Cột silica - hạt _x001D_

Ly giải tế bào

Buffer ly giải

- vật lý : nghiễn mẫu

- hóa học:

+ tách chiết DNA: SDS, Proteinase K

+ tách chiết RNA: SDS, Proteinase K, guanidium thicocyanate

=> Loại bỏ protein, lipid ra khỏi màng tế bào

Quá trình gắn

muối chaotropic hỗ trợ gắn acid nucleic lên màng

ly tâm -> loại bỏ tạp nhiễm

Ethanol nồng độ cao -> bổ sung hỗ trợ gắn tế bào đạt chất lượng tốt hơn.

Quá trình rửa

rửa lần 1: có 1 lượng nhỏ muối chaotropic nhằm loại bỏ protein, lipid và

các chất màu.

rửa lần 2: ethanol 70% để loại bỏ muối và các thành phần còn sót lại.

Làm khô cột

Ly tâm để là làm khô cột (hạt từ). Việc này giúp loại bỏ ethanol,

protein,pipid còn sót lại và cần thiết để quá trình rửa giải được tốt hơn.

Quá trình rửa giải (Elution)

thu nhận DNA hoặc RNA tinh sạch, Dung dịch ly giải EB
PCR

PCR Sao mã
Xảy ra ngoài tế bào Xảy ra trong tế bào

Dùng nhiệt độ để tách DNA Dùng enzyme helicase để tách

DNA
2 enzyme chịu nhiệt được sử dụng ở 37oC
7XoC
2 mồi: Xuôi + Ngược 1 mồi
Bản chất mồi là DNA Bản chất mồi là RNA

Taq Pfu
Thu từ Thermus aquaticus Thu từ Pyrococcus
72oC 75oC
3-5’ không Có
5-3’ có không
Sản phẩm: đầu lệch A ở vị trí đầu 3’ Sản phẩm đầu bằng
Hoạt tính sửa sai Exonuclease

- Tris HCl: dung dịch đệm và điều chỉnh pH

- MgCl2 (Mg2+) : Là Cofactor hoạt hóa enzyme

KCl: kích thích enzyme bám trên khuôn lâu hơn

 Thành phần:

DNA template( DNA bản mẫu)

 Forward and reverse primer (mồi xuôi và mồi ngược)

Buffer

MgCl2

dNTP

Taq polymerase (Enzyme polymerase chịu nhiệt )

Mẫu dò TaqMan

Thiết bị Real-time PCR

Agar Agarose

Tách chiết Được tách chiết từ tảo đỏ Thu được bằng cách tinh chế thêm
agar

Thành Agarose và Agaropectin Agarobiose

phần

Công dụng Dùng làm thạch nuôi cấy vi Dùng trong điện di
khuẩn

multiplex real-time PCR:

1. Thiết kế mồi / đầu dò ghép kênh

Chương trình: PrimerPôler, PrimerPlex và Primer3

- 5’ Flourescein amidites(AFM) 3’ lỗ đen chất khử-1 (BHQ-1) : gen

RdRp của virus

- 5’hexa-chloro-lflurecein(HEX) 3’BHQ-1 : gen E của virus

- Một mẫu dò 5’ cacboxyr-hodamine(ROX) 3’ BHQ-2 : gen RP của

người
2. Phân lập ARN

RNA của virus được chiết xuất từ gạc mũi họng, sử dụng Viral DNA

mini kit

3. Phản ứng rRT-PCR

10X buffer, DNTPs, Uracil-DNAglycosylase(UDG),VitaTaq1HS

polymerase,VitaScript1 Enzymemix including M-MLV, Triton X-100,

RNase/DNase-free ddH2O

4. Phiên mã ngược ở 45 ̊C trong 5 phút

5. Biến tính ở 95 ̊C trong 30 giây

6. 40 chu kỳ biến tính ở 95 ̊C trong 5 giây + khuếch đại ở 60 ̊C trong 30

giây

Pyrosequencing (Phương pháp pyro xa để phát hiện nhanh

khả năng kháng bệnh Lao ở các mẫu phân lập lâm sàng và
mẫu Đờm):
1. Nguồn phân lập lâm sàng và mẫu đờm

