhạy cảm với tia xạ áp sát vào màng lai.
Các phân tử lai có đánh dấu phóng xạ sẽ tác động lên phim và kết quả được
thể hiện qua các chấm đen trên phim.

* Các ứng dụng quan trọng của Sourthern blot:

- Lập bản đồ giới hạn của một gen.

- Phát hiện các đa dạng trình tự của cùng một gen ở các chủng hay các cá
thể khác nhau qua sự so sánh bản đồ giới hạn của chúng.

- Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một
gen vì chúng làm thay đổi bản đồ giới hạn.

4
2.2. Phương pháp Northern blot

Phương pháp lai Northern blot là phương pháp lai ARN của tế bào với
mẫu dò ADN. Về nguyên tắc giống như lai Southern blot, được tiến hành
như sau:

ARN (đã được làm biến tính) sẽ được phân tích theo kích thước nhờ điện di
trên gel agarose có chứa chất làm biến tính. Các chất làm biến tính có tác
dụng ngăn cản sự hình thành cấu trúc bậc hai của ARN sau khi đã biến tính.
Và do đó, không cản trở sự di chuyển cũng như sự tách của các ARN trên gel.
Sau đó, ARN được chuyển lên màng lai. Những ARN cố định trên màng lai
được đem lai với mẫu dò ADN có đánh dấu phóng xạ để tạo phân tử lai
ARN-ADN. Các phân tử lai được phát hiện nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi.

* Ứng dụng:

- Phát hiện sự có mặt mARN trong các mẫu khác nhau

- Phân tích sự biểu hiện của gen giữa hai mẫu

- Phát hiện virus ARN

2.3. Lai tại chỗ

Lai tại chỗ là phương pháp lai phân tử, trong đó, trình tự axit nucleic cần
tìm nằm ngay trong tế bào hay trong mô.

Lai tại chỗ cho phép nghiên cứu axit nucleic mà không cần qua giai đoạn
tách chiết chúng ra khỏi mô, tế bào. Các ứng dụng của kiểu lai này rất đa
dạng đi từ kĩ thuật định vị gen trên nhiễm sắc thể, phát hiện dòng vi khuẩn
tái tổ hợp trong phương pháp tạo dòng đến việc nghiên cứu một mARN
chuyên biệt trong tế bào và mô. Phương pháp này ít tốn kém hơn là lai
Southern blot, mẫu dò được đánh dấu bằng huỳnh quang thay cho mẫu dò
đánh dấu phóng xạ. Tùy từng loại tế bào và mô có thể thực hiện các phương
5
pháp lai tại chỗ khác nhau.
* Ứng dụng:

- Lai trên tế bào và mô: thường được sử dụng để phát hiện các mARN.
Các loại mARN hoạt động ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình phát
triển tế bào và cơ thể. Lai trên tế bào và mô nhằm nghiên cứu giai đoạn hoạt
động của mARN, từ đó, tìm hiểu hoạt động của một gen, mối liên quan giữa
phiên mã và giải mã, định vị các gen cần nghiên cứu trên nhiễm sắc thể.

- Lai trên NST: Phương pháp này cung cấp thông tin chính xác về vị trí và
sự phân bố của một trình tự ADN cần tìm trên nhiễm sắc thể nhờ một mẫu
dò chuyên biệt.

- Lai trên khuẩn lạc: Phương pháp này được sử dụng để phát hiện dòng
vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp cần tìm trong một ngân hàng gen. Ngân
hàng gen được trải trên mặt thạch của hộp petri. Sau khi các khuẩn lạc đạt
kích thước nhất định, người ta thu lấy dấu ấn của chúng bằng cách áp một
màng lai trên mặt thạch. Mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trên
màng lai. Sau đó xử lí màng lai bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn và làm
biến tính ADN. Kết quả phóng xạ tự ghi của dấu ấn cho phép xác định dòng
vi khuẩn cần tìm trên hộp pectri ban đầu. Dòng này sẽ được thu nhận và
phân tích.

II. PCR

1. PCR là gì?

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, là Phản ứng
chuỗi trùng hợp hoặc "phản ứng khuếch đại gen". PCR là một kỹ thuật phổ
biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một
đoạn ADN mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men.

6
 Trong thực tiễn, PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã
xác định được một phần; hoặc khuếch đại 1 đoạn ADN ở 1 vùng bất kì trong
gennom khi trình tự nu ở 2 đầu đoạn ADN đó đã biết. Đó có thể là một gen
đơn, hay một phần của gen. Trái với sinh vật sống, quy trình PCR có thể
copy một mảnh ADN ngắn, có thể lên đến 10kb. Một vài phương pháp có thể
copy một mảnh kích thuớc lên đến 40kb ít hơn nhiều so với nhiễm sắc thể
ADN trong tế bào eukaryote – ví dụ như tế bào người chứa hơn 3 tỉ cặp
base.
PCR cần rất nhiều thành phần, gồm: - ADN mẫu chứa mảnh DNA cần
khuếch đại.
- Cặp mồi (primer), để xác định điểm bắt
đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại.
- ADN-polymerase xúc tác cho việc nhân
lên của ADN.
- Nucleotides (ví dụ dNTP) là nguyên liệu
cho ADN-polymerase để xây dựng ADN mới.
- Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa
học cho ADN-polymerase.
Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt. Đây là máy đun nóng
và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng.
Đoạn mồi: Là đoạn ADN cần khuếch đại được xác định bằng mồi chọn
lọc. Mồi là những đoạn ngắn, sợi ADN nhân tạo – không quá 50 (thường 18-
25) nucleotides phù hợp một cách chính xác ở điểm bắt đầu và kết thúc của
ADN cần khuếch đại. Nó gắn chặt với ADN mẫu ở những điểm khởi đầu và
kết thúc, nơi mà ADN-polymerase nối và bắt đầu quá trình tổng hợp của sợi
ADN mới. Chiều dài tốt nhất của đoạn mồi là từ 20-40 nucleotide với nhiệt
độ biến tính khoảng từ 60 – 75 °C.
2. Quy trình PCR

7
 Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 2-3 giai đoạn biến
đổi nhiệt độ (thường là 3). Nhiệt độ và thời gian thực hiện của mỗi chu kỳ
phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Những yếu tố này gồm enzyme tổng hợp ADN,
nồng độ ion hóa trị hai, dNTPs dùng trong phản ứng, và nhiệt độ nóng chảy
(Tm) của mồi.

- Giai đoạn 1- Biến tính: Nhiệt độ tăng lên 92-96 °C để tách hai sợi ADN ra.
Trước chu kỳ 1, ADN thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm
bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn.

- Giai đoạn 2- Gắn mồi: Sau khi 2 sợi ADN tách ra, nhiệt độ được hạ thấp
xuống để mồi có thể gắn vào sợi ADN đơn. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc
vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50 °C (45-55 °C). Sử
dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn
hoàn toàn vào ADN mẫu, hay gắn một cách tùy tiện.

- Giai đoạn 3- Kéo dài: Hỗn hợp ADN và mồi được ủ với enzim Taq
polymerase và 4 loại dNTP. Enzim bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo
sợi ADN. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc ADN-polymerase. Thời gian của bước
này phụ thuộc vào cả ADN-polymerase và chiều dài mạch ADN cần khuếch
đại.

8
 Sản phẩm PCR có thể được nhận biết bằng kích thước của chúng qua việc
sử dụng điện di trên gel agarose. Kết quả là các đoạn ADN nhỏ hơn sẽ di
chuyển nhanh hơn các đoạn lớn qua gel từ cực âm đến cực dương. Kích
thước của sản phẩm PCR có thể được xác định bằng việc so sánh với thang
ADN, thang này có chứa các ADN đã biết trước kích thước, cũng nằm trong
gel.
3. Tối ưu hoá PCR
Do PCR rất nhạy, nên phải tránh nhiễm các DNA khác có trong phòng thí
nghiệm (vi khuẩn, virus, ADN,...). Vì vậy các mẫu ADN, hỗn hợp phản ứng và
quy trình ADN, phản ứng phân tích sản phẩm, nên được thực hiện trong
một khu vực riêng biệt. Ở giai đoạn chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, phải chuẩn
bị phòng riêng biệt với đèn UV. Phải sử dụng găng tay sạch cho mỗi bước
PCR cũng như thay thế các pipet. Thuốc thử dùng trong PCR phải được
chuẩn bị riêng biệt và chỉ được dùng cho mục đích này. Các mẫu phải được

9
giữ riêng biệt với các mẫu ADN khác. Phản ứng có kiểm soát (kiểm soát bên
trong), ngoại trừ ADN khuôn mẫu, phải luôn được thực hiện, để kiểm tra sự
nhiễm bẩn.
4. Những ứng dụng của PCR
– Xác định các đoạn trình tự cần nghiên cứu
– Phát hiện đột biến
– Nghiên cứu quá trình tiến hoá phân tử
– Phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm
– Chọn giống vật nuôi, cây trồng
– Lựa chọn các cặp cha mẹ thuần chủng trong thời gian ngắn
– Xác định các loài mới, các loài đặc hữu bằng phưng pháp di truyền phân
tử
– Y học – Khoa học hình sự.
– Chuẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ vi khuẩn, nấm, virus
– Chuẩn đoán sớm các bệnh gây ra do ung thư, các bệnh di truyền
– Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm
– Là kỹ thuật nền cho các kỹ thuật khác như: RAPD, SSR…

4.1. Vân tay di truyền (Finger print)

Vân tay di truyền là một kỹ thuật pháp y sử dụng để xác định một người
bằng cách so sánh ADN của người đó với mẫu đã có, ví dụ như, mẫu máu
thu được từ hiện trường vụ án có thể được so sánh di truyền với mẫu máu
của người tình nghi. Có thể chỉ cần một lượng nhỏ ADN thu từ máu, tinh
dịch, nước bọt, tóc... Về lý thuyết thì chỉ cần một mạch ADN đơn là đủ.
ADN của tất cả mọi sinh vật đều cơ bản giống nhau. Sự khác nhau duy
nhất giữa các cá thể trong cùng một loài là trình tự các cặp base. Có hàng tỉ
cặp base trong ADN của mỗi cá nhân, do đó trình tự base ở mọi người là
khác nhau.

