Đánh giá sinh vật biến đổi

gen trong thực phẩm tại thị

trường Kuwait bằng
phương pháp PCR
Kuwait Journal of Science - 2023
GIỚI THIỆU
Cây trồng công nghệ sinh học là những cây trồng có gen bị biến
đối thông qua công nghệ DNA tái tổ hợp (DNA recombinant).
Ngô (Zea mays), Đậu tương (Glycine max) và lúa (Oryza sativa) là
một trong những loại cây trồng công nghệ sinh học phổ biến nhất
thế giới và thành phần chính được tìm thấy trong nhiều loại thực
phẩm và nguyên liệu thức ăn chăn nuôi.
GMO chứa các gen ngoại sinh biểu hiện protein mã hóa với chức
năng cụ thể. Theo nghiên cứu của Key et al, 2008 có nhiều tác dụng
không mong muốn của các sản phẩm biến đổi gen như độc tính, dị
ứng và tính kháng kháng sinh của protein ngoại lai. Hơn nữa động
vật ăn thức ăn biến đổi gen có khả năng tích lũy trong các sản
phẩm của chúng và gây rủi ro khi con người tiêu thụ (Phipps et
al, 2002).

Quy định về GMO đối với cây trồng công nghệ sinh học và các dẫn xuất của
chúng ở một khu vựt cụ thể là rất cần thiết vè mặt an toàn thực phẩm.
Phản ứng chuỗi Polymerase (PCR)- kỹ thuật để khuếch đại
DNA được lựa chọn để phát hiện và định lượng các trình tự
chuyển gen tồn tại trong cây trồng công nghệ sinh học do
tính chính xác và đặc hiệu cao (Holst-Jensen et al, 2003).

Mục đích của nghiên cứu này là sàng lọc sản

phẩm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi được bán
tại các thị trường của Kuwait và đưa ra đánh giá
sơ bộ về việc các mẫu thử nghiệm có phải GMO
hay không.
PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
 Vật liệu
31 sản phẩm thức ăn chăn nuôi và thực phẩm từ bắp, đậu tương và gạo của
các nhãn hiệu khác nhau được thu thập ở Kuwait giai đoạn 2015- 2016. Các
mẫu sau đó được nghiền thành bột mịn.
Nguyên liệu tham chiếu được chứng nhận (CRM) dựa trên bột hạt giống gồm:
ERM-BF413ak (0% ngô MON810)
ERM-BF410ak (mẫu đậu nành làm sẵn 0% Roundup)
ERM-BF413ek (2% ngô MON810)
ERM-BF410dk (1 % Roundup Ready Soya)
sản xuất bởi Viện vật liệu tham khảo và đo lường (IRMM, Geel, Bỉ)
Trích xuất DNA (gDNA) và kiểm soát chất lượng (QC)
Trích xuất gDNA mỗi lại 200mg bằng quy trình CTAB (cetyltrimethyl
ammonium bromide) theo phương pháp của Murray & Thompson
(1980) có sửa đổi gồm bổ sung Ribonuclease A (RNase A) 10 g/mL và
protein K (20g/mL) thành hỗn hợp đồng nhất. Cloroform được sử dụng
để loại bỏ protein và polysaccharide biến tính và NaCl 3M dùng để hòa
tan phức của CTAB.
Mẫu trắng (BEC) và mẫu DNA đối chứng dương (PEC) được đưa vào để
xác định mức độ nhiễm bẩn từ quá trình chiết xuất DNA.
Số lượng và độ tinh khiết của DNA được đo bằng quang phổ kế
NanoDrop 8000 UV-Vis. Tính toàn vẹn của DNA được điện di trên gel
agarose 2% được nhuộm bằng ethidium bromide (EtBr).
 oligonucleotice primers
.
Các mồi đặc hiệu theo trình tự của các gen tham chiếu nội sinh thực vật Zein (Ze1),
Lectin (Lec1) và sucrose phosphate synthase (SPS) và các yếu tố GMO điều hòa p35S
và Tnos, được tổng hợp thương mại.