2. Xử lý mẫu bệnh phẩm và trích xuất DNA bộ gen

- từng mẫu đờm được khử nhiễm bằng một lượng tương đương NaOH

2% và NACLC 0,5%, trùn hòa bằng dung dịch đệm phosphate(pH 6,8) ->

ly tâm
- cặn được xử lý được rửa 1 lần bằng đd NaCl 0.9% vô trùng và hòa tan

lại trong 1ml dd NaCl 0.9% vô trùng

Dịch chiết _> chiết DNA đã bị bất hoạt -> ly giải

3. Thiết kế mồi và khuếch đại PCR

- rpoB, katG,embB,rrs,gyrA và rpsl khuếch đại bằng PCR thông thường

- phần mềm thiết kế xét nghiệm PSQ

- Hóa chất: PCR buffer, deoxynucleotide triphosphateas, taq DNA

poluymerase, mồi, DNA

- Điều kiện chu kỳ nhiệt: 95oC trong 30p -> 50ck trong 30s ở 95oC ->

30s ở to ủ tương ứng -> 30s ở 72oC -> độ giãn dài cuối cùng ở 72oC

trong 10p

4. Giao thức của pyro sequencing

- sản phẩm khuếch đại PCR được cố định trên hạt sepharose phủ

streptavidin được chuyển đổi thành mẫu DNA sợi đơn và được tinh chế

bằng công cụ chuẩn bị chân không

- một đoạn mồi trình tự sau đó đã được ủ vào mẫu. Quá trình tạo pyro

được thực hiện trong một thiết bị Pyro-Mark 96MA tự động theo hướng

dẫn của nhà sản xuất

- Để phát hiện chế độ SQA, thuốc thử PyroMark Gold Q96 SQA (Qiagen,

972812) và phân phối nucleotide theo chu kỳ đã được sử dụng

Đối với chế độ SNP, kết quả kiểu gen thu được trực tiếp bằng cách sử

dụng thuốc thử PyroMark Gold Q96 (Qiagen, 972812)

ELISA COVID:
Trong thiết kế của một LFA có 6 thành phần chính :
- Tấm nền để hỗ trợ,
- Tấm đệm mẫu
- Tấm đệm liên hợp
- Màng nitro xenlulo có chứa kháng thể được neo
- Tấm hấp thụ
- Các hạt nano vàng liên hợp phân tử sinh học (AuNPs)
Cơ chế
- Kháng thể lưu hành trong cơ thể, do các tế bào miễn dịch tạo ra.
- Kháng thể sẽ gắn với tác nhân lạ như vi khuẩn hoặc vi-rút (kháng nguyên)
khi nó xâm nhập vào cơ thể để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các
tác nhân lạ này.
- Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện một kháng nguyên duy nhất.
- Kháng thể có 5 lớp là IgM, IgG, IgA, IgD, IgE, nhưng các phản ứng miễn
dịch thông thường, ta thường nói về IgM và IgG.
Quy trình
1. Tấm mẫu nhận mẫu và hoạt động như một bộ lọc để hỗ trợ dòng chảy. Một số
miếng đệm mẫu được xử lý để điều chỉnh các thuộc tính của mẫu.
2. Tại miếng liên hợp, mẫu bù nước cho các kháng thể liên hợp vàng trên miếng liên
hợp và các mục tiêu liên kết với kháng thể phù hợp của chúng.
3. Mẫu tiếp tục chảy dọc theo màng nitrocellulose bằng hoạt động mao dẫn.
4. Các vạch kiểm tra và vạch kiểm soát chứa thuốc thử bắt giữ để hiển thị kết quả.
5. Đường kiểm soát trực quan cho biết thử nghiệm đã chạy chính xác.
6. Tại vạch thử nghiệm, kháng thể được đánh dấu bằng vàng nhận ra một phần duy
nhất của phân tử đích, được gọi là epitope, và quá trình gắn kết diễn ra.
LACTOSE INTOLERANCE:
1. Xây dựng thư viện bộ gen và nhân bản gen

Mục đích của sự tạo dòng:

- Thiết lập thư viện bộ gen
- Sản xuất protein,enzyme
- Sản xuất vaccine
- Sản xuất kháng siinh
Để xây dựng thư viện bộ gen:
+ Cắt DNA nhiễm sắc thể
+ Ly tâm để tách các đoạn DNA ’ bằng điện biến nạp.
+ Các chất biến đổi được nuôi cấy thành các khuẩn lạc đơn lẻ trên đĩa thạch LB
có chứa ampicillin và tetracyclin
+ 5-bromo-4-cloro-3indolyl-B-D galactopyranoside (X-gal), dung dịch đệm Z
(0,1 M sodium phosphat, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4, 5 mM mer captoetanol:
điều chỉnh pH đến 7,0 )
+ Các khuẩn lạc chuyển sang màu xanh lam được coi là các dòng dương tính
thể hiện hoạt tính của enzym chịu nhiệt. Các khuẩn lạc xanh chết được nhặt và
biến đổi thành E. coli TOP10F 'tươi để chuẩn bị plasmid dòng vô tính.
2. Trình tự DNA và phân tích gen
- Trình tự nucleotide của đoạn DNA xác định bằng cách sử dụng hệ thống giải
trình tự huỳnh quang và mồi tổng hợp đặc hiệu cho dòng vô tính. Mỗi loại
dideoxynucleotide được đánh dấu bằng fluochrome có màu khác nhau.
- Thành phần chính:
+ DNA mẫu
+ Dung dịch đệm
+ Mồi xuôi và mồi ngược đặc hiệu cho đoạn cần nhân bản
+ Enzyme polymerase chịu nhiệt
+ 4 loai deoxynucleotide
+ 4 loại dideoxynucleotide (dNTP) có gắn màu huỳnh quang khác nhau. ( mỗi
loài gắn một màu riêng biệt )
- Tiến hành PCR:
+ Giai đoạn biến tính: Phân tử DNA mẫu bị biến tính ở nhiệt độ cao từ 94-95C
trong vòng 30s đến 1 phút => ADN kép bị bẻ gãy các liên kết hydro giữa 2
mạch tạo thành ADN sợi đơn.
+ Giai đoạn bắt cặp mồi: Nhiệt độ hạ thấp từ 40-70C cho phép mồi gắn vào các
phân tử ADN sợi đơn, đánh dấu phần DNA cần được khuyếch đại.
+ Giai đoạn kéo dài: Kéo dài chuỗi polynucleotide ở 72C, khoảng 25 chu kì,
giữ PCR ở 45C trong 10 phútt hoặc để qua đêm
3. Biểu hiện quá mức và tinh sạch β-glycosidase tái tổ hợp
- Biểu hiện DNA:
- khuếch đại PCR của tat B-gly với hai mồi tổng hợp: TatglyF
(5'TTCATATGGACGATCACGCCGA-AAAGTTCC3') và TatglyR
(5'TTGTCGACGGTCTG GGCC CGCGCG3')
+ Dòng hoá sản phẩm PCR thu được vào vectơ pGEM-T Easy.
+ Sản phẩm sau PCR được cắt bởi Ndel và Sall và được liên kết với PET21b
(+) giữa các vị trí Ndel và Xhol.
=> Kết quả là plasmid pExtatẞ-gly được biến nạp thành E. coli BL21 (DE3)
- Tinh sạch B-glycosidase
+ Nuôi cấy vi khuẩn E.coli BL21 trong 150ml LB có chứa ampicillin ( Ampicilin
tác động vào quá trình nhân lên của vi khuẩn, ức chế sự tổng hợp mucopeptid của thành
ở 37C theo phương pháp hiếu khí, sau đó thêm 1mM nồng độ
tế bào vi khuẩn.)
dung dịch IPTG ( : IPTG là chất cảm ứng biểu hiện protein hiệu quả) nuôi cấy thêm
trong 6 giờ.
=> cho phép xác định các khuẩn lạc đã được biến nạp với plasmid tái tổ hợp
+ ly tâm dịch và các hạt tế bào được hoà tan với 10ml “Binding buffer” (5mM
imidazole, 500mM NaCl 20mM, 20nM Tris-HCl, pH 7,9) dung dịch huyền phù
được đem đi phá vỡ tế bào bằng sóng âm ở 200Hz
+ Dịch tế bào được ly tâm và phần nổi phía trên được ngâm trong nồi cách thủy
75 ° C trong 30 phút. Các protein biến tính nhiệt từ E. coli được loại bỏ bằng
cách ly tâm
+ Đem lọc phần cặn nổi phía trên cột nhựa liên kết Ni2+ ái lực-His
+ Sau khi nạp mẫu, cột được rửa bằng 15 ml (đệm liên kết chứa 60 mM
imidazole), sau đó “ washing buffer” được rửa giải với 15 ml ‘” eluting
bufer”'(đệm liên kết chứa imidazole 1M). Giữa các phân đoạn đã rửa giải,
phân đoạn chứa nồng độ protein cao nhất được thu thập và được đưa vào cột
Centriplus ở 3000 × g trong 120 phút để khử muối và cô đặc enzym.
4. Phân tích điện di và xét nghiệm protein
Phương pháp điện di: Điện di trên gel polyacrylamide natri dodecyl sulfat
(SDS-PAGE) và điện di không biến tính
- sử dụng 4,0% (w / v) acrylamide để xếp gel (pH 6,8) và 7,5% (w / v) để tách
gel (pH 8,8)
- Các dải protein được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R-250. X-gal
trong đệm Z (l – 1,5 mg / ml) được sử dụng để xét nghiệm zymogram (nhuộm
hoạt tính) ở 70℃ .
- Các protein được sử dụng làm chất đánh dấu tiêu chuẩn là: => kiểm tra
hoạt tính
+ sữa bò - lactalbumin (14.200 Da)
+ Anhydrase carbonic hồng cầu bò (29.000 Da)
+ Albumin trứng gà (45.000 Da)
+ Albumin huyết thanh bò (monomer: 66.000 Da; dimer: 132.000 Da)
+ jack urease đậu (272.000: trimer; 545.000: hexamer).
=> Nồng độ protein được đo bằng phương pháp Bradford sử dụng bộ xét
nghiệm protein với albumin huyết thanh bò làm chất chuẩn.
* Phương pháp Bradford: nguyên tác là dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu
cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein
5. Xét nghiệm enzym và xác định các thông số động học
- Hoạt tính Tat B-glycosidase được đo bằng lượng p-nitrophenol được giải
phóng từ 1mM p-nitrophenyl-B-D-galatoside hoặc p-nitrophenyl-D-glucoside
trong 1 ml dung dịch đệm Z ở 70℃ trong 15 phút sử dụng lượng enzyme tinh
khiết thích hợp.
- Ngừng phản ứng enzym bằng cách thêm 1 ml hỗn hợp phản ứng Na2CO3 1
M và độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 405 nm bằng máy quang phổ UV sau
đó chuyển hóa thành lượng p-nitrophenol bằng đường chuẩn.
- Hoạt độ của enzyme đối với lactose được thử nghiệm trong điều kiện tương
tự như mô tả ở trên với nồng độ cơ chất thích hợp. Lượng glucose giải phóng
được đo bằng phương pháp glucose oxidase-peroxidase sử dụng bộ kit Glucose
C-II ở bước sóng 505 nm.
- Các thông số động học (Km và Vmax) được tính toán từ các đồ thị
Lineweaver – Burk bằng cách sử dụng các nồng độ khác nhau của chất nền.
( Khoảng nồng độ cơ chất được sử dụng là 0,01–5 mM đối với pNPGlc, 1–25
mM đối với pNPGal và 10–250 mM đối với lactose hoặc cellobiose. )
- Tất cả các thí nghiệm được thực hiện ở 70℃ và pH 7.0

6. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính của enzim

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme: được xác định ở nhiệt độ
dao động từ 30℃ đến 95℃ trong đệm Z. Tính ổn định nhiệt của enzym được
đánh giá bằng cách ủ enzym ở 70℃ , 80℃ hoặc 90℃ trong dung dịch đệm Z,
và bằng cách vẽ các khoảng thời gian để đo hoạt tính còn lại ở 70℃ .
- Sự phụ thuộc vào pH của hoạt tính β-gly tat: dược xác định ở 70℃ trong
một loạt các chất đệm. Các bộ đệm được sử dụng là đệm natri xitrat-photphat
(50 mM) từ pH 3,0 đến 5,5, đệm natri photphat (50 mM) từ pH 5,5 đến 7,5, và
đệm axit boric-borax (50 mM) từ 7,5 đến 9,0.
(SX Chymosin Bò tái tổ hợp có hoạt tính sinh học trong cây thuốc lá)
1. Materials:
*CYM- gen mã hóa preprochymosin từ bò
*Cây thuốc lá
*Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
*Các thành phần phục vụ trong chuyển gen; Môi trường nuôi cấy; Thiết
bị và hóa chất thực hiện...
2. Methods:
CYM- gen mã hóa prerochymosin từ bò, được đưa vào bộ gen của cây
thuốc lá dưới sự kiểm soát của promoter 35S của virus khảm súp lơ
(CaMV 35S). Sự tích hợp và phiên mã của gen ngoại lai đã được xác
nhận tương ứng với phân tích Southern blotting và ngược phiên mã
PCR (RT-PCR). định lượng bằng xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết
với enzym (ELISA).
PROSESS: Tạo vecto  Tạo cây thuốc lá chuyển gen  Phân tích
mức độ biểu hiện của gen (bằng pp PCR và Southern)  Phân tích
mức độ biểu hiện của protein (bằng pp miễn dịch và ELISA)  Kiểm
tra, đánh giá hoạt tính của enzym