10
 Mọi cá thể có thể được nhận dạng dựa trên trình tự các cặp base của họ.
Tuy nhiên, do có hàng tỷ cặp base nên công việc sẽ vô cùng khó khăn. Thay
vào đó các nhà khoa học có thể sử dụng một phương pháp ngắn hơn, đơn
giản hơn nhiều dựa vào các trình tự lặp lại trong ADN. Trong kỹ thuật nhận
diện ADN, độ dài của nhiều đoạn ADN lặp lại, như các đoạn trình tự vi vệ
tinh (microsatellite) và vệ tinh nhỏ (minisatellite), được so sánh giữa các cá
nhân có liên quan.
Các trình tự lặp lại không biểu diễn “dấu vân tay” của một cá thể nhưng
chúng có thể khẳng định được rằng liệu hai mẫu ADN là từ một người, từ
hai người có liên quan huyết thống hay từ hai người không có quan hệ gì.
Các nhà khoa học sử dụng một số lượng nhỏ các trình tự ADN có sự biến đổi
giữa các cá thể để phân tích những khả năng liên hệ có thể có.
4.2. Kiểm tra huyết thống
Mặc dù các "dấu vân tay" là duy nhất (trừ cặp song sinh giống hệt nhau),
mối quan hệ di truyền, ví dụ, cha mẹ và con hoặc anh chị em ruột, có thể
được xác định từ hai hoặc nhiều dấu vân tay di truyền, có thể được sử dụng
để thử nghiệm quan hệ cha con. Một biến thể của kỹ thuật này cũng có thể
được sử dụng để xác định các mối quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật.
4.3. Chẩn đoán bệnh di truyền
Phát hiện các bệnh di truyền trong một gen nhất định là một quá trình
lâu dài và khó khăn, có thể được rút ngắn đáng kể bằng cách sử dụng
phương pháp PCR. Mỗi gen trong câu hỏi có thể dễ dàng được khuếch đại
qua PCR bằng cách sử dụng các loại sơn lót thích hợp và sau đó trình tự để
phát hiện đột biến.
Bệnh virus, cũng có thể được phát hiện bằng phương pháp PCR thông
qua khuếch đại của ADN của virus. Phân tích này là có thể ngay sau khi
nhiễm trùng, có thể từ vài ngày đến vài tháng trước khi các triệu chứng

11
thực tế xảy ra. Chẩn đoán sớm như vậy cho các bác sĩ dẫn quan trọng trong
điều trị.
4.4. Tách dòng gene
PCR thường được sử dụng để khuếch đại gen, mà sau đó có thể được
chèn vào một vector. ADN sau đó có thể được chuyển vào một sinh vật khác,
nơi gen và sản phẩm của nó có thể được nghiên cứu hoặc để sản xuất hàng
loạt protein hữu ích nào đó.
Cần lưu ý là, khác với PCR thông thường (tạo dòng gen chưa biết cấu
trúc), ở đây thường cô lập gen số lượng lớn ở dạng tinh khiết để nghiên cứu
cấu trúc trước khi tiến hành PCR.
4.5. Gây đột biến định hướng
Được áp dụng để xây dựng phân tử ADN tái tổ hợp, đưa vào hoặc bỏ đi
hoặc thay thế các nucleotit trong 1 đoạn ADN. Các nucleotit cần gây đột
biến được thiết kế nằm trong trình tự của mồi.
4.6. Phân tích mẫu ADN cổ
Sử dụng PCR, nó sẽ trở thành có thể phân tích ADN đó là hàng ngàn năm
tuổi. Kỹ thuật PCR đã được sử dụng thành công trên động vật, chẳng hạn
như một voi ma mút bốn mươi ngàn năm tuổi, và cũng trên ADN của con
người, trong các ứng dụng khác nhau, từ việc phân tích các xác ướp Ai Cập
đến việc xác định một Sa hoàng Nga.
III. SẢN XUẤT VACXIN TÁI TỔ HỢP

Những vacxin kinh điển được sản xuất dựa trên vi khuẩn, virut đã bị làm
chết hoặc độc lực của chúng đã bị suy giảm để không còn khả năng gây
bệnh. Tuy nhiên, những loại vacxin kinh điển này vẫn còn 1 số ít tác hại
không mong muốn cho người sử dụng. Vì vậy, vacxin thế hệ mới sử dụng
công nghệ ADN tái tổ hợp có hoạt tính, tính đặc hiệu cao và đảm bảo an
toàn hơn.

12
 Quy trình: Gắn gen mã cho kháng nguyên của vi khuẩn hoặc virut gây
bệnh vào vector biểu hiện có promoter mạnh rồi đưa vào tế bào nhận. Thu
nhận và tinh sạch kháng nguyên từ những tế bào nhận này để sản xuất
vacxin.

Hoặc: Gây đột biến hoặc loại bỏ các gen quy định độc tính của chủng vi
khuẩn hoặc virut gây bệnh làm chúng mất khả năng gây bệnh. Sau đó sử
dụng chúng để sản xuất vacxin.

Phân loại

Căn cứ vào nguồn kháng nguyên nhân lên được hay không nhân lên
trong cơ thể động vật, người ta chia làm 2 nhóm:

Nhóm 1: Vacxin có kháng nguyên sống được nhân lên, gồm:

- Vacxin tái tổ hợp có vector dẫn truyền

- Vacxin axit nucleic (vacxin ADN)

- Vacxin xóa gen độc

Nhóm 2: Vacxin có kháng nguyên không nhân lên, gồm: Vacxin chứa kháng
nguyên là protein sản xuất bằng kĩ thuật gen

* Vai trò của công nghệ ADN tái tổ hợp trong nhận dạng và sản xuất
vacxin:

1. Nhận dạng và tạo dòng các kháng nguyên có tiềm năng vacxin

Nhiều tác nhân gây bệnh gần như không có khả năng nuôi cấy bên ngoài
vật chủ tự nhiên của chúng và điều này đã gây cản trở cho các cách tiếp cận
truyền thống để phát triển liệu pháp vacxin. Ví dụ: virus viêm gan B (HBV),
tác nhân gây bệnh giang mai ở người (Treponema pallidum) và vi khuẩn gây
bệnh phong (Mycobacterium leprae) không thể sinh trưởng trong điều kiện

13
in vitro. Bởi vậy, người ta không thể tạo ra các vaccine sống nhược độc hoặc
các vacxin bất hoạt bằng cách nuôi cấy các tác nhân này. Công nghệ ADN tái
tổ hợp cho phép chuyển thông tin di truyền từ những sinh vật này vào
những vật chủ “dễ nuôi” hơn như là E. coli, nấm men hoặc tế bào động vật
có vú.

Không phải tất cả các gen kháng nguyên đều dễ nhận dạng, tạo dòng và
biểu hiện như gen kháng nguyên bề mặt của viêm gan. Trình tự nguyên vẹn
của genome HBV có kích thước nhỏ hơn 10 kb. Bởi vậy, tương đối đơn giản
khi thiết lập khung đọc mở để biểu hiện. Tuy nhiên, ở trường hợp bệnh sốt
rét thì lại khác. Genome của ký sinh trùng sốt rét lớn hơn genome của HBV
hàng ngàn lần, vì thế người ta đã gặp rất nhiều khó khăn trong việc thu thập
các thông tin về trình tự gen thích hợp và sản phẩm của nó để tạo ra bảo vệ
miễn dịch, nên người ta cần phải ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp để sản
xuất vacxin. Điểm khởi đầu của công nghệ ADN tái tổ hợp là xây dựng thư
viện ADN của cơ thể được nghiên cứu trong E. coli. Thư viện cADN hoặc
genomic ADN có thể cung cấp các phương thức cơ bản để nhận dạng và
phân lập các gen quan tâm.

2. Sản xuất vacxin

Quy trình sản xuất vacxin bằng công nghệ ADN tái tổ hợp:

- Lựa chọn kháng nguyên đích.

- Phân tích và xác định gen đích.

- Nhân dòng gen.

- Biểu hiện gen trong tế bào chủ.

- Nuôi cấy và thu nhận protein.

- Kiểm tra chất lượng và tinh sạch protein.

14
- Sản xuất chế phẩm.

- Kiểm tra sản phẩm.

* Ưu diểm của vacxin tái tổ hợp:

- Năng suất cao.

- An toàn vì không sử dụng trực tiếp virut gây bệnh.

- Giá thành hạ vì không phải nuôi virut.

* Các vacxin sản xuất bằng công nghệ ADN tái tổ hợp:

- Vacxin chứa kháng nguyên sản xuất bằng ADN tái tổ hợp.

- Vacxin vectơ.

- Vacxin ADN.

- Vacxin dựa trên cơ thể chuyển gen. (VD: vacxin thực phẩm)

* Vacxin ADN:

Một hướng trong sản xuất vacxin ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp là các
vacxin ADN (miễn dịch di truyền). Các plasmid mang các gen đặc hiệu cho
một hoặc nhiều protein kháng nguyên có thể được dùng để tạo miễn dịch
(chủng ngừa). Các plasmid đó được tiêm (thường vào cơ) đưa gen trực tiếp
vào trong một số tế bào và được hấp thu bởi các tế bào lân cận nơi kim tiêm
được đưa vào. Ngoài ra, plasmid cũng có thể được đưa vào bằng súng bắn
gen (các viên đạn vàng được bọc ADN của plasmid) bằng cách đẩy các
plasmid vào trong các tế bào gần bề mặt cơ thể, thường là da hoặc màng
nhầy. Khi vào bên trong tế bào, một vài plasmid tái tổ hợp sẽ đi vào nhân và
do gen được điều hòa bởi một promoter mạnh của eukaryote, các tế bào sẽ
tổng hợp các kháng nguyên được mã hóa bởi plasmid.

