DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH TRONG THỊT

GÀ Ở BA VÙNG KHÍ HẬU CỦA ẤN ĐỘ

BẰNG HPLC-PDA VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC
ĐỘ PHƠI NHIỄM VÀ ĐẶC TÍNH RỦI RO

Choodamani Chandrakar a,*, Sanjay Shakya a, Anil Patyal a, Dhirendra Bhonsle b,

Ajeet Kumar Pandey a
FOOD CONTROL 148 (2023)
GIỚI THIỆU
Hiện nay các xí nghiệp thường sử dụng chất bổ sung như thuốc kháng sinh
trong khẩu phần ăn của gia cầm (ngăn ngừa dịch bệnh, kích thích tăng
trưởng)

Ở Ấn Độ, việc sử dụng kháng sinh ở động vật thức ăn sẽ tăng 82% và đặc
biệt ở gà dự kiến ​sẽ tăng gấp 3 lần vào năm 2030 -> nguyên do là việc sử
dụng kháng sinh bừa bãi, không đúng cách và thiếu kiến thức

=> Sự tích tụ kháng sinh trong nguồn thực phẩm từ động vật, tiềm ẩn nguy
cơ ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng

=> Nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh trong thịt gà bằng phương
pháp HPLC-PDA và đánh giá mức độ rủi ro
1
NGUYÊN LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP
NGUYÊN LIỆU
Thí nghiệm được thực hiện tại Chhattisgarh, Ấn Độ với 336 mẫu thịt gà thô (3
vùng: Chhattisgarh plains, the Northern hills, and the Bastar plateau) -> bảo
quản lạnh 20oC trong 24h

HÓA CHẤT
Oxytetracycline hydrochloride (OTC), tetracycline hydrochloride (TC),
chlortetracycline hydrochloride (CTC), sulfamethazine (SMZ),
ciprofloxacin (CIP) và enrofloxacin (ENR) tinh khiết 98–99%
Analytical grade citric acid monohydrate, sodium hydroxide, disodium
hydrogen phosphate dehydrate lấy (Ấn Độ)
Oxalic acid, formic acid, trichloroacetic acid (TCA), trifluroacetic acid
(TFA) and HPLC grade methanol (MeOH) and acetonitrile (ACN) (Đức)
HPLC grade water (Mỹ) 2
CHUẨN BỊ ĐƯỜNG CHUẨN
Dung dịch chuẩn gốc OTC, TC, CTC, SMZ 10 mg pha loãng với
10 ml metanol (đối với CIP và ENR thì pha 10mg chất chuẩn với
9ml ACN và 1ml acetic acid, nồng độ dd 1mg/ml) -> bảo quan
lạnh 4oC tối đa 4 tuần trong chai lọ thủy tinh màu nâu

Đường chuẩn của các loại kháng sinh khác nhau được chuẩn bị
với nồng độ 50, 100, 200, 300 và 500 μg/kg

3
CHUẨN BỊ MẪU
5g mẫu + 50ml propylene + 15ml 20% TCA trong ống ly tâm -> pha
loãng với 20ml 0.1M Na2EDTA-Mcll-vaine buffer (pH 4) -> vortex 10min
-> sonication 10min -> ly tâm 8000xg trong 10min nhiệt độ phòng

Lọc chân không với giấy lọc Whatman ™ No42 -> dd sau lọc cột chiết
pha rắn (SPE) với 3ml methanol + 2ml nước -> rửa với 2ml 5% MeOH ->
làm khô bằng hút chân không trong 1 min

Rửa giải với 3ml MeOH + 2ml 1% TFA -> thiết bị bay hơi chân không ->
phần khô được hoàn nguyên với 1ml MeOH và nước (80:20) -> lọc với
bộ lọc ống tiêm PTFE 0,45-μm -> dự trữ cbi cho HPLC
4
PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH BẰNG HPLC-PDA
Máy Waters® HPLC + bơm bậc 4 (Waters, e2695), máy lấy mẫu tự động,
module điều khiển nhiệt độ cho cột và máy dò PDA (Waters, 2998).