2.1. Tạo vecto (Vector Construction):

 Kết quả của bước này là tạo ra vecto biểu hiện prerochymosin
(p33cym11) và sau đó được chuyển sang chủng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens.
Vectơ biểu hiện chứa gen prerochymosin từ bò
Vectơ được giải trình tự và sau đó được chuyển sang chủng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens EHA105 thông qua phương pháp đông
lạnh/rã đông.
Trong hình, gen preprochymosin (CYM) được điều khiển bởi promoter
35S của virus khảm súp lơ (CaMV 35S) và trình kết thúc của gen
nopaline synthase (Nos). Trong vectơ, có một gen phosphinothricin
acetyltransferase, quy định tính kháng glufosinate, được sử dụng làm
chất đánh dấu có thể lựa chọn trong thuốc lá.
CaMV 35S: Bất kì 1 gen nào muốn biểu hiện thì phải có promoter điều
khiển quá trình phiên mã và dịch mã của gen đó. Promoter thường
được sử dụng phổ biến nhất là CaMV35s (từ Cauliflower Moisac Virus).
Đây là promoter mạnh có chứa trình tự tăng cường Enhancer giúp thúc
đẩy quá trình phiên mã, dịch mã diễn ra nhanh hơn.
Nos polyA: Terminator là trình tự kết thúc
Gen GUS: Gen chỉ thị giúp nhận biết được thể chuyển gen và xác định
sự biểu hiện tạm thời của gen ngoại lai. Gen chỉ thị thường được sử
dụng là gen GUS mã hóa cho enzyme β-glucuronidase.
2. Chuyển đổi cây thuốc lá và tạo ra thuốc lá chuyển gen (Tobacco
Transformation and Generation of Transgenic Tobacco):
 Kết quả của bước này là chuyển vecto biểu hiện prerochymosin
(p33cym11) vào cây thuốc lá thông qua quá trình biến nạp qua VK
Agrobacterium sau đó được nuôi cấy và phát triển một cách bình
thường thành cây thuốc lá chứa gen biểu hiện prerochymosin.
2.3. Phân tích phân tử (Molecular Analysis): phân tích phân tử từ
đoạn gen
DNA bộ gen được chiết xuất từ thực vật kháng glufosinate để thực hiện
các phân tích phân tử.
2.3.1. Phân tích PCR và Southern Blotting: (để xem xét mức độ biểu
hiện của gen)
DNA bộ gen được chiết xuất từ các cây tái sinh kháng thuốc và được
sử dụng làm tiêu bản để thực hiện phản ứng PCR nhằm xác nhận sự
tồn tại của gen preprochymosin trong bộ gen thuốc lá. DNA từ cây
dại được dùng như một đối chứng âm tính. Các đoạn mồi là cymdF và
cymdR.
Các cây dương tính với PCR được phân tích thêm thông qua phương
pháp Southern Blotting. Phương pháp lai Southern blotting là phương
pháp lai giữa DNA của tế bào với mẫu dò DNA, nhằm chuyển DNA
từ gel lên màng lai. Phương pháp này cho phép nghiên cứu DNA
của bộ gen, kiểm tra kết quả chuyển gen hoặc kiểm tra sự có mặt
của một gen nào đó trong bộ gen của tế bào.
Nguyên tắc: chuyển các đoạn DNA (của cây chuyển gen) phân tách
bằng điện phân sang màng lai và phát hiện các mảnh DNA của cây lai
bằng phương pháp thăm dò.
2.3.2. Phân tích RT-PCR (RT-PCR Analyses): (xem xét mức độ biểu
hiện của RNA)
 Kết quả RT-PCR chỉ ra rằng gen CYM đã được phiên mã ở tất cả
các cây được thử nghiệm, nhưng dường như không có mối liên hệ nào
giữa mức phiên mã và số bản sao được chèn vào.
2.4. Phân tích miễn dịch và phân tích ELISA: (xem xét mức độ biểu
hiện của protein)
Immunoblotting and ELISA Analyses: để xem xét mức độ biểu hiện
của protein
Lá trưởng thành của cây T1 được thu thập để chiết xuất tổng số protein
hòa tan (TSP).
Kiểm tra miễn dịch để xác nhận sự biểu hiện thành công của
chymosin bò trong TSP chiết xuất từ thực vật.
Kiểm tra miễn dịch là phương pháp sử dụng các kháng thể để xác định
các protein mục tiêu thông qua các phản ứng đặc hiệu giữa kháng
nguyên-kháng thể. 
Cùng một TSP đã được sử dụng để thực hiện phân tích ELISA với
cùng một kháng thể chính chống lại chymosin của bò. Phân tích định
lượng bằng ELISA để xem mức độ biểu hiện của TSP.
2.5. Bioactivity Detection of Recombinant Bovine Chymosin: để
kiểm tra, đánh giá hoạt tính của enzym
 Sử dụng phương pháp thử nghiệm đông tụ sữa để phát hiện hoạt
tính sinh học của chymosin bò tái tổ hợp từ cây thuốc lá có còn hoạt
động hay không.
CaCl2: làm tăng khả năng đông tụ và tách protein nhũ thanh. Ngoài ra
còn giúp quá trình đông tụ diễn ra nhanh hơn, tăng cấu trúc và độ cứng