15
IV. SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

1. Sản xuất kháng sinh

Nguồn kháng sinh tự nhiên chủ yếu được tìm thấy ở vi sinh vật. Quá
trình chọn lọc môi trường nuôi cấy cũng như sàng lọc các chủng vi sinh vật
cho kháng sinh đặc hiệu và có năng suất cao rất tốn công sức và kinh phí. Kĩ
thuật tách dòng ADN cho phép tạo ra toàn bộ các dòng gồm những gen
tham gia vào quá trình tổng hợp kháng sinh. Nhờ vậy, có thể kiểm soát và
điều chỉnh một cách chủ động toàn bộ quy trình sản xuất kháng sinh ở quy
mô công nghiệp.

2. Sản xuất hoocmon

Kĩ thuật gen đã phân lập cADN của những gen mã cho các hoocmon đó và
đưa chúng vào vector có promoter mạnh. Vector tái tổ hợp được biến nạp
vào tế bào nhận; từ đó các protein tương ứng được tách chiết và tinh sạch.

2.1. Hormone sinh trưởng người (human growth hormone-HGH)

Hormone sinh trưởng người là protein chứa khoảng 191 axit amin, thiếu
nó cơ thể người sẽ bị lùn. Trước đây hormone phát triển được tách từ
tuyến yên của người chết. Mỗi tử thi cho khoảng 4-6 mg HGH và muốn chữa
khỏi cho một người lùn phải cần lượng HGH thu được từ 100-150 tử thi.
Điều này cho thấy một trở ngại rất lớn khi chữa trị chứng lùn cho trẻ em.
Bằng công nghệ ADN tái tổ hợp, người ta có thể thu nhận một lượng lớn
HGH từ vi khuẩn E. coli đã tái tổ hợp (1 lít dịch lên men của E. coli thu được
một lượng HGH tương đương với lượng thu được từ 60 tử thi). Hormone
sinh trưởng người tái tổ hợp khác với hormone sinh trưởng người bình
thường một axit amin đó là do E. Coli không có khả năng loại bỏ gốc
methionine khởi đầu, thông thường amino acid này chỉ bị loại sau khi dịch

16
mã trong tế bào người. Hormone sinh trưởng người là một trong những
protein được sản xuất bằng công nghệ ADN tái tổ hợp sớm nhất.

2.2. Somatostatin

Somatostatin là loại hormone đặc biệt, thường được tổng hợp trong não
động vật và người với một hàm lượng vô cùng thấp. Somatostatin có vai trò
điều hòa hormone sinh trưởng và insulin đi vào máu, kiểm tra sự tổng hợp
hai loại hormone này.

Quy trình sản xuất loại sản phẩm sinh học đặc biệt quý này cũng bao gồm
các bước chủ yếu sau đây:

- Phân lập gen mã hóa somatostatin hoặc tổng hợp trong ống nghiệm.

- Tạo dòng gen somatostain bằng cách gắn gen này vào plasmid vector
để chuyển gen vào E. coli.

Mỗi mẻ 7,5 l vi khuẩn E. coli nuôi cấy sẽ cho ra 5 mg somatostatin

nguyên chất. Khối lượng hormone này trước đây muốn có phải tiến hành cả
năm trên nguyên liệu lấy từ nửa triệu não cừu.

3. Sản xuất kháng thể đơn dòng

Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody – mAb ) là kháng thể được
tạo thành từ những tế bào lympho B có nguồn gốc từ một dòng tế bào
lympho B.

Các kháng thể đơn dòng chỉ nhận biết một epitope trên một kháng
nguyên cho sẵn. Theo định nghĩa, tất cả các kháng thể đơn dòng cùng một
dòng thì giống hệt nhau và được sản xuất bởi cùng một dòng tương bào.

17
Kháng thể đơn dòng chỉ liên kết với Kháng thể đa dòng, mỗi kháng thể
1 epitop đặc hiệu liên kết với 1 epitop khác nhau

Kháng thể đơn dòng có rất nhiều ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị
bệnh, đặc biệt là điều trị ung thư. Có thể phân biệt tế bào ung thư với tế bào
lành nhờ kháng nguyên trên bề mặt tế bào ung thư. Kháng thể đơn dòng
đặc hiệu với kháng nguyên được sản xuất nhờ công nghệ ADN tái tổ hợp.
Kháng thể này được ghép nối với độc tố hoặc với đồng vị phóng xạ rồi đưa
vào cơ thể. Nhờ kháng thể chỉ liên kết đặc hiệu với kháng nguyên trên bề
mặt tế bào ung thư nên chỉ những tế bào này bị tiêu diệt.

3.1. Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng công nghệ ADN tái tổ hợp biểu hiện
trên Phage

* Cơ chế:

Được đề ra bởi George P. Smith vào giữa thập niên 1980, đoạn gen mã
hóa cho một protein ngoại lai được chèn vào thực khuẩn thể
(bacteriophage) M13, hoặc virus để thâm nhập vào tế bào E.coli. Trong tế
bào E.coli, protein ngoại lai sẽ được biểu hiện lên trên bề mặt phage, tạo
điều kiện cho việc sàng lọc. Phương pháp sàng lọc dựa trên mối liên hệ
được thiết kế giữa gen mã hóa và protein biểu hiện. Năm 1990, McCafferty

18
và cộng sự đã chứng minh kỹ thuật này có thể áp dụng để biểu hiện các
đoạn kháng thể trên bề mặt phage. Từ đó, khái niệm “thư viện kháng thể”
được ra đời.

* Thư viện kháng thể:

Các gen mã hóa chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của kháng thể được khuếch đại
trong tế bào sản xuất kháng thể, hoặc trong phòng thí nghiệm. Sau đó,
chúng được kết hợp với nhau và tạo dòng trong các phage đặc biệt. Vì các
chuỗi nặng và chuỗi nhẹ kết hợp ngẫu nhiên, nên mỗi phage chỉ có khả năng
biểu hiện một kháng thể duy nhất với vùng gắn đặc hiệu cho một loại kháng
nguyên. Kết quả là một “thư viện kháng thể” được tạo thành.

* Chọn lọc kháng thể:

Quy tắc của quá trình chọn lọc kháng thể là dựa vào việc gắn đặc hiệu
của kháng thể với kháng nguyên tương ứng. Và một trong những phương
pháp chọn lọc đơn giản nhất chính là ELISA. Thư viện kháng thể sẽ được ủ
với kháng nguyên đích cố định sẵn trong các giếng ELISA. Những phage
mang kháng thể mong muốn gắn đặc hiệu với kháng nguyên đích sẽ được
giữ lại, trong khi các phage khác sẽ bị loại bỏ qua giai đoạn rửa trôi. Tiếp
theo, các phage kháng thể mong muốn được tách khỏi kháng nguyên, và
thâm nhập vào tế bào E.coli để nhân dòng. Quá trình này được lặp lại 3 – 4
lần. Cuối cùng, quá trình sẽ kết thúc bằng việc tăng độ chọn lọc của bước
rửa và/hoặc giảm nồng độ kháng nguyên ở mỗi vòng, và bạn sẽ thu hoạch
được các phage mang kháng thể mong muốn với ái lực và tính ổn định cao.
Các gen mã hóa cho kháng thể mong muốn sẽ được giải trình tự, và tối ưu
hóa ái lực (nếu cần thiết). Những gen nào cho kháng thể tốt nhất sẽ được
chuyển vào hệ thống biểu hiện thích hợp để tiến hành sản xuất khối lượng
lớn hơn.

19
3.2. Kháng thể đơn dòng trong nghiên cứu Sinh-Y

Các kháng thể đơn dòng là những tác nhân phản ứng cần thiết để phân
lập, nhận diện và xác định vị trí của các sản phẩm đặc trưng của gen trong
tế bào và để trợ giúp trong việc xác định cấu trúc đại phân tử của chúng.

- Các kháng thể đơn dòng dựa theo các chỉ thị tế bào chất và bề mặt tế
bào có một ảnh hưởng không chỉ trong nghiên cứu cơ bản mà còn cho phép
phát triển các phương thức trong điều trị. Chẳng hạn, sự biểu hiện dư thừa
của thụ thể đối với nhân tố sinh trưởng biểu mô (EGF) và các thụ thể liên
quan, một sản phẩm của proto-oncogene c-erbB-1, được tìm thấy là chỉ thị
của sự tiên lượng trong các bệnh nhân mang ung thư biểu mô tế bào vảy
hoặc u tuyến. Cũng như vậy, nhiều chất chỉ thị bề mặt của tế bào được phát
hiện trên leukocyte được sử dụng để nhận dạng các u ác tính và quyết định
phương pháp điều trị.

- Phân tích miễn dịch bằng phương pháp RIA và ELISA, dựa trên nguyên
tắc dùng kháng thể đơn dòng để phát hiện kháng nguyên tương ứng của nó
trong các mẫu phân tích nhờ phản ứng gắn rất đặc hiệu của kháng thể đơn
dòng với kháng nguyên.

- Ức chế thải loại khi ghép cơ quan bằng cách sử dụng kháng thể đơn
dòng chống kháng nguyên đặc hiệu của tế bào lympho T, nhằm loại bỏ phản
ứng thải loại khi ghép các cơ quan của người với nhau.

- Chẩn đoán hình thành khối u, khi có sự hình thành khối u trong máu sẽ
xuất hiện một số tác nhân đánh dấu. Do đó, có thể sử dụng các phương
pháp phân tích miễn dịch để phát hiện các tác nhân trên trong máu hoặc
trên khối u.

- Định hướng thuốc chữa bệnh, lợi dụng khả năng các phân tử kháng thể
gắn rất đặc hiệu với tế bào ở vị trí xác định nào đó của cơ thể (trong đó có

20
tế bào ung thư) để định hướng thuốc chữa bệnh hoặc độc chất tới trực tiếp
khối u hoặc nơi cần chữa trị như vậy sẽ tăng hiệu quả chữa trị lên nhiều lần.

3.3. Kháng thể đơn dòng trong chẩn đoán và điều trị bệnh

- Kháng thể đơn dòng có công dụng đặc biệt quan trọng, được sử dụng
để chẩn đoán bệnh truyền nhiễm, bệnh di truyền, dị ứng, rối loạn miễn dịch.

- Dùng kháng thể đơn dòng là phương tiện rất nhạy và đơn giản để chẩn
đoán có thai, các bệnh lao, phong...

