Vật liệu và phương pháp

1. Nhân bản gen hGH

- Gen hGH được khuếch đại từ chuỗi cDNA của người bằng phản ứng PCR, sử dụng mồi kéo dài có trình
tự 5’-gcggctagcatgttcccaaccattcccttatcc-3’ và đoạn mồi nghịch 5-gcgctcgagctagaagccacagctgccctc-3.
(đoạn nu được gạch chân, nhấn mạnh là các enzyme giới hạn NheI và XhoI)

- hGH được nhân bản thành plasmid biểu hiện pET-28b để tạo ra hGH tái tổ hợp với đánh dấu
hexahistidine và vị trí phân cắt thrombin của đầu N (His-hGH).

- Đối với hGH không được đánh dấu hexahistidine, gen cấu trúc được khuếch đại với 2 cặp mồi thuận và
nghịch lần lượt là 5’-gcgccatggcgatgttcccaaccattcccttat-3’ và 5’-gcgctcgagctagaagccacagctgccctc-3’
(enzyme giới hạn NcoI và XhoI được gạch chân nhân mạnh).

- Sản phẩm PCR hoà với NcoI và XhoI, và gắn vào trong vị trí giới hạn NcoI và XhoI của vector biểu hiện
pET-28a để sản xuất hGH tái tổ hợp mà không cần đánh dấu hexahistidine ở đầu N (hGH không đánh
dấu). Các trình tự nucleotide chèn vào được kiểm chứng bằng các trình tự tự động.

2. Phân tích, xét nghiệm độ hoà tan

- Plasmid pET28-His-hGH và pET28-hGH được chuyển vào tế bào BL21 ở E.coli để biểu hiện protein.

10mL phần dịch cấy qua đêm được bổ sung vào 500mL môi trường LB vô trùng (10g bacto tryptone, 5g
dịch chiết nấm men, và 10g NaCl mỗi lít) chưa 50ug/mL kanamycin và grown to an OD600 of about 0.6 ở
37 độ C.

- Biểu hiện của protein tái tổ hợp được hoạt hoá với 1mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside
(IPTG), các tế bào trưởng thành ở các mức nhiệt độ khác nhau. Thu nhận tế bào bằng ly tâm
6000g/20phút và tế bào lơ lửng trong dung dịch đệm ly giải (50mM Tris-HCl, pH 8, 0.5mM EDTA,
1mg/mL lysozyme) chứa hỗn hợp ức chế protease.

- Độ hoà tan của protein được kiểm nghiệm bằng cách sử dụng các chất đệm với thể tích đệm khac nhau
(tối đa 2mL cho 30mg tế bào).

- Sau khi ủ lạnh trong 30 phút, đem đi sonicated ở 200W (10 lần/10 giây). Sonicated là phương pháp
dùng sóng âm hoặc siêu âm để khuấy động các hạt trong mẫu, ở thí nghiệm này dùng để tăng tốc độ hoà
tan bằng cách phá vỡ các tương tác liên phân tử. Tiếp tục ly tâm mẫu ở 10.000g/20 phút.

- Các phân đoạn hoà tan và không hoà tan được phân tích bằng phương pháp SDS-PAGE với nhuộm
Coomassie Blue. Coomassie Blue là thuốc nhuộm màu xanh dương với phương pháp nhuộm nhanh
chóng và đơn giản để phát hiện sự xuất hiện của protein khi điện di trên gel polyacrylamide.

- Nồng độ protein được định lượng bằng phần mềm phân tích ImageQuantTM TL 5.2 sau khi gel được
scan trên máy quét V799.

- Các giá trị trung bình từ ít nhất 3 lần thí nghiệm độc lập được ghi nhận và vẽ đồ thị, ngoại trừ cảm ứng
ở 37 độ C.
* Thuốc nhuộm được đun nóng, trải trên bề mặt gel giúp phá huỷ các liên kết disulfide của protein, làm
chúng duỗi thẳng mạch về cấu trúc bậc 1, tạo sự thuận lợi khi di chuyển trên gel vì nguyên tắc của điện
di SDS-PAGE là nhận diện protein dựa theo chiều dài hay còn gọi là khối lượng phân tử của protein.

3. Tinh sạch hGH tái tổ hợp

4. Đặc điểm của protein tinh sạch

5. Nuôi cấy tế bào Nb2-11

- Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật, sử dụng dòng tế bào lympho T của chuột được nuôi trong môi
trường PRL (prolactin), tế bào Nb2-11 (gọi là tế bào sigma) được nuôi trong môi trường RPMI 1640 có bổ
sung huyết thanh nhau thai bò 10% (FBS), huyết thanh ngựa 10% và 1% penicillin-streptomycin ủ ở 37
độ C với không khí ẩm có nồng độ CO2 là 5%.

- Sự tăng sinh tế bào được xác định, kiểm tra bằng phương pháp MTS. Sau một thời gian ngắn nuôi cấy,
các tế bào được thu thập, rửa sạch trong môi trường nuôi cấy không có FBS, ủ trong 48 giờ trong đĩa 96
giếng với nồng độ là 20.000 tế bào/mL (100mL/giếng) với các nồng độ hGH tinh khiết khác nhau.

- Sau 48 giờ, bổ sung 20mL thuốc thử MTS vào mỗi giếng và ủ tiếp trong 2 giờ. Độ hấp thụ được ghi
nhận qua kiểm tra ở bước sóng 490nm. Số tế bào được xác định bằng đường cong tiêu chuẩn từ mối
quan hệ tuyến tính giữa độ hấp thụ và số tế bào.

* Phương pháp MTS là phương pháp trị liệu mụn, trẻ hoá làn da mà không xâm lấn, nguyên tắc là kích
thích cơ thể sản xuất collagen bằng cách tác động lên da bằng những vết đâm kim nhỏ. Ngoài ra còn có
tác dụng đối với các xét nghiệm y sinh. Nó được xem như 1 công cụ độc đáo dùng để phát hiện các dấu
hiệu sinh học chuyển hoá dưới dịch kẽ của da, đặc biệt là protein đối với thí nghiệm này.