của khối đông.
 Theo kết quả, chymosin được chiết xuất từ lá thuốc lá thể hiện
hoạt động đông tụ sữa, điều này ngụ ý rằng enzyme đã được
kích hoạt trong mô thực vật.
Phân lập, tinh sạch, tạo dòng gen và biểu hiện protein kháng nấm từ vi
khuẩn Bacillus amyloliquefaciens MG-3
1.Chuẩn bị vi sinh vật và môi trường
-Vi khuẩn B.amyloliquefaciens MG-3 được phân lập từ cây xoài và nuôi cấy
trong môi trường Luria-Bertani.(LB).
-Các chủng nấm gây bệnh (C. acutatum, Alternaria tenuissima, Pestalotiopsis
mangiferae và Fusarium subglutinans) được phân lập từ trái sơn trà thối và nuôi
cấy trong môi trường Potato Dextrose Agar (PDA).
- Vi khuẩn E.coli BL21 (DE3) và plasmid pET28a được sử dụng để tái tổ hợp
gen protease.
2. Thử nghiệm kháng nấm và thử nghiệm trái cây
2.1. Kiểm tra tính kháng nấm:
-Sợi nấm cắt từ mẫu nuôi cấy đặt ở tâm đĩa petri chứa môi trường PDA.
-Tạo 3 giếng xung quanh cách sợi nấm 2 cm.
-100 microliter protein kháng nấm-dung dịch đệm PBS được thêm vào mỗi
giếng và PBS (20 mmol/L, pH 7,4) được sử dụng làm đối chứng với thể tích
tương đương.
-Các đĩa petri được ủ ở nhiệt độ 28 o C .
2.2. Thử nghiệm trên trái cây
-trái sơn trà sau thu hoạch được chọn ngẫu nhiên.
-Hỗn hợp protein kháng nấm và đệm được phun trực tiếp lên quả và mẫu quả
đối chứng được phun dung dịch đệm.
-Các mẫu sau khi xử lý thì sẽ được bảo quản trong tủ ấm.
3. Tinh sạch protein kháng nấm từ B. amyloliquefaciens MG-3
3.1. Chiết xuất protein kháng nấm.
-B.amyloliquefaciens MG-3 pha loãng trong môi trường LB được ủ để lên men
trong điều kiện phù hợp, rồi sau đó ly tâm thu dịch nổi.
-kết tủa Protein thô từ dịch nổi bằng cách thêm (NH 4 ) 2 SO 4 sau đó bảo
quản ở nhiệt độ 4 o C.
3.2. Phân lập và tinh chế protein
- Protein thô được lọc và sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion để tách
thành các protein riêng biệt từ protein thô.
-Mỗi protein thu được sẽ kiểm tra tính kháng nấm.
-protein kháng nấm được phân tích bởi sds-page và sắc ký trao đổi ion một lần
nữa để tinh sạch.
3.3. Phân tích khối phổ và xác định hoạt tính của protease:
- Dải tương ứng với protein kháng nấm được cắt ra từ SDS-PAGE và được sử
dụng để xác định các đơn phân peptit bằng phương pháp khối phổ (MALDI-
TOF-MS)
- Hoạt tính enzym của mẫu được đo bằng quang phổ UV tại mỗi bước phân lập
và tinh chế protein.
-Hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Bradford
4.Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và protease K đối với protein serine.
-Nhiệt độ: protein mục tiêu được hòa tan trong PBS ở nhiệt độ từ 0 o C đến 100
o C, t= 30 phút.
-pH: Mẫu được ủ ở 37 o C , t=4h, pH dao động từ 5 đến 11.
-protease K: hỗn hợp protease và protein kháng nấm (200:1) được ủ ở 37 o C,
t= 0-20 phút.
5. Nhân bản gen, biểu hiện và tinh sạch MG-3A
5.1.Phân tử, tách dòng gen MG-34A.
-DNA mã hóa serine protease được chiết xuất từ chủng B.amyloliquefaciens
MG-3
-DNA mục tiêu sau đó được khuếch đại bằng PCR.
-Sản phẩm PCR sẽ được gắn vào vector pMD18-T tạo thành plasmid tái tổ hợp
pMD18-T-MG-3A.
- Biến nạp pMD18-T-MG-3A vào E.coli DH5a để giải trình tự gen.
5.2.Xây dựng pET28a-MG-3A tái tổ hợp.
- pMD18-T-MG-3A được sử lý bằng enzyme cắt giới hạn và được gắn vào
pET28a tạo thành pET28a-MG-3A.
- pET28a-MG-3A được tải nạp vào E.coli BL21 cho quá trình biểu hiện gen.
-E.coli được sàng lọc trên đĩa thạch LB chứa 50 g/l kanamycin.
5.3. Xét nghiệm tinh chế protein MG-3A
- E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp được nuôi cấy trong môi trường LB chứa 50
g/L kanamycin trong điều kiện thích hợp. Biểu hiện gen được gây ra ở toC= 37
◦C trong isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) với nồng độ cuối là 0,5
mmol/L trong 8 giờ. Các tế bào sẽ được thu thập và xử lý để lấy protein tái tổ
hợp.
-Protein tái tổ hợp MG-3A được tinh sạch bằng sắc ký ái lực và sau đó được
phân tích bằng điện di trên gel natri dodecyl sulfate–polyacrylamide (SDS-
PAGE). Protein mục tiêu sau tinh khiết sẽ được hòa tan trong dung dịch đệm.
-Đánh giá hoạt tính kháng nấm.