- Kháng thể đơn dòng còn được dùng để chẩn đoán di căn ung thư nếu
có gắn thêm đồng vị phóng xạ.

Phương pháp sử dụng kháng thể đơn dòng đã nhanh chóng thay thế các
phương pháp miễn dịch học và huyết thanh học truyền thống trong các xét
nghiệm như:

- Xác định lượng hormone để đánh giá chức năng nội tiết.

- Phát hiện một số protein có ý nghĩa để chẩn đoán khối u.

- Xác định vi khuẩn và virus gây bệnh.

- Phát hiện trong máu các cầu thủ, các chất kích thích bị cấm sử dụng,
kiểm tra nồng độ thuốc trong máu và các tổ chức cơ thể nhằm bảo đảm liều
thuốc dùng không quá ngưỡng gây độc.

- Kháng thể đơn dòng còn được dùng để ức chế phản ứng đào thải khi
cấy ghép cơ quan (ghép thận, truyền tủy...).

4. Sản xuất insulin

Insulin là protein chứa 51 axit amin được tổng hợp ở tuyến tụy của
người. Vào đầu những năm 80 hãng Eli Lilly và Gentech Inc. (Mỹ) đã đưa ra

21
quy trình sản xuất insulin người bằng công nghệ ADN tái tổ hợp. Đó là
protein đầu tiên tạo được bằng công nghệ gen và nhờ công nghệ này mà
hiện nay insulin đã được sản xuất đại trà với giá thành rẻ hơn nhiều so với
trước kia.

Công nghệ sinh học hiện đại đã sản xuất insulin trong vi khuẩn E. coli
bằng cách:

- Tách gen phụ trách tổng hợp insulin trong cơ thể sống, có thể từ người
hoặc từ chuột. Gen insulin cũng có thể được tổng hợp nhân tạo trong ống
nghiệm.

- Tạo dòng gen insulin bằng cách gắn gen insulin vào plasmid vector sau
đó chuyển plasmid này vào tế bào vi khuẩn nhận (E. coli) để sản xuất một
lượng sinh khối lớn phục vụ cho việc tách chiết insulin.

5. Sản xuất interferon

Interferon là nhóm protein chứa khoảng 146-166 amino acid, chúng

xuất hiện trong tế bào động vật có xương sống khi bị nhiễm virus và giúp tế
bào kháng lại virus. Cho đến thời gian gần đây, interferon chủ yếu vẫn được
sản xuất từ tế bào bạch cầu hay nguyên bào bạch huyết của người bị nhiễm
virus. Tuy nhiên, bắt đầu từ năm 1980 người ta đã phân lập được các gen
mã hóa tổng hợp ba loại interferon trên và xây dựng được công nghệ sản
xuất interferon từ tế bào E. coli và nấm men. Interferon là loại protein
tương đối đơn giản, chịu được nhiệt độ tới 650 C, là sản phẩm của tế bào
sống, nên bản thân nó không độc.

Chương trình sinh tổng hợp tự nhiên interferon được mã hóa trong gen,
nhưng sự tổng hợp này chỉ xảy ra khi có virus xâm nhập cơ thể. Các thành
tựu của công nghệ sinh học hiện đại đã mở ra một cuộc cách mạng trong
nghiên cứu cấu trúc và hoạt động của interferon. Có ba loại interferon là α,

22
β và γ khác nhau bởi số amino acid và hoạt tính: - α-interferon do bạch cầu
sản xuất khi có virus xâm nhập.

- β-interferon do nguyên bào sợi sản xuất khi có

virus xâm nhập.

- γ-interferon do bạch cầu sản xuất qua phản ứng

của hệ miễn dịch.

Về cơ chế, interferon không tác động trực tiếp lên virus, mà tác động lên
tế bào, để các tế bào này tổng hợp ra loại protein đặc biệt, có khả năng kìm
hãm sự phát triển của virus xâm nhập cơ thể. Hiện nay, người ta đã phát
hiện được năm loại protein này. Khi virus xâm nhập ồ ạt vào cơ thể, như khi
có nạn dịch virus, thì interferon tự nhiên không đủ để chống lại virus.

Trước đây, người ta phải dùng máu để tách interferon từ bạch cầu dùng
trong điều trị viêm gan do virus, nhưng rất đắt. Nếu tách từ máu ra để lấy
interferon, thì dù có tách từ máu toàn bộ loài người cũng không đủ để chữa
bệnh cho một người. Bằng công nghệ sinh học hiện đại, người ta đã tách gen
interferon từ cơ thể sống, tạo dòng trong plasmid vector và chuyển gen này
vào vi khuẩn E. coli, để vi khuẩn này sản xuất interferon với hiệu suất lớn,
do đó thành tựu nói trên đã trở thành cuộc cách mạng về interferon.

6. Sản xuất interleukin

Tương tự interferon, một sản phẩm khác cũng giúp cơ thể tăng khả năng
miễn dịch là interleukin cũng đã được sản xuất theo công nghệ ADN tái tổ
hợp. Interleukin là một lymphokine bao gồm interleukin-1 (IL-1) và
interleukin-2 (IL-2), có khả năng điều hòa miễn dịch và chống ung thư. Hiện
nay, interleukin và interferon đang được thử nghiệm cùng với một số biệt
dược khác để chữa trị bệnh ung thư và bệnh AIDS. Interleukin-2 (IL-2) là
một cytokine quan trọng nhất đối với sự phát triển và đáp ứng miễn dịch

23
thích ứng. IL-2 có vai trò chính trong hoạt hóa các lympho T, ví dụ các tế
bào ác tính lympho T đã bộc lộ quá mức các thụ thể IL-2, nên có thể nghĩ
rằng IL-2 là yếu tố sinh trưởng của tế bào. Ngược lại, việc sử dụng tăng
cường chức năng của IL-2, cũng làm tăng đáp ứng miễn dịch chống lại các
khối u. Liệu pháp tiêm trực tiếp IL-2 vào mạch máu cũng làm tăng lượng tế
bào lympho, làm tăng tế bào NK và làm tăng hoạt động của các dạng tế bào
kiểu LAK. Liệu pháp này đang được sử dụng cho một số bệnh ung thư, như
ung thư da ác tính (melanoma) và ung thư biểu mô thận.

V. LIỆU PHÁP GEN

Đối với loại bệnh di truyền, bệnh do đột biến gen người ta phải cần đến
sự can thiệp của liệu pháp gen, một hướng chữa bệnh gắn liền với các kỹ
thuật tiên tiến trong lĩnh vực công nghệ sinh học hiện đại như các vi thao
tác gen, sửa đổi thay thế gen...

Liệu pháp gen thực chất là phương pháp chữa bệnh bằng gen.

Trong đó, gen trị liệu có thể là: - Các gen hoạt động bình thường (gen lành)
có thể đưa vào tế bào để thay thế gen hỏng, gen mất chức năng, khôi phục
hoạt động bình thường của tế bào và sự sống của cơ thể.

- Là những gen có khả năng mã hóa một protein

đặc hiệu khi đưa vào tế bào sống có thể tạo nên các loại protein đặc hiệu.
Các protein đặc hiệu có thể ức chế hoạt động của một gen khác trong tế bào,
kìm hãm khả năng phân chia của tế bào hoặc gây chết các tế bào bị bệnh.

- Những gen khi đưa vào tế bào hoạt động đồng

thời với các gen bệnh (gen bị đột biến trong tế bào) làm hạn chế tác động
của gen bệnh hoặc hỗ trợ, bù đắp cho các gen bị hỏng.

24
 - Gen liệu pháp còn là các gen bất hoạt được đưa
vào tế bào thay thế cho một gen lành nào đó, nhằm hạn chế sản phẩm
không cần thiết của gen lành hoặc tạo ra cho tế bào một trạng thái mới, có
tác dụng chống lại bệnh tật.

- Gen trị liệu có thể là những đoạn oligonucleotide có

tác dụng kìm hãm hoạt động của gen bị hỏng, bị đột biến trong tế bào.

1. Các loại liệu pháp gen

Liệu pháp gen được chia làm hai nhóm phương pháp cơ bản là liệu pháp
gen soma và liệu pháp gen giao tử (còn gọi là liệu pháp tế bào mầm).

1.1. Liệu pháp soma

Là phương pháp điều trị thay thế hoặc sữa chửa gen hỏng, gen bệnh của
các tế bào soma trong cơ thể người bệnh, giúp người bệnh có thể có cuộc
sống bình thường.

Liệu pháp gen soma có thể sử dụng một số loại tế bào như: tế bào
lympho, nguyên bào sợi, tế bào gốc, tế bào gan, tế bào biểu bì...

Liệu pháp gen soma đến nay đã chữa và điều trị khỏi hoặc hạn chế biểu
hiện cho một số khá lớn người bệnh mang các bệnh hiểm nghèo như: thiếu
hụt miễn dịch phối hợp trầm trọng (SCID), ung thư, thiếu máu hồng cầu
liềm, xơ nang...

1.2. Liệu pháp gen tế bào mầm

Là phương pháp điều trị, sửa chữa hoặc thay thế gen hỏng cho các giao
tử (tinh trùng hoặc tế bào trứng) nhằm tạo ra thế hệ sau bình thường. Liệu
pháp gen tế bào mầm hiện nay còn là vấn đề đang được tranh luận ở nhiều
nước trên thế giới chủ yếu vì lý do đạo đức và nhân đạo, chẳng hạn vấn đề
nhân bản người.
25
2. Các ứng dụng của liệu pháp gen trong chữa bệnh

2.1. Bệnh thiếu hụt miễn dịch phối hợp trầm trọng (severe combined
immuno deficiency-SCID)

Bệnh SCID là bệnh thiếu hụt miễn dịch phối hợp trầm trọng ở người, gây
giảm sút sức khỏe hoặc có thể gây chết do dễ bị mắc các bệnh truyền nhiễm
khác. Bệnh SCID do rối loạn di truyền, gây mất chức năng tế bào miễn dịch
lympho T, lympho B, tế bào NK... Có nhiều biểu hiện bệnh SCID khác nhau,
tùy theo mức độ sai hỏng của các gen, dẫn đến rối loạn chức năng của các
loại tế bào lympho gây thiếu hụt miễn dịch ở cơ thể người.

