Gene transfer by

electroporation into
intact scutellum cells
of wheat embryos
Công Nghệ Tế Bào Thực Vật
GV: Nguyễn Trần Đông Phương

Thành viên nhóm 1:

• Nguyễn Tấn Tài
• Nguyễn Thị Mai Phong
• Lê Võ Đức Hiếu
• Vũ Thị Ánh
• Lâm Vĩ Hào
Nguồn Internet
 I. Giới thiệu
- Chuyển gen trực tiếp bằng phương pháp Electroponition hoặc PEG vào tế bào đã tạo ra
cây chuyển gen ở lúa và ngô.
-Thời gian nuôi cấy mô dài những bất thường về kiểu hình và giảm khả năng sinh sản ở
cây tái sinh.
- Bắn phá hạt có thể biến đổi tế bào của các mẫu cấy tái sinh khác nhau làm giảm thời
gian nuôi cấy mô.
- Các điều kiện kết hợp điện đã được tìm thấy giúp đưa các phân tử DNA vào các tế bào
nguyên vẹn.
- Khả năng biến đổi của các tế bào thực vật hoặc mô thực vật nguyên vẹn trước đây được
cho là phụ thuộc vào một số loại tiền xử lý tế bào (vết thương cơ học, dung dịch ưu
trương hoặc, enzym).
 II. Vật liệu
Cây lúa mì (Triticum aestivum) đã được trồng trong
nhà kính ở nhiệt độ ban ngày 18 độ C (18h) và
ban đêm 15 độ C

Cây lúa gạo (Oryza sativa, giống Indica

IR72) được trồng trong nhà kính ở nhiệt độ
ban ngày 30 độ C (12h) và nhiệt độ ban
đêm 24 độ C.

Nguồn Internet
II. Vật liệu
 DNA Plasmid:
• Sử dụng Plasmid mang cDNAs tổng hợp anthocyanin (pBC17).
Được điều kiển vùng promoters 35S CaMV
• Plasmid mang cDNA tổng hợp beta-glucuronid. Được điều kiển bởi vùng 5’
của gen Actin1 của lúa gạo.
 Thiết bị điện di Biorad Gen pulser:
• Buồng phản ứng được thiết kế để
định hướng phôi.
• Điện cực mạ vàng, điện trường 4mm.
• Xung điện dạng sóng phân rã theo cấp số nhân. Nguồn: Internet
III. Phương pháp

 Cắt phôi:

khử với ethanol 70%, 5 phút

Bông con lúa mì phôi hơi mờ

8-10 ngày sau khi thụ phấn

cắt trong môi trường vô trùng

trải trên MS (bổ sung 500 mg/ L glutamine,

thủy phân casein 100 mg/ L, 2,0mg/ L 2,4-D chứa
0,8% agarose và 12% sucrose).
 III. Phương pháp

Định hướng phôi:

Bố trí theo ngẫu nhiên và có định hướng.
Nguồn: Bài báo
- Ngẫu nhiên: Đưa phôi vào buồng điện di
và được lót bằng khối agarose nhỏ.
- Có định hướng: Đưa phôi vào buồng điện
di sao cho scutellum hoặc coleoptile hướng
về phía cực âm. Được cố định bằng 1 giọt
alginate 4% trên khối agarose nhỏ bán rắn.
Nguồn Internet
III. Phương pháp
 Điện di phôi
- Buồng điện di chứa đầy đệm.
- Plasmid DNA, phôi.
- Một xung điện phóng ra từ tụ điện 960-uF.
- Lấy các phôi ra và rửa trong 1 phút MS (3% sucrose).
- Đặt trên MS (3% sucrose và 0,8% agarose) và ủ tại 26oC.
 Tối ưu hóa sức mạnh của dòng điện:
-Phôi được điện di với DNA plasmid (pBC17) là (50 ug / ml)
và CĐDĐ (125 -> 425 V/cm)
III. Phương pháp
 Kiểm tra ảnh hưởng của nồng độ DNA:
- Phôi được điện di với I =275 V/cm và plasmid DNA (pBC17)
(1-100 ug/ ml).
 Kiểm tra cường độ thẩm thấu của bộ đệm:
- Kiểm tra ảnh hưởng của nồng độ mannitol trong bộ đệm: biến nạp
phôi định hướng với I = 275 V/cm và DNA plasmid (pBC17)
(50 ug / ml).
- Cường độ thẩm thấu được thay đổi từ 0,2M -> 0,8M mannitol.
III. Phương pháp
khử 5% Ca(ClO)2 , 40 phút
Bông con lúa gạo Phôi
rửa 3 lần nước cất vô trùng