6. Phân tích thống kê

- Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần
- Dữ liệu được xử lý bằng Origin 8.5 và được biểu diễn dưới dạng: trung bình ±
sai số chuẩn.
-Xác định Ý nghĩa thống kê bằng phương pháp ANOVA sử dụng SPSS 17.0.
- Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi P<0,05.

● Luria-Bertani : LB.
● Potato Dextrose Agar: PDA .
● Dung dịch đệm phosphat: PBS.
● Phương pháp MALDI-TOF-MS.
● Điện di trên gel polyacrylamide-natri dodecyl sulfate : SDS-PAGE.(Dùng để
điện di protein=>Dùng để xác định phân tử khối)
TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN NLPA NHẰM ĐỊNH HƯỚNG PHÁT
TRIỂN VẮC-XIN DNA CHỐNG LẠI ACINETOBACTER BAUMANNII
a. Nguyên liệu: Chủng Acinetobacter baumannii và Escherichia
coliTOP10F
IgM là kháng thể đầu tiên được hình thành sau khi tiếp xúc với kháng
nguyên mới

IgG là Yg đầu tiên được sản sinh sau khi tiếp xúc với kháng nguyên
(phản ứng miễn dịch thứ phát) và là isotype nổi bật chứa trong các
sản phẩm game-globulin thương mại. IgG bảo vệ chống lại vi khuẩn,
virut và chất độc

Cytokine là những protein nhỏ rất quan trọng trong việc kiểm soát sự
tăng trưởng và hoạt động của các tế bào hệ thống miễn dịch và tế
bào máu khác. Khi được phát hành, họ báo hiệu hệ thống miễn dịch
để thực hiện công việc của mình. Các cytokine ảnh hưởng đến sự
phát triển của tất cả các tế bào máu và các tế bào khác giúp các phản
ứng miễn dịch và viêm của cơ thể

tế bào bạch cầu giải phóng quá mức Cytokine khi có vi sinh vật xâm
nhập vào cơ thể, dẫn tới các phản ứng viêm toàn thân. Khi tiết ra quá
nhiều Cytokine thì càng huy động nhiều bạch cầu đến và Cytokine lại
càng được tiết ra nhiều; làm cho các tế bào bạch cầu không thể nhận
diện được tế bào lành và tế bào bị tấn công; vì thế tiêu diệt luôn cả tế
bào lành làm cơ thể bị tổn thương rất nhanh

CLONING AND EXPRESSION OF NLPA GENE AS DNA VACCINE

CANDIDATE AGAINST ACINETOBACTER BAUMANNII:

I. DNA EXTRACTION AND GENE AMPLIFICATION (CHIẾT XUẤT

DNA VÀ KHUẾCH ĐẠI GEN)

1. DNA được tách chiết từ A. baumannii bằng QIAamp® DNA Mini

Kit.