Bệnh SCID ở người được chia làm hai nhóm: bệnh SCID liên kết nhiễm
sắc thể giới tính X (XSCID, chẳng hạn: sai hỏng gen trên cánh dài của nhiễm
sắc thể giới tính X của người) và bệnh SCID do sai hỏng các gen (ADA, PNP,
CD3 và ZAP 70...) nằm trên nhiễm sắc thể thường.

2.1.1. Liệu pháp gen chữa bệnh ADA-SCID

Gen mã hóa enzyme adenosine deaminase bị hỏng, dẫn đến rối loạn chức
năng của các lympho T và B gây bệnh ADA-SCID.

Liệu pháp gen gồm có bốn bước cơ bản sau:

- Lấy các tế bào lympho T từ máu của bệnh nhân ADA-SCID.

- Thiết kế vector liệu pháp retrovirus mang gen ADA bình thường.

- Trộn vector liệu pháp với tế bào lympho T để thực hiện quá trình
chuyển gen vào tế bào lympho T.

- Đưa các tế bào lympho T mang gen liệu pháp trở lại cơ thể người bệnh.

26
 Kết quả sau khi điều trị liệu pháp gen từ 5-6 tháng số tế bào miễn dịch
lympho T tăng dần lên, sau hai năm khả năng miễn dịch của bệnh nhân
được phục hồi.

2.1.2. Liệu pháp gen chữa bệnh X-SCID

Liệu pháp gen điều trị loại bệnh này được thực hiện bằng phương pháp
ex vivo để ghép tế bào tủy xương. Tế bào tủy xương của bệnh nhân được
lấy ra kết hợp xạ trị, sau đó chọn lọc những tế bào khỏe được chuyển gen γ
c bình thường nhờ retroviral vector. Kết quả sau khi điều trị từ 3-13 tháng
thì 10/11 bệnh nhi đã khôi phục được các tế bào lympho T, B và NK, khả
năng miễn dịch tăng lên rất đáng kể.

2.2. Bệnh ung thư

Liệu pháp gen (in vivo và ex vivo) là một trong những phương pháp mới
điều trị ung thư có hiệu quả. Bằng kỹ thuật vi tiêm, người ta đưa thẳng vào
giữa khối u các vector mang gen trị liệu tương ứng, để ức chế hoặc tiêu diệt
các tế bào ung thư. Trong liệu pháp gen điều trị ung thư người ta sử dụng
nhiều loại vectơ liệu pháp khác như retrovirus, adenovirus và plasmid. Liệu
pháp gen điều trị ung thư bằng cách tác động trực tiếp vào khối u, có thể
được thực hiện theo nhiều phương thức khác nhau:

- Ức chế phát triển của khối u bằng cách thực hiện các liệu pháp ex vivo
hoặc in vivo với các viral vector mang các gen liệu pháp như p53, pRb...

- Kích hoạt tế bào chết theo chương trình bằng cách: sử dụng các gen liệu
pháp BAX tăng cường gây kích hoạt chết theo chương trình, hoặc sử dụng
gen BCL-2 để ngăn chặn các phản ứng chống apoptosis (antiapoptosis).
Trường hợp apoptosis các tế bào co lại, tách khỏi các tế bào xung quanh, các
gen ced (gen tự sát-suicide gene) được hoạt hóa làm cho tế bào teo dần rồi
chết.

27
 - Thực hiện các liệu pháp thay gen nhằm phục hồi các protein bị hỏng,
phục hồi khả năng miễn dịch của tế bào.

- Sử dụng liệu pháp antisense để kìm hãm hoạt động của các oncogen,
hoặc ức chế tác dụng các sản phẩm của oncogen.

- Hạn chế sự phát triển của khối u bằng vi tiêm các protein tiền apoptosis
(pro-apoptosis protein) như các protein BAX (sản phẩm của gen BAX) hoặc
interferon (TNF), kết hợp sử dụng xạ trị hoặc điều trị hóa chất.

- Sử dụng các gen tự sát và các sản phẩm của nó để tiêm thẳng vào khối u,
chẳng hạn tiêm ganciclovir-sản phẩm của gen mã hóa enzyme thymidin
kinase có tác dụng tiêu diệt các tế bào ung thư.

- Biện pháp tác động trực tiếp vào tế bào ung thư bằng bao vây thành
mạch (anti-angiogenic). Đây là biện pháp chặn mối liên hệ về mặt dinh
dưỡng của tế bào ung thư, làm cho tế bào ung thư thiếu dinh dưỡng và chết
dần dần. Hiện nay, đã phát hiện hơn 40 hợp chất tự nhiên có chức năng này
như: endostatin, angiostatin...

2.3. Bệnh thiếu máu hồng cầu liềm

Bệnh thiếu máu hồng cầu liềm SCA là bệnh do đột biến gen β globin làm
thay đổi chức năng phân tử protein, xuất hiện hemoglobin S. Khi các phân
tử hemoglobin S trao đổi oxy với các tế bào, có thể liên kết với nhau tạo các
cấu trúc hình que, làm cho hồng cầu biến dạng thành hình liềm. Hồng cầu
liềm không có hình lõm hai mặt như hồng cầu bình thường, độ trơn kém
không chui qua được các mao mạch, thường xếp lại thành đám gây tắc mao
mạch gây cản trở quá trình lưu thông của máu. Sau một thời gian số lượng
tế bào hồng cầu bình thường giảm dần, do các tế bào hồng cầu mới sinh ra
không bù đắp kịp số tế bào hồng cầu chết đi, trong máu thiếu một lượng
hồng cầu ngày càng lớn, gọi là bệnh thiếu máu hồng cầu liềm.

28
 Các nghiên cứu trên người, chuột và các động vật có vú khác đều xác định
rõ nguyên nhân gây bệnh thiếu máu hồng cầu liềm do đột biến gen β globin.
Điểm đột biến và các dạng đột biến đã được nghiên cứu rất kỹ. Tuy nhiên,
sử dụng liệu pháp gen chữa bệnh SCA ở người thu được kết quả rất hạn chế.

2.3.1. Vector liệu pháp sử dụng trong điều trị bệnh SCA

Trong các loại vector liệu pháp, vectơ lentivirus được đánh giá là loại
vectơ có hiệu quả nhất, vì lentivirus giúp cho các gen liệu pháp hòa nhập rất
tốt. Tuy nhiên, nhiều loại virus trong họ lentivirus là nguyên nhân gây
nhiều bệnh hiểm nghèo ở người như AIDS, lao, ung thư... nên sử dụng
lentivirus làm vectơ liệu pháp còn nhiều hạn chế. Các lentivirus có thể biến
đổi rất mạnh và nhanh, nên có thể gây các hậu quả không lường trước cho
cơ thể người. Vì vậy, người ta thường sử dụng các retrovirus quen thuộc để
thiết kế vector liệu pháp nhằm hạn chế bớt các rủi ro.

2.3.2. Các bước điều trị bệnh SCA bằng liệu pháp gen

- Tách tế bào tủy xương của người bệnh và chiếu xạ để chọn các tế bào
khỏe mạnh, trộn chung với retrovirus vector mang gen β globin bình
thường để tạo các tế bào tủy xương tái tổ hợp.

- Xạ trị và điều trị hóa dược để tiêu diệt bớt các tế bào tủy xương mang
gen đột biến.

- Chuyển các tế bào tủy xương mang gen β globin bình thường vào bệnh
nhân. Sau một thời gian các tế bào này sinh trưởng và bệnh thiếu máu giảm
dần.

- Do lượng tế bào mang gen đột biến (β S globin) vẫn tiếp tục được hình
thành trong cơ thể người bệnh, nên sau một thời gian nhất định mức độ
bệnh thiếu máu lại tăng lên, do đó phải lập lại các bước điều trị gây nhiều

29
tốn kém. Hiện nay, các thử nghiệm liệu pháp gen khác nhau trên chuột cho
kết quả rất tốt. Vì thế, hy vọng trong một tương lai không xa bệnh thiếu
máu hồng cầu liềm ở người sẽ được chữa khỏi bằng liệu pháp gen.

2.4. Bệnh xơ nang

Bệnh xơ nang xuất hiện do dột biến gen trên nhiễm sắc thể thường, gây
rối loạn trong chuyển hóa các ion Cl- trong tế bào dẫn đễn chứng viêm phổi,
viêm tụỵ, viêm gan... gây giảm sút sức khỏe, có thể dẫn tới tử vong do bị suy
hô hấp nặng. Bệnh xơ nang là một bệnh di truyền, có tỷ lệ mắc bệnh là
1/2.500 người. Bệnh xơ nang do một loại protein màng (CFTR) bị mất chức
năng, không có khả năng đưa các ion Cl- thừa ra khỏi tế bào, làm mất cân
bằng giữa nước và muối trong tế bào. Bệnh xơ nang thường hình thành một
lớp dịch nhầy gây rối loạn chức năng protein màng, lớp dịch nhầy ngày
càng đặc ở các mô tế bào bị bệnh CF, gây ra các chứng bệnh về phổi, gan,
tụy và ruột...

Điều trị bệnh xơ nang ở người bằng liệu pháp gen đã thu được những
kết quả tương đối tốt. Các xu hướng sử dụng liệu pháp gen hiện nay bao
gồm:

- Sử dụng vector liệu pháp mang gen trị liệu cADN (do kích thước gen CF
rất lớn nên chỉ tổng hợp cADN từ mARN mã hóa protein CFTR và một số
trình tự đặc hiệu) làm cho gen liệu pháp gắn với nhiễm sắc thể ở những
điểm đặc hiệu.

- Thực hiện phương thức sửa chữa gen bằng vector mang các
oligonucleotide để sửa chữa đột biến trên gen CF.

- Chuyển các đoạn cADN cần thiết vào tế bào, sao cho cADN vào nhân
dính với hệ gen ở một điểm nào đó và tồn tại như một đơn vị độc lập trong
tế bào.