8-14 ngày sau khi thụ phấn (chiều dài 1 mm)

cắt trong môi trường vô trùng

trải trên MS (2,0 mg/L 2,4-D chứa 0,8% agarose

và 13% sucrose)

- Phôi lúa gạo được bố trí định hướng phôi và điện di phôi như phôi lúa mì.
 III. Phương pháp
 Xét nghiệm GUS:
- 36h sau khi điện di
- Phôi được ngâm trong dung dịch nhuộm( 0,1M K/NaPO4 pH 7,
10mM EDTA, 5 mM ferrieyanide, 5 mM ferrocyanide, 0,1% Triton)
- Ủ trong 37 độ C / 24h.
IV. Kết quả
• Số lượng tế bào biến nạp cao
nhất được thấy với các xung điện
là 225-325 V/cm.
• Số lượng tế bào biến nạp tăng
tuyến tính với nồng độ DNA.
• Cường độ thẩm thấu của bộ đệm
là không có ảnh hưởng đến số
lượng tế bào được biến nạp.
IV. Kết quả
• Tế bào được biến nạp sẽ tích lũy anthocyanin trong không bào.
• Tế bào tích lũy anthocyanin được đếm 24 giờ sau khi điện di dưới kính
hiển vi có độ phóng đại 40X.
• Mỗi tế bào màu đỏ được tính là 1 sự biến nạp.
• Số lượng tế bào biến nạp tăng cho đến ít nhất 24 giờ sau khi điện di.
IV. Kết quả

• Sự chuyển nạp của các tế bào

biểu bì với pBC17 đã tạo ra hơn
100 tế bào biến nạp trong một số
phôi.
IV. Kết quả

- Các tế bào biểu bì tích tụ

anthocyanin thường cho thấy màu
không đồng đều vì không bào của
chúng nhỏ và tách biệt với nhau.
Cường độ nhuộm màu thay
đổi rất nhiều từ tế bào này sang tế
bào khác.
IV. Kết quả
- Các tế bào biểu thị chất đánh dấu
thực sự đã nhận được DNA ngoại lai
vì quan sát thấy các tế bào nhuộm
màu bị cô lập trong mô được bao
quanh bởi các tế bào hoàn toàn âm
tính.
Loại trừ sự khuếch tán của các
sản phẩm phản ứng hoặc tín hiệu từ
tế bào này sang tế bào khác.
IV. Kết quả

- Các khu vực tế bào nhuộm màu

đã được quan sát một vài ngày sau
khi biến đổi.
- Chỉ sau một ngày các tế bào
nhuộm màu đơn lẻ đã được tìm
thấy => Các tế bào biến đổi tồn tại
trong quá trình điện di.
IV. Kết quả

• Phôi lúa mì đồng biến đổi với

plasmid pBC 17 và pAct1-D (50
μg/ml) dẫn đến sự tích tụ
anthocyanin và nhuộm GUS dương
tính trong các tế bào biểu bì riêng
lẻ.
• Trong số hai plasmid được sử dụng,
số lượng tế bào biến đổi với pBC17
cao hơn so với pAct1.
IV. Kết quả
 Định hướng của phôi trong buồng điện di:
- Phôi định hướng ngẫu nhiên trong buồn điện di được phát hiện có
nhiều tế bào biến đổi trong biểu bì hơn so với các mô khác.
- Đặt phôi ở điện cực dương với mặt lá bao mầm đối diện với điện cực
âm => 3 tế bào trên phôi thấy anthocyanin.
- Cố định phôi với phía biểu bì đối diện với điện cực âm đã làm số
lượng tế bào được biến đổi tăng gấp bảy lần.
IV. Kết quả
IV. Kết quả
V. Thảo luận:
 Chuyển gen mà không làm tổn thương mô trước khi điện di:
- Thấy biểu hiện GUS thoáng qua khi chuyển gen bằng điện di vào các
tế bào nguyên vẹn của cây lúa.
- Các điều kiện điện di bao gồm vết thương của mô, bằng cách cắt hoặc
xử lý bằng enzym.
- Tiền xử lý này không cần thiết để chuyển DNA plasmid qua thành tế
bào.
- Có thể dùng tiền xử lý trong vài trường hợp.
V. Thảo luận:
 Tính nhạy cảm khác nhau của các mô đối với chuyển gen bằng
điện di:
- Sự phân bố của các tế bào đã biến đổi trong lớp biểu bì của phôi lúa
mì thay đổi từ phôi này sang phôi khác.
- Toàn bộ tế bào lớp biểu bì nhạy cảm hơn nhiều so với các tế bào
khác của phôi lúa mì.
- Trái ngược với những phát hiện này với phôi lúa mì, một đặc tính
mô khác đã được tìm thấy trong phôi lúa gạo.