2. Chất lượng DNA được phân tích bằng điện di.

3. Xác định nồng độ và chất lượng DNA bằng máy quang phổ ở bước
sóng 260/280 nm.

4. Đoạn mồi được thiết kế bởi phần mềm GeneRunner, chứa các vị
trí hạn chế KpnI và SacII trong đoạn mồi xuôi và ngược.

5. Tiến hành phản ứng PCR.

6. Sản phẩm PCR khuếch đại được phân tích bằng điện di.

II. CONSTRUCTION OF RECOMBINANT PLASMIDS (CẤU TRÚC

PLASMIDS TÁI TỔNG HỢP)

1. Các đoạn DNA tinh sạch nlpA (bộ chiết gel Qiagen) và vectơ
plasmid pTZ57R/T được ghép bằng cách sử dụng bộ nhân bản PCR-
Thermo Fisher Khoa học.

2. pTZ57R/T cộng với nlpA được biến đổi thành E. coli TOP10F′ bằng
phương pháp CaCl2.

3. Các chất biến đổi được chọn trên các đĩa thạch LB-ampicillin và
được xác nhận bằng PCR.

4. DNA plasmid tinh sạch bằng kit (Bioneer, Hàn Quốc)

5. Sự hiện diện của nlpA trong vectơ pTZ57R/T đã được nghiên cứu
bằng quá trình tiêu hóa kép của enzyme cắt giới hạn.

6. PTZ57R/T-nlpA và pEGFP-C2 tái tổ hợp đã tiêu hóa KpnI và SacII

được phân tích bằng điện di.
7. Tinh chế nlpA và pEGFP-C2 bằng bộ tách gel.

8. nlpA được gắn vào pEGFP-C2 và biến đổi thành E. coli TOP10F′.

9. Các chất biến nạp được chọn trên các đĩa thạch LB-ampicillin.

10. Xác nhận nhân bản gen bằng cách tinh sạch plasmid, phân tích
hạn chế KpnI/SacII và PCR.

11. Giải trình tự pEGFP-C2-nlpA bằng phương pháp giải trình tự

Sanger.

III. TRANSFER OF PEGFP‐C2‐NLPA INTO HDF CEL (CHUYỂN

PEGFP‐C2‐NLPA THÀNH HDF CEL)

1. Chuyển pEGFP-C2-nlpA vào các tế bào HDF bằng cách sử dụng

điện di.

2. pEGFP-C2 và PBS đã được thêm vào HDF dưới dạng đối chứng
âm tính.

IV. RT‐PCR

1. RNA tổng số được chiết xuất bằng bộ chiết RNA (Qiagen, Hoa Kỳ)
từ các tế bào HDF nuôi cấy ở trên.

2. Xác định nồng độ RNA bằng máy quang phổ ở bước sóng 260 nm.

3. Sử dụng Hệ thống tổng hợp sợi đầu tiên SuperScriptTM để tổng

hợp cDNA.

4. CDNA này đã được khuếch đại PCR với các đoạn mồi cụ thể cho
gen nlpA.

5. Tất cả các sản phẩm PCR đã được điện di.

V. SDS PAGE analysis (phân tích TRANG SDS)

1. Sau 48 giờ sau khi truyền, các tế bào được thu hoạch và ly tâm.

2. Pallet di động đã bị siêu âm phá vỡ.

3. Điện di dịch ly giải tế bào thu được trên TRANG SDS để phát hiện
protein NlpA tái tổ hợp dựa trên trọng lượng phân tử của nó.

VI. IMMUNIZATION STUDY (NGHIÊN CỨU MIỄN DỊCH)

1. Chuột (10 con mỗi nhóm) được chủng ngừa bằng cách tiêm bắp
0,33 µg/µl×3 = (100 µg/µl) vắc xin vào các ngày 0, 7, 14.

2. Điều khiển chuột nhận vector trống hoặc PBS.

3. Lấy mẫu máu và thực hiện xét nghiệm ELISA để đánh giá phản
ứng miễn dịch.

4. Mức kháng thể (IgG và IgM) và các cytokine (INFγ, IL-2, IL-4 và IL-
12) được xác định vào các ngày 0, 7, 14 và 30.

5. Thử thách với liều A. baumannii gây chết người (5×108CFU) được
thực hiện vào ngày thứ 42 và sự sống sót của mỗi nhóm được xác
định trong 7 ngày.