30
2.5. Hội chứng AIDS

Trong nhiều năm qua, nhiều loại biệt dược như: starudine, lamirudine,
nerirapine, azathioprine, antiretrovir... được nghiên cứu và thử nghiệm
trong điều trị chống nhiễm HIV/AIDS, đã có những kết quả tốt góp phần
kéo dài cuộc sống cho nhiều bệnh nhân AIDS. Tuy nhiên, trong nhiều
trường hợp nhiễm HIV điều trị bằng các loại thuốc trên không có hiệu lực
do một số chủng HIV có thể đã có đột biến thích ứng với thuốc. Để hạn chế
nhiễm HIV và đại dịch AIDS, trong những năm gần đây một hướng mới
trong điều trị AIDS được chú ý nghiên cứu và thử nghiệm là liệu pháp gen: -
Sử dụng vectơ liệu pháp để chuyển các gen trị liệu vào tế bào nhằm hạn chế
khả năng xâm nhiễm và tái bản của của HIV. Trong trường hợp này người ta
sử dụng cả hai loại vector: viral virus (adenovirus, AAV và HIV1), non-viral
virus (oligonucleotide, polycation, liposome...).

- Kích hoạt hệ thống gen của tế bào,

tăng cường miễn dịch chống sự phát triển của HIV/AIDS.

- Sử dụng các gen tự sát ced đã biến

đổi, làm cho tế bào bị chết khi có HIV xâm nhiễm. Khi HIV mới xâm nhiễm
tế bào, bằng liệu pháp đưa các gen tự sát (ced) thymidin kinase (TK) phối
hợp sử dụng thuốc chống virus ganciclovir (GCV), tạo thành phức hợp
ganciclovir-phosphate. Ganciclovirphosphate ức chế hoạt động của enzyme
DNA polymerase, làm cho quá trình tái bản gen của tế bào bị ngừng, sự
phân chia tế bào bị gián đoạn, tế bào co lại và chết dần. Tế bào nhiễm HIV bị
chết, sẽ hạn chế khả năng lây lan của HIV trong cơ thể.

- Tạo các vacxin ADN phòng chống

nhiễm HIV. Vacxin ADN được xem là một chiến lược hiệu quả của liệu pháp
gen phòng chống HIV/AIDS. Vacxin ADN HIV-1 đã và đang được thử
nghiệm trên chuột có hiệu quả.
31
VI. CHUYỂN GEN TẠO CÁC ĐỘNG, THỰC VẬT CÓ NĂNG SUẤT, CHẤT
LƯỢNG CAO

Gồm:

- Công nghệ chỉnh sửa gen: Công nghệ chỉnh sửa gen cho phép cắt bỏ hoặc
bổ sung một đoạn trình tự ADN (gồm 1 đến nhiều nucleotids hoặc 1 đến vài
gen), thay đổi trình tự nucleotids hoặc thay thế các nucleotids trên ADN ở
một vị trí xác định trên nhiễm sắc thể của hệ gen. Công nghệ này có khả
năng tạo ra cuộc cách mạng sinh học, giống cây trồng, vật nuôi trên toàn
cầu.
- Công nghệ bất hoạt gen (ARNi): Công nghệ này cho phép gây bất hoạt
(Knock out) hoặc làm giảm hoạt hóa (Knock down) một gen bất kỳ trong cơ
thể sống hoặc giống cây, giống con vì mục đích của con người. Ví dụ: Với
công nghệ bất hoạt gen, các nhà khoa học Mỹ do TS Craig Venter lãnh đạo
đã tạo ra giống tằm kéo tơ nhện (bất hoạt gen tơ tằm và cài gen tơ nhện vào
con tằm). Giống tằm kéo tơ nhện có năng suất sợi cao, sợi tơ dài hơn và bền
hơn rất nhiều so với tơ tằm.
VII. CHỌN LỌC ƯU THẾ LAI
Việc chọn lọc ưu thế lai bằng các phép lai di truyền kinh điển đòi hỏi rất
nhiều thời gian và công sức. Ngày nay, các chỉ thị phân tử được dùng để
chọn lọc những tính trạng mong muốn. Sự không phân li độc lập của một
tính trạng mong muốn với chỉ thị phân tử di truyền cho phép sử dụng chỉ
thị đó để sàng lọc các cá thể có ưu thế lai. Ưu điểm của cách chọn này là tính
trạng không nhất thiết phải thể hiện ra bên ngoài.
Các chỉ thị di truyền là các chỉ thị thể hiện sự khác biệt giữa các cơ thể
hoặc các loài khác nhau. Các chỉ thị này không thể hiện cho các gen mục tiêu
mà chỉ là dấu hiệu hoặc như là “cờ đánh dấu”.

32
 Chỉ thị di truyền có thể chia thành hai loại: chỉ thị truyền thống và chỉ thị
ADN. Chỉ thị truyền thống gồm chỉ thị hình thái (đây là những tính trạng
hoặc đặc điểm hình thái như mầu hoa, kiểu hình hạt, đặc điểm sinh trưởng,
sự biến đổi sắc tố v.v.), chỉ thị tế bào (đặc trưng cấu trúc của nhiễm sắc thể)
và chỉ thị sinh hóa (các isozyme, protein và các chất trao đổi chất). Chỉ thị
ADN là những thay đổi trong phân tử ADN và được chia thành nhiều loại
dựa trên sự khác nhau về phương pháp và kỹ thuật xác định sự đa hình.
Các chỉ thị ADN được sử dụng rộng rãi nhất do số lượng chỉ thị không
hạn chế. Chỉ thị ADN được hình thành từ các loại đột biến ADN khác nhau
như thay thế (đột biến điểm), sắp xếp lại (thêm vào hoặc bớt đi nucleotide)
hoặc các sai sót trong sao chép các đoạn ADN lặp lại liền kề. Các chỉ thị ADN
thường nằm ở các vùng không phiên mã. Khác với các chỉ thị hình thái và
sinh hóa, chỉ thị ADN không giới hạn về số lượng, không ảnh hưởng bởi yếu
tố môi trường và giai đoạn phát triển của cây. Chỉ thị ADN được sử dụng
nhiều trong nghiên cứu quan hệ di truyền, phát sinh chủng loại và phân loại
phân tử; trong lập bản đồ liên kết di truyền, nhận biết gen; và trong chọn
giống bao gồm đánh giá đa dạng di truyền, nhận biết giống, chọn lọc các
tính trạng kháng bệnh, chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường,
năng suất và phẩm chất giống.

CÂU HỎI, BÀI TẬP

33
Câu 1:

a. Cơ sở của lai phân tử là gì? Lai phân tử có thể xảy ra đối với những phân
tử nào?

b. Những nhân tố nào ảnh hưởng tới lai phân tử?

Đáp án:

a. Cơ sở của lai phân tử là sự biến tính và hồi tính của phân tử ADN. Khi một
phân tử ADN mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ nóng
chảy” (Tm) thì hai mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết hidro nối
liền hai mạch. Nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được làm giảm từ từ
cộng với điều kiện thích hợp, chúng sẽ bắt cặp trở lại. Hiện tượng này được
gọi là lai phân tử.

Hai mạch ADN có nguồn gốc khác nhau nhưng có trình tự nucleotit bổ
trợ có thể liên kết với nhau trong điều kiện phù hợp (về nhiệt độ, độ pH,
nồng độ muối trong đệm) để tạo nên một phân tử ADN mới. Hiện tượng liên
kết như vậy cũng có thể xảy ra giữa hai mạch ADN với nhau, hoặc giữa hai
mạch ARN hoặc giữa ADN và ARN.

b. Những nhân tố ảnh hưởng tới lai phân tử:

- Thành phần bazơ nitơ trong phân tử ADN.

- Độ dài phân tử ADN.

- Nồng độ ADN và thời gian phản ứng.

- Các điểm bắt cặp sai lệch.

- Môi trường phản ứng: nhiệt độ, các ion,…

Câu 2:

34
 Cơ chế khuếch đại ADN bằng PCR có gì khác biệt so với trong cơ thể?

Đáp án:

- Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho helicase.

- Kết hợp với enzyme ADN polymerase chịu nhiệt (Taq ADN polymerase)
để tổng hợp ADN mới trong môi trường thích hợp.

- Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chuyên
biệt, chủ động.

Câu 3:

Cho biết ưu, nhược điểm của PCR trong khuếch đại gen, cách khắc phục
nhược điểm?

Đáp án:

* Ưu điểm:

- Tốc độ cao.

- Đơn giản: + Chỉ cần một lượng nhỏ ADN để làm việc

+ ADN hoàn chỉnh và không bị hư hại

+ Không cần phải có trình tự của vùng ADN hướng đến để khuếch
đại → những trình tự ở hai bên của gene quan tâm → đột biến trong bộ gen
vùng quan tâm sẽ không ảnh hưởng đến sự khuếch đại → đột biến có thể
được sao chép và phân tích.

* Nhược điểm:

- Độ dài chuỗi ADN cần khuếch đại: 200–1000 bp

- Tỷ lệ sao chép sai cao 1/109 nu

35
- Ngoại nhiễm

- Không phân biệt được tế bào sống hay đã chết

- Quy trình định danh vi khuẩn vẫn dựa vào nuôi cấy

* Khắc phục:

- Tách chiết ADN bảo đảm ADN khuôn tinh khiết

- Sử dụng ADN polymerase tốt

- Lưu ý khi sử dụng các dụng cụ thí nghiệm cần hạn chế thao tác thừa thải

Câu 4:

Nhiệm vụ của Taq ADN polymerase trong PCR? Nhiệm vụ của primer?
Tại sao sau một số chu kì nhất định, số lượng bản sao sản phẩm PCR bị giới
hạn? Các yếu tố cần điều chỉnh để tối ưu hóa một phản ứng PCR?

Đáp án:

- Taq polymerase (hay Taq) là enzyme chịu nhiệt thường dùng trong các
phản ứng PCR, hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72°C. Enzyme này có vai trò xúc
tác cho quá trình lắp ráp các nucleotide A, T, G, C vào mạch ADN mới tổng
hợp theo chiều 5 '→ 3' khi có mặt của ion Mg2+. Enzyme này không bao gồm
hoạt tính exonuclease 3 '→ 5'.