Bảng 1: Các đoạn mồi đặc hiệu theo trình tự của các gen tham chiếu nội sinh thực
vật và các yếu tố điều hòa GMO (p35S, Tnos)
 Sàng lọc GMO bằng xét nghiệm PCR
1. Khuếch đại các gen tham chiếu
50​μL hỗn hợp phản ứng chứa 1X PCR buffer (10 ​mM KCL, 2 ​mM MgSO4, 8 ​
mM (NH4)2SO4, và10 ​mM Tris–HCl ở pH 8.5), 200 ​nM mỗi dNTP, 2,5 ​mM
MgCl2, mồi xuôi và mồi ngược của gen Ze1 và Lec1 là (0,5 ​M) và gen SPS là
(0,33 ​M), 1U/μl taq DNA polymerase và 100ng trích xuất DNA của mỗi mẫu.

Đối chứng mục tiêu DNA dương tính (PDTC): CRM

Không có mẫu kiểm soát (NTC): Nước cất

Mẫu kiểm soát mục tiêu DNA âm tính (NDTC): chứa DNA không có trình tự
của gen tham chiếu mục tiêu.

=> Quá trình khuếch đại được thực hiện trong hệ thống GeneAmp® PCR 9700
với chu kì và nhiệt độ được trình bài trong bảng 1. Sản phẩm PCR sau đó được
chạy điện di trên gel Agarose 2%.
2. Khuếch đại các yếu tố điều tiết GMO

Hỗn hợp phản ứng PCR (50 μ ​ l) chứa dung dịch đệm PCR
1X (10 mM KCL, 2mM MgSO4, 8mM (NH4)2SO4 và 10mM
tris- HCL ở pH 8.5), 0,2mM dNTPs, 2.5 mgCl2, 0,5 μ
​ M cho
mỗi mồi xuôi và mồi ngược, 0.025U/μl taq DNA
polymerase và 300 ng mỗi mẫu DNA trích xuất.

CRM sử dụng làm đối chứng dương.

NTC và NDTC dùng làm đối chứng âm.

=> Hỗn hợp được khuếch đại sau đó được điện di trên gel
Agarose/ 2%, theo các điều kiện nhiệt độ và chu kỳ đã được
trình bày trong bảng 1.
KẾT QUẢ
1. QC và xác nhận gDNA phân lập

EnvC: Mẫ u kiểm soát môi trường NTC: mẫ u trắ ng

BEC: Kiểm soát mẫ u trắ ng NDTC: mẫ u trích ko chứa DNA mục tiêu
PEC: Kiểm soát trích xuấ t dương tính PDTC: mẫ u trích có chứa DNA mục tiêu
1. QC và xác nhận gDNA phân lập
Phương pháp chiết CTAB thu được lượng gDNA cao có độ tinh khiết DNA
chấp nhận được và tính toàn vẹn cao

gDNA từ nguyên liệu chưa chế biến như ngô, đậu nành và gạo -> 1 dải
DNA sắc nét trên gel agarose với độ phân hủy không đáng kể => cho
thấy tính toàn vẹn cao của DNA được chiết xuất.

Tuy nhiên, gDNA thu được từ các nguyên liệu có nguồn gốc từ ngô đã
chế biến-> khác biệt về năng suất và độ tinh khiết so với từ chưa qua
chế biến nguyên liệu ngô.

Sự phân mảnh và toàn vẹn trên gel agarose, thu được từ các mẫu ngô
làm thức ăn chăn nuôi chưa qua chế biến, tương tự như tính toàn vẹn
của các mẫu thực phẩm ngô chưa qua chế biến.
1. QC và xác nhận gDNA phân lập

Không thể quan sát thấy dải nào trên gel agarose khi gDNA
được chiết xuất từ ​nguyên liệu thức ăn có nguồn gốc từ đậu
nành đã qua chế biến (dữ liệu không được hiển thị).

PEC cho tất cả các mẫu thử nghiệm tạo ra kết quả dải nguyên
vẹn khoảng 10 kb, trong khi không quan sát đc trong cả hai
Env. C. hoặc BEC.
2. Khuếch đại gen nội bào
2. Khuếch đại gen nội bào
Để xác nhận thêm sự hiện diện và chất lượng của gDNA => xác minh khả năng
khuếch đại => sử dụng các bộ mồi dành riêng cho Ze1, Lec1 và trình tự SPS
của các gen nội bào ở ngô, đậu tương và lúa tương ứng.