Phân tách sắc ký các dư lượng OTC, TC, CTC và SMZ bằng cột
ZORBAX-XDB, C18 (250 × 4,6 mm i. d., áp dụng cho kích thước 5 μm)
(Tập đoàn Agilent, Mỹ) ở nhiệt độ 30oC trong đẳng tích với axit oxalic
(0,01 M), ACN và MeOH (70:10:20, v/v) ở pha động

Tốc độ dòng chảy cố định tại 1 ml/min và tổng thời gian chạy 10min

PDA theo dõi dung dịch rửa giải (50µl) ở bước sóng 360 nm và 280 nm
tương ứng tetracycline (OTC, TC, CTC) và sulfonamid (SMZ) 5
PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH BẰNG HPLC
Fluoroquinolones (CIP and ENR) đc loại bởi cột Waters Xbridge- C18
(150 × 4.6 mm i. d., kích thước hạt 3.5 μm, Milford, MA, USA) ở 40oC
và tốc độ dòng chảy 0.82ml/min

Dung dịch rửa giải (15µl) và xác định PDA tại 280nm trong pha động
phối trộn ACN và 0.1% acid formic pH 2.74

Đường cơ sở đc diễn đạt bằng cách sử dụng chế độ rửa giải

gradient: 13% ACN lúc đầu và tăng dần lên 15% trong 7 min, giảm
10% trong 7 min kế tiếp và tăng lại 13% trong 3 min.
6
KHẢO SÁT NG TIÊU DÙNG
4 độ tuổi khác nhau - G1: 1-9 tuổi - G2: 10-20 tuổi - G3: 21-60 tuổi - G4: >60 tuổi

ĐÁNH GIÁ PHƠI NHIỄM VÀ RỦI RO

Lượng tiêu thụ hàng ngày ước tính (EDI) của dư lượng kháng sinh từ việc tiêu
thụ thịt gà: EDI = C x F / W
C = nồng độ dư lượng kháng sinh trung bình trong thịt gà (μg/kg)
F = lượng tiêu thụ thịt gà hàng ngày
W = trọng lượng cơ thể (kg)
=> EDI so sánh với ADI (Acceptable Daily Intake) từ Joint FAO/WHO Expert
Committee on Food Additives
=> HQ = EDI / ADI (Hazard Quotient, HQ>=1 sp rủi ro, HQ<1 sp ko rủi ro đáng kể)
7
THỐNG KÊ
IBM SPSS Statistics for Windows, Version 20.0 (Armonk, NY:IBM Corp.)
1 way analysis of variance (ANOVA), P=0.05%

Phân tích thành phần chính (PCA) hình dung sự khác biệt giữa nồng độ
kháng sinh trong thịt gà từ các nơi khác nhau. Các nhân tố có giá trị
riêng lớn hơn 1 được chọn làm các thành phần chính (PC), chiếm phần
lớn trong sự khác biệt trong tệp dữ liệu.

Sử dụng khoảng cách Euclide làm thước đo và Phương sai tối thiểu của
Ward (tổng phương sai trong cụm tối thiểu) là tiêu chí liên kết trong
Phân cụm phân cấp (HAC)
8
KẾT QUẢ VÀ
BÀN LUẬN
1. KẾT QUẢ PHÁT HIỆN DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH TRONG THỊT GÀ

Bảng 1: Dư lượng kháng sinh trong mẫu thịt gà được phát hiện ở 3 vùng

N: tổng số mẫu, n: mẫu dương tính, MRL giới hạn kháng sinh cho phép

9
 1. KẾT QUẢ PHÁT HIỆN DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH TRONG THỊT GÀ
Bảng 2: Các thông số kiểm soát chất lượng để xác định kháng sinh trong mẫu bằng HPLC–PDA

Đỏ:
Tetracycline
(OTC, TC,
CTC)
Xanh lá:
Sulfamine
(SMZ)
Xanh dương:
Fluoroquinol
one (CIP,
ENR)

10
1. KẾT QUẢ PHÁT HIỆN DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH TRONG THỊT GÀ

Trong số 336 mẫu thịt gà được thu thập có 10 mẫu OTC, 10

mẫu TC, 02 mẫu CTC, 29 mẫu SMZ, 07 mẫu CIP và 02 mẫu
ENR có hàm lượng kháng sinh > MRL (Liên minh Châu Âu
thiết lập là 100 μg/kg), chiếm tỷ lệ tương ứng là 2,9%, 2,9%,
0,6%, 8,6%, 2,1% và 0,6%.

--> Việc sử dụng quá nhiều kháng sinh trong chăn nuôi gia
cầm như chất kích thích tăng trưởng và việc không thực hiện
giai đoạn ngừng sử dụng kháng sinh sẽ dẫn đến mức dư
lượng kháng sinh trong thịt gà tăng cao

12
 1. KẾT QUẢ PHÁT HIỆN DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH TRONG THỊT GÀ

Sự khác biệt tổng thể giữa các vùng có thể là do:

Độ ẩm cao (80–85%) và lượng mưa lớn (1450–1510 mm) ở các
ngọn đồi phía Bắc và cao nguyên Bastar (Bhuarya et al, 2018) gây
ảnh hưởng đến sự xuất hiện của nhiều loại bệnh gia cầm--> Cung
cấp các điều kiện tối ưu cho sự hình thành bào tử của kén cầu
trùng và sự thúc đẩy phân tán, lây truyền (Sharma et al, 2015). Do
đó, dư lượng SMZ chỉ được phát hiện ở các ngọn đồi phía Bắc và
cao nguyên Bastar có thể là do tỷ lệ mắc bệnh cầu trùng cao vì
SMZ được sử dụng để phòng và chữa bệnh cầu trùng.
Quy mô trang trại, khu vực nông thôn- thành thị, trình độ học vấn
của nông dân và những người buôn bán thức ăn gia cầm
(Chowdhury et al, 2022; Parkhi et al, 2022) 13
2. PHÂN CỤM THEO THỨ BẬC (HAC) - PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CHÍNH (PCA)

Để khảo sát sự xuất hiện dư lượng kháng sinh chiếm ưu thế trong
các mẫu của ba vùng khí hậu nông nghiệp, HAC và PCA đã được
thực hiện.
Phân cụm theo thứ bậc HAC cho phép phân tách các mẫu theo
đặc tính dư lượng kháng sinh của chúng (Hình 1)

14
7 cụm chính và 3 cụm đơn đã được xác định.
- Cụm I - OTC.
- Cụm II - OTC và TC.
- Cụm III - cao nguyên Baster - OTC.
- Cụm VII - vùng đồi phía Bắc - SMZ.
- Cụm VI - ô nhiễm nhất >2 loại kháng sinh. 15
3. PHÂN CỤM THEO THỨ BẬC (HAC) - PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CHÍNH (PCA)

Phân tích thành phần chính (PCA): được thực hiện để kiểm tra mô hình
phân bố dư lượng kháng sinh trong các mẫu thịt gà qua biểu đồ 2 chiều

PC1: 39.7% phương sai thể hiện

dương tính kháng sinh OTC
(0.49), TC (0.35) and CIP (0.11)

PC2: 26.6% phương sai thể hiện

dương tính kháng sinh TC (0.61),
SMZ (0.36) và âm tính CIP (-
0.60)
thập đỏ: đồng bằng
Chhattisgarh
vòng xanh: đồi phía
Bắc
chấm đen: cao nguyên
Bastar
16
3.
2.PHÂN
PHÂNCỤM
CỤMTHEO
THEOTHỨ
THỨBẬC
BẬC (HAC)
(HAC)--PHÂN
PHÂNTÍCH
TÍCHTHÀNH
THÀNHPHẦN
PHẦNCHÍNH
CHÍNH(PCA)
(PCA)

Có sự phân tách vừa phải giữa các vùng.

Mẫu vùng đồng bằng Chhattisgarh tương quan với dư lượng OTC,
TC và CTC.
Mẫu vùng đồi phía bắc chủ yếu tương quan với dư lượng SMZ.
Cao nguyên Bastar tương quan với dư lượng CIP và ENR.

--> Do điều kiện khí hậu nông nghiệp khác nhau, gây ra các loại bệnh
khác nhau trong chăn nuôi gia cầm, đó là lý do tại sao người nông dân
sử dụng các nhóm kháng sinh khác nhau để điều trị chúng.

17
 3. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ PHƠI NHIỄM VÀ ĐẶC TÍNH RỦI RO

Đánh giá mức độ phơi nhiễm

Đánh giá phơi nhiễm của kháng
sinh được xác định từ việc tiêu
thụ thịt gà ở các nhóm tuổi khác
nhau của người tiêu dùng được
trình bày trong Bảng 3.
ADI (acceptable daily intake):
lượng tiêu thụ hàng ngày chấp
nhận được.
EDI (estimated daily intake):
lượng tiêu thụ ước tính hàng
ngày.
Bảng 3: EDI trung bình và chỉ số nguy hiểm của kháng
sinh ở các lứa tuổi khác nhau. 18
 4.
3.ĐÁNH
ĐÁNHGIÁ
GIÁMỨC
MỨCĐỘ
ĐỘPHƠI
PHƠINHIỄM
NHIỄMVÀ
VÀĐẶC
ĐẶCTÍNH
TÍNHRỦI
RỦIRO
RO

Lượng kháng sinh trung bình hằng ngày từ thịt gà với chỉ số EDI μg/kg
ngày là:
Nhóm tuổi 1 (EDI 0,086–0,150)
Nhóm tuổi 2 (EDI 0,078–0,14)
Nhóm tuổi 3 (EDI 0,071–0,120)
Nhóm tuổi 4 (EDI 0,066–0,120)

EDI của SMZ là cao nhất và thấp nhất là CIP => có thể là do SMZ được phát
hiện ở nồng độ cao hiện tại.

Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đó, trẻ em có nguy cơ chính tiếp
xúc với CIP và ENR do ăn thịt gia cầm và dễ bị tổn thương trước thuốc kháng
sinh (do trọng lượng cơ thể thấp) 19
Đánh giá đặc tính rủi ro
Giá trị HQ các loại kháng sinh khác nhau nằm trong khoảng 0,0019-
0,0140 tất cả nhóm tuổi.
HQ tất cả các nhóm tuổi được tìm thấy dưới cho thấy không có tác
dụng phụ tiềm ẩn nào do phơi nhiễm riêng lẻ các loại kháng sinh
trong thịt gà.
HQ cao hơn ghi nhận ở nhóm tuổi 1 với mức độ ảnh hưởng
ENR > CIP > TC > SMZ > OTC

=> Việc tiêu thụ nhiều hơn theo trọng lượng cơ thể ở giai đoạn đầu đời
có thể dẫn đến mức độ phơi nhiễm cao hơn và do đó khả năng xảy ra
rủi ro ở trẻ em cao hơn ở người lớn.

20
 Đánh giá đặc tính rủi ro
Việc tiêu thụ dư lượng kháng sinh hàng ngày có thể khiến phơi
nhiễm lâu dài --> dẫn đến rủi ro phát triển của vsv kháng thuốc.
Pereira et al. (2018) và Oyedeji et al. (2019)

Sự thay đổi của vi khuẩn có lợi là điểm lo ngại đối với trẻ nhỏ (giai
đoạn phát triển quan trọng của hệ vi sinh đường ruột). Nếu hệ vi
sinh đường ruột của trẻ nhỏ liên tục bị xáo trộn do ăn phải dư lượng
kháng sinh hàng ngày

=> Ảnh hưởng đến phát triển vk đường ruột + tăng nguy cơ béo phì +
các bệnh dị ứng.

21
KẾT LUẬN
Sự hiện diện của nhiều loại dư lượng kháng sinh
trong mẫu thịt gà với tỷ lệ 2,9%, 2,9%, 0,6%, 8,6%,
2,1% và 0,6% tương ứng với kháng sinh OTC, TC,
CTC, SMZ, CIP và ENR--> vượt quá giới hạn khuyến
nghị của Liên minh Châu Âu (100microgram/Kg).

Đặc tính nguy cơ cho thấy dư lượng kháng

sinh có thể gây ra một chút nguy cơ sức khoẻ
đối với trẻ em

22
Để giảm thiểu dư lượng kháng sinh trong gia cầm
cần:

Kiểm soát thường xuyên và chặt chẽ các sản

phẩm có nguồn gốc động vật
Nông dân có trình độ thấp do thiếu đào tạo
trong nông nghiệp có nhiều khả năng lạm dụng
kháng sinh --> Chính phủ cần chú hơn trong việc
hướng dẫn người dân sử dụng kháng sinh đúng
cách.
23
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Er, B., Onurda˘g, F. K., Demirhan, B., ¨Ozgacar, S.¨O., ¨Oktem, A. B., & Abbaso˘glu, U (2013). Screening of quinolone antibiotic
residues in chicken meat and beef sold in the markets of Ankara, Turkey. Poultry Science, 92(8), 2212–2215. European
Commission. (2002). Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the
performance of analytical methods and the interpretation of results. Official Journal of European Communities, 50, 8–36.
European Commission. (2010). Commission Regulation (EU) No 37/2010 of 22
December 2009 on pharmacologically active substances and their classification regarding maximum residue limits in foodstuffs
of animal origin. Official Journal of the European Union, 15(2377), 1–72. Gupta, R., Jhandai, P., & Singh, D. (2020). GIS-augmented
survey of poultry farms with respiratory problems in Haryana. Tropical Animal Health and Production, 52(6), 3123–3134.
Hanna, N., Sun, P., Sun, Q., Li, X., Yang, X., Ji, X., … Lundborg, C. S. (2018). Presence of antibiotic residues in various environmental
compartments of shandong province in eastern China: Its potential for resistance development and ecological and human risk.
Environment International, 114, 131–142.
Henuk, Y. L. (2018). Global poultry production and it’s substantial contribution to nutrition, food security and poverty alleviation
in many developing countries. Journal of Veterinary Science & Medical Diagnosis, 7.
Heshmati, A., Kamkar, A., Salaramoli, J., Hassan, J., & Jahed, G. H. (2013). The effect of two methods