- Cặp mồi (primer), để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch
đại. Mồi là những đoạn ngắn, sợi ADN nhân tạo – không quá 50 (thường 18-
25) nucleotides phù hợp một cách chính xác ở điểm bắt đầu và kết thúc của
ADN cần khuếch đại. Nó gắn chặt với ADN mẫu ở những điểm khởi đầu và
kết thúc, nơi mà ADN-polymerase nối và bắt đầu quá trình tổng hợp của sợi
ADN mới.

36
- Số chu kì lặp lại trong mỗi phản ứng PCR thường không quá 50 và mỗi chu
kì thường kéo dài khoảng 5 phút. Khi số chu kì lớn hơn 50, nồng độ dNTP,
mồi và hoạt tính của Taq bị suy giảm nghiêm trọng trong khi nồng độ sợi
khuôn tăng cao. Điều đó ức chế phản ứng PCR.

- Do PCR rất nhạy, nên phải tránh ô nhiễm các ADN khác có trong phòng thí
nghiệm (vi khuẩn, virus, ADN,...). Vì vậy các mẫu ADN, hỗn hợp phản ứng và
quy trình ADN, phản ứng phân tích sản phẩm, nên được thực hiện trong
một khu vực riêng biệt. Ở giai đoạn chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, phải chuẩn
bị phòng riêng biệt với đèn UV. Phải sử dụng găng tay sạch cho mỗi bước
PCR cũng như thay thế các pipet. Thuốc thử dùng trong PCR phải được
chuẩn bị riêng biệt và chỉ được dùng cho mục đích này. Các mẫu phải được
giữ riêng biệt với các mẫu ADN khác. Phản ứng có kiểm soát (kiểm soát bên
trong), ngoại trừ ADN khuôn mẫu, phải luôn được thực hiện, để kiểm tra sự
nhiễm bẩn.
Câu 5:

Thế nào là vacxin ADN? Ưu, nhược điểm của vacxin ADN là gì?

Đáp án:

Vacxin ADN là 1 plasmid kĩ thuật chứa những gen mã hóa cho protein
kháng nguyên đặc trưng của vi sinh vật. Các plasmid đó được tiêm (thường
vào cơ) đưa gen trực tiếp vào trong một số tế bào và được hấp thu bởi các
tế bào lân cận nơi kim tiêm được đưa vào. Ngoài ra, plasmid cũng có thể
được đưa vào bằng súng bắn gen (các viên đạn vàng được bọc ADN của
plasmid) bằng cách đẩy các plasmid vào trong các tế bào gần bề mặt cơ thể,
thường là da hoặc màng nhầy. Khi vào bên trong tế bào, một vài plasmid tái
tổ hợp sẽ đi vào nhân và do gen được điều hòa bởi một promoter mạnh của
eukaryote, các tế bào sẽ tổng hợp các kháng nguyên được mã hóa bởi
plasmid.
37
* Ưu điểm:

- Có thể thiết kế 1 vacxin đa giá (Trên cùng 1 plasmid gắn nhiều gen mã hóa
hoặc trộn nhiều loại plasmid có chứa ADN mã hóa cho các loại protein khác
nhau. Hỗn hợp vacxin ADN này không bị ảnh hưởng lẫn nhau, như thế sẽ
đơn giản hóa được tiến trình tiêm chủng).

- Trình diện kháng nguyên trên cả MHC I và MHC II.

- Đáp ứng miễn dịch chỉ tập trung vào kháng nguyên quan tâm.

- Không cần tổng hợp protein.

- Thời gian “nhớ ” dài, không cần tiêm nhắc lại.

* Nhược điểm:

- Không áp dụng cho những vi sinh vật có nguồn gốc gây bệnh không phải là
kháng nguyên protein.

- Nguy cơ sáp nhập vào ADN tế bào chủ dẫn đến đột biến gen.

- Có khả năng gây phản ứng miễn dịch chống lại ADN (tự miễn).

- Đưa vacxin ADN vào cơ thể, sự phân bố ADN vacxin trong tế bào không
đạt được mức tối đa.

Câu 6:

Kháng thể tái tổ hợp là gì? Ưu điểm của kháng thể đơn dòng tái tổ hợp so
với kháng thể đơn dòng thông thường?

Đáp án:

Kháng thể tái tổ hợp (Recombinant antibodies – rAbs) là loại kháng thể
được tạo ra trong phòng thí nghiệm, sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp,

38
tách biệt hoàn toàn với sự kiểm soát của hệ miễn dịch. Các gen kháng thể
được phân lập và chèn vào ADN plasmid trung gian. Sau đó, chúng được
đưa vào tế bào vật chủ để biểu hiện, như: vi khuẩn, nấm men, hoặc các dòng
tế bào động vật có vú.

* Ưu điểm của kháng thể tái tổ hợp:

- Cần ít lượng kháng nguyên tinh sạch để sản xuất hơn.

- Rút ngắn thời gian sản xuất (chỉ cần vài tuần).

- Có thể được tổng hợp dựa vào bất kỳ kháng nguyên nào, bao gồm: kháng
nguyên người và có độ bảo tồn cao, các tác nhân không gây đáp ứng miễn
dịch, và kể cả những phân tử độc tố.

- Không gây phản ứng mẫn cảm bất lợi

- Có thể được tạo ra ở nhiều dạng như: các đoạn “cánh tay” của kháng thể
(Fab fragments), các đoạn vùng biến đổi đơn (scFv, chỉ mang duy nhất một
ví trí gắn kháng nguyên), hoặc đôi (dimeric scFv); và được biểu hiện ở các
loại vật chủ như: tế bào E. coli, tế bào động vật có vú, nấm men, nấm mốc, tế
bào côn trùng và cả tế bào thực vật.

- Dễ dàng hòa tan với thuốc và các độc tố, nên cũng có thể được dùng trong
trị liệu.

- Không cần dùng đến tế bào lympho B bất tử vì chúng không ổn định, dễ bị
mất gen kháng thể, và dễ chết khi lấy ra khỏi môi trường đông lạnh. Kháng
thể đơn dòng tái tổ hợp được tạo ra bằng cách phân lập các gen kháng thể
riêng lẻ. Chỉ cần có gen kháng thể đã có thể dễ dàng tạo ra được một lượng
lớn kháng thể tương ứng.

- Kháng thể đơn dòng tái tổ hợp được mã hóa bởi một trình tự gen, vì thế sẽ
có độ tin cậy cao và tạo ra nhiều bản sao hơn.
39
- Dễ dàng thực hiện tối ưu hóa, như tối ưu hóa ái lực, bằng các kỹ thuật sinh
học phân tử như PCR tạo lỗi ngẫu nhiên (error – prone PCR), và đột biến
gen trực tiếp (site-directed mutagenesis).

- Có thể được sản xuất với khối lượng lớn mà không cần đến các tế bào
động vật, vì thế vượt qua được các vấn đề về đạo đức.

Câu 7:

Thực chất của liệu pháp gen là gì? Gen trị liệu là gì?

Đáp án:

Liệu pháp gen thực chất là phương pháp chữa bệnh bằng gen.

Trong đó, gen trị liệu có thể là: - Các gen hoạt động bình thường (gen lành)
có thể đưa vào tế bào để thay thế gen hỏng, gen mất chức năng, khôi phục
hoạt động bình thường của tế bào và sự sống của cơ thể.

- Là những gen có khả năng mã hóa một protein

đặc hiệu khi đưa vào tế bào sống có thể tạo nên các loại protein đặc hiệu.
Các protein đặc hiệu có thể ức chế hoạt động của một gen khác trong tế bào,
kìm hãm khả năng phân chia của tế bào hoặc gây chết các tế bào bị bệnh.

- Những gen khi đưa vào tế bào hoạt động đồng

thời với các gen bệnh (gen bị đột biến trong tế bào) làm hạn chế tác động
của gen bệnh hoặc hỗ trợ, bù đắp cho các gen bị hỏng.

- Gen liệu pháp còn là các gen bất hoạt được đưa
vào tế bào thay thế cho một gen lành nào đó, nhằm hạn chế sản phẩm
không cần thiết của gen lành hoặc tạo ra cho tế bào một trạng thái mới, có
tác dụng chống lại bệnh tật.

40
 - Gen trị liệu có thể là những đoạn oligonucleotide có
tác dụng kìm hãm hoạt động của gen bị hỏng, bị đột biến trong tế bào.

Câu 8:

Có thể sử dụng liệu pháp gen trong điều trị AIDS như thế nào?

Đáp án:

- Sử dụng vector liệu pháp để chuyển các gen trị liệu vào tế bào nhằm hạn
chế khả năng xâm nhiễm và tái bản của của HIV. Trong trường hợp này
người ta sử dụng cả hai loại vector: viral virus (adenovirus, AAV và HIV1),
non-viral virus (oligonucleotide, polycation, liposome...).

- Kích hoạt hệ thống gen của tế bào, tăng cường miễn dịch chống sự phát
triển của HIV/AIDS.

- Sử dụng các gen tự sát ced đã biến đổi, làm cho tế bào bị chết khi có HIV
xâm nhiễm. Khi HIV mới xâm nhiễm tế bào, bằng liệu pháp đưa các gen tự
sát (ced) thymidin kinase (TK) phối hợp sử dụng thuốc chống virus
ganciclovir (GCV), tạo thành phức hợp ganciclovir-phosphate.
Ganciclovirphosphate ức chế hoạt động của enzyme DNA polymerase, làm
cho quá trình tái bản gen của tế bào bị ngừng, sự phân chia tế bào bị gián
đoạn, tế bào co lại và chết dần. Tế bào nhiễm HIV bị chết, sẽ hạn chế khả
năng lây lan của HIV trong cơ thể.

- Tạo các DNA vaccine phòng chống nhiễm HIV.

Câu 9:

Công nghệ gen được ứng dụng như thế nào trong tạo giống vật nuôi, cây
trồng?