Phân tích điện di PCR trên gel agarose cho thấy hiệu quả 277 bp đối với Zein,
118 bp đối với Lectin và 279 bp đối với SPS.

Cả 2 mẫu PEC và PDTC tạo ra kết quả như nhau kích thước dải dự kiến, không
có dải nào có thể được quan sát ở mức âm với phương pháp kiểm soát Env. C.,
BEC, NTC và NDTC.

=> gDNA cô lập có chất lượng tốt và thích hợp làm khuôn mẫu để xét nghiệm
sàng lọc GMO.
3. Khuếch đại các yếu tố điều tiết p35S và Tnos
3. Khuếch đại các yếu tố điều tiết p35S và Tnos
3. Khuếch đại các yếu tố điều tiết p35S và Tnos
Điện di phân tích PCR cho thấy trong số 31 mẫu đã phân tích, 6 sản phẩm
ngô, 1 đậu nành và 2 sản phẩm có nguồn gốc từ gạo đã tạo ra kết quả kích
thước khuếch đại dự kiến ​là 122 bp với chuỗi dẫn xuất 35S

Khi các mẫu dương tính với 35S được phân tích sâu hơn về sự hiện diện
của Tnos terminator, chỉ có 6 sản phẩm có nguồn gốc từ ngô tạo ra kích
thước khuếch đại dự kiến ​là 180 bp, trong khi khuếch đại với Tnos với các mẫu
có nguồn gốc từ đậu nành và gạo không thành công

Trong cả hai thử nghiệm, việc kiểm tra PCR đã chứng minh không có ô nhiễm
và kết quả tích cực => độ tin cậy của xét nghiệm PCR.

Xét nghiệm sàng lọc này xác nhận sự hiện diện của GM cấu trúc trong thực
phẩm và thức ăn chăn nuôi
BÀN LUẬN
Sử dụng và cải tiến phương pháp PCR phát hiện các yếu tố điều hòa
GMO p35S và Tnos, bằng cách chiết xuất DNA được sửa đổi nội bộ và
các biện pháp kiểm soát thích hợp.

Kết quả cho thấy sự tồn tại GMO trong các sản phẩm thực phẩm và
thức ăn chăn nuôi được bán tại thị trường Kuwait dành cho người và
tiêu thụ động vật.

Nghiên cứu nhấn mạnh nhu cầu cấp thiết về việc nhanh chóng hành
động để chính quyền địa phương thiết lập hợp pháp hóa và ghi nhãn
GMO hệ thống nhập khẩu thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.

Điều này đòi hỏi phải liên tục giám sát các sản phẩm GM thông qua thử
nghiệm định tính và định lượng để phát hiện và xác định hàm lượng
GMO.
TLTK
Mazzara, M., Paoletti, P., Corbisier, P., et al., 2013. Kernel lot
distribution assessment (KeLDA): a comparative study of protein and
DNA-based detection methods for GMO testing. Food Anal. Methods 6,
210–220.
Meyer, R., Chardonnens, F., Hübner, P., Lüthy, J., 1996. Polymerase
chain reaction (PCR) in the quality and safety assurance of food:
detection of soya in processed meat products. Z. Lebensm. Unters.
Forsch. 203, 339–344.
Murray, M.G., Thompson, W.F., 1980. Rapid isolation of high molecular
weight plant DNA. Nucleic Acids Res. 8, 4321–4325.
Oraby, H.A.S., Hassan, A.A., Abou Mossallam, A.A., 2005. Screening
food products for the presence of CaMV 35S promotor and NOS 3’
terminator. J. Sci. Food Agric. 85, 1974–1980.
Pandey, A., Kamle, M., Yadav, L.P., Muthukumar, M., Kumar, P., Gupta,
V., Ashfaque, M., Pandey, B.K., 2010. Genetically modified food: its
uses, future prospects and safety assessments. Biotechnology 9, 444–
458.
THE END