Đáp án:

41
Gồm:

- Công nghệ chỉnh sửa gen: Công nghệ chỉnh sửa gen cho phép cắt bỏ hoặc
bổ sung một đoạn trình tự ADN (gồm 1 đến nhiều nucleotids hoặc 1 đến vài
gen), thay đổi trình tự nucleotids hoặc thay thế các nucleotids trên ADN ở
một vị trí xác định trên nhiễm sắc thể của hệ gen.
- Công nghệ bất hoạt gen (RNAi): Công nghệ này cho phép gây bất hoạt
(Knock out) hoặc làm giảm hoạt hóa (Knock down) một gen bất kỳ trong cơ
thể sống hoặc giống cây, giống con vì mục đích của con người.

Câu 10:

a. Chọn lọc ưu thế lai bằng ứng dụng công nghệ gen có ưu điểm gì so với
chọn lọc ưu thế lai bằng các phép lai?

b. Thế nào là chỉ thị ADN? Chỉ thị ADN có ưu điểm gì so với chỉ thị hình thái
và sinh hóa? Ứng dụng của chỉ thị ADN?

Đáp án:

a. Việc chọn lọc ưu thế lai bằng các phép lai di truyền kinh điển đòi hỏi rất
nhiều thời gian và công sức. Ngày nay, các chỉ thị phân tử được dùng để
chọn lọc những tính trạng mong muốn. Sự không phân li độc lập của một
tính trạng mong muốn với chỉ thị phân tử di truyền cho phép sử dụng chỉ
thị đó để sàng lọc các cá thể có ưu thế lai. Ưu điểm của cách chọn này là tính
trạng không nhất thiết phải thể hiện ra bên ngoài mà vẫn có thể chọn lọc
được.

b. Chỉ thị ADN là những thay đổi trong phân tử ADN và được chia thành
nhiều loại dựa trên sự khác nhau về phương pháp và kỹ thuật xác định sự
đa hình.

42
Các chỉ thị ADN được sử dụng rộng rãi nhất do số lượng chỉ thị không hạn
chế. Chỉ thị ADN được hình thành từ các loại đột biến ADN khác nhau như
thay thế (đột biến điểm), sắp xếp lại (thêm vào hoặc bớt đi nucleotide) hoặc
các sai sót trong sao chép các đoạn DNA lặp lại liền kề. Các chỉ thị ADN
thường nằm ở các vùng không phiên mã.

* Ưu điểm: Khác với các chỉ thị hình thái và sinh hóa, chỉ thị ADN không
giới hạn về số lượng, không ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường và giai đoạn
phát triển của cây.

* Ứng dụng: Chỉ thị ADN được sử dụng nhiều trong nghiên cứu quan hệ di
truyền, phát sinh chủng loại và phân loại phân tử; trong lập bản đồ liên kết
di truyền, nhận biết gen; và trong chọn giống bao gồm đánh giá đa dạng di
truyền, nhận biết giống, chọn lọc các tính trạng kháng bệnh, chống chịu các
điều kiện bất lợi của môi trường, năng suất và phẩm chất giống.

Câu 11:

Ứng dụng liệu pháp gen trong điều trị ung thư bằng cách nào?

Đáp án:

Bằng kỹ thuật vi tiêm, người ta đưa thẳng vào giữa khối u các vector
mang gen trị liệu tương ứng, để ức chế hoặc tiêu diệt các tế bào ung thư.
Trong liệu pháp gen điều trị ung thư người ta sử dụng nhiều loại vectơ liệu
pháp khác như retrovirus, adenovirus và plasmid. Liệu pháp gen điều trị
ung thư bằng cách tác động trực tiếp vào khối u, có thể được thực hiện theo
nhiều phương thức khác nhau:

- Ức chế phát triển của khối u bằng cách thực hiện các liệu pháp ex vivo
hoặc in vivo với các viral vector mang các gen liệu pháp như p53, pRb...

43
 - Kích hoạt tế bào chết theo chương trình bằng cách: sử dụng các gen liệu
pháp BAX tăng cường gây kích hoạt chết theo chương trình, hoặc sử dụng
gen BCL-2 để ngăn chặn các phản ứng chống apoptosis (antiapoptosis).
Trường hợp apoptosis các tế bào co lại, tách khỏi các tế bào xung quanh, các
gen ced được hoạt hóa làm cho tế bào teo dần rồi chết.

- Thực hiện các liệu pháp thay gen nhằm phục hồi các protein bị hỏng,
phục hồi khả năng miễn dịch của tế bào.

- Sử dụng liệu pháp antisense để kìm hãm hoạt động của các oncogen,
hoặc ức chế tác dụng các sản phẩm của oncogen.

- Hạn chế sự phát triển của khối u bằng vi tiêm các protein tiền apoptosis
như các protein BAX (sản phẩm của gen BAX) hoặc interferon (TNF), kết
hợp sử dụng xạ trị hoặc điều trị hóa chất.

- Sử dụng các gen tự sát và các sản phẩm của nó để tiêm thẳng vào khối u.

- Biện pháp tác động trực tiếp vào tế bào ung thư bằng bao vây thành
mạch (anti-angiogenic). Đây là biện pháp chặn mối liên hệ về mặt dinh
dưỡng của tế bào ung thư, làm cho tế bào ung thư thiếu dinh dưỡng và chết
dần dần.

MỘT SỐ CÂU HỎI THI HSG QG:

Câu 1: Nêu và giải thích các đặc điểm của thể truyền dùng để chuyển 1 gen
từ tế bào nhân thực sang tế bào vi khuẩn nhằm mục đích nhân dòng gen.
(Đề thi HSG Quốc gia năm 2012).

44
Câu 2: Trong công nghệ tạo động vật chuyển gen, gen chuyển được gắn vào
1 vị trí (locut) trên NST của tế bào động vật. Bằng cách nào có thể tạo ra
động vật đồng hợp về gen chuyển? (Đề thi HSG Quốc gia năm 2015)

Câu 3: Dựa trên cơ sở khoa học nào mà người ta tiến hành lai phân tử? Nêu
và giải thích các ứng dụng thực tiễn của lai phân tử . (Đề thi chọn HSG Quốc
gia năm 2011)

PHẦN KẾT LUẬN

1. Những vấn đề quan trọng của đề tài

- Đề tài đã đề cập đến 7 nhóm ứng dụng quan trọng nhất của Sinh học
phân tử hiện nay.

- Với mỗi nhóm ứng dụng đều đã phân tích cụ thể ứng dụng ở đâu? ứng
dụng như thế nào? và ứng dụng bằng cách nào? dựa trên cơ sở nào?

Đồng thời, ở một số nhóm ứng dụng, đã có phân tích, so sánh ưu – nhược
điểm của nó với các ứng dụng khác trong cùng 1 lĩnh vực nghiên cứu. Trong
đó, đề tài cũng đã giới thiệu những vấn đề mới và hướng nghiên cứu hiện
nay.

- Đề tài đã xây dựng một số câu hỏi để củng cố, chốt kiến thức cần tiếp
cận đối với học sinh; đồng thời có nêu các câu hỏi thi học sinh giỏi Quốc gia
trong những năm gần đây về kiến thức có liên quan đến nội dung đề tài
giúp học sinh có hướng nghiên cứu bài học một cách phù hợp.

2. Đề xuất, kiến nghị

Nội dung được trình bày trong đề tài được tổng hợp chỉ bằng sự nghiên
cứu, tìm hiểu và đúc rút kinh nghiệm giảng dạy của cá nhân người viết và
45
góp ý của một số ít đồng nghiệp; vì vậy còn ít nhiều mang tính chủ quan và
chưa thật hoàn thiện. Kính mong được sự góp ý của quý thầy cô để nội dung
đề tài được đầy đủ và hoàn thiện hơn. Xin trân trọng cảm ơn!

TÓM TẮT CÁC ĐỀ MỤC

PHẦN MỞ ĐẦU

PHẦN NỘI DUNG

I. LAI PHÂN TỬ

1. Lai phân tử là gì?

2. Các phương pháp lai phân tử và ứng dụng

2.1. Phương pháp Southern blot

2.2. Phương pháp Northern blot

2.3. Lai tại chỗ

II. PCR

1. PCR là gì?

2. Quy trình PCR

3. Tối ưu hoá PCR
4. Những ứng dụng của PCR

46
4.1. Vân tay di truyền (Finger print)
4.2. Kiểm tra huyết thống
4.3. Chẩn đoán bệnh di truyền
4.4. Tách dòng gene
4.5. Gây đột biến định hướng
4.6. Phân tích mẫu ADN cổ
III. SẢN XUẤT VACXIN TÁI TỔ HỢP

1. Nhận dạng và tạo dòng các kháng nguyên có tiềm năng vacxin

2. Sản xuất vacxin

IV. SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

1. Sản xuất kháng sinh

2. Sản xuất hoocmon

2.1. Hormone sinh trưởng người (human growth hormone-HGH)

2.2. Somatostatin

3. Sản xuất kháng thể đơn dòng

3.1. Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng công nghệ ADN tái tổ hợp biểu hiện
trên Phage

3.2. Kháng thể đơn dòng trong nghiên cứu Sinh-Y

3.3. Kháng thể đơn dòng trong chẩn đoán và điều trị bệnh

4. Sản xuất insulin

5. Sản xuất interferon

6. Sản xuất interleukin

47
V. LIỆU PHÁP GEN

1. Các loại liệu pháp gen

1.1. Liệu pháp soma

1.2. Liệu pháp gen tế bào mầm

2. Các ứng dụng của liệu pháp gen trong chữa bệnh

2.1. Bệnh thiếu hụt miễn dịch phối hợp trầm trọng (severe combined
immuno deficiency-SCID)

2.1.1. Liệu pháp gen chữa bệnh ADA-SCID

2.1.2. Liệu pháp gen chữa bệnh X-SCID

2.2. Bệnh ung thư

2.3. Bệnh thiếu máu hồng cầu liềm

2.3.1. Vector liệu pháp sử dụng trong điều trị bệnh SCA

2.3.2. Các bước điều trị bệnh SCA bằng liệu pháp gen

2.4. Bệnh xơ nang

2.5. Hội chứng AIDS

VI. CHUYỂN GEN TẠO CÁC ĐỘNG, THỰC VẬT CÓ NĂNG SUẤT, CHẤT
LƯỢNG CAO

VII. CHỌN LỌC ƯU THẾ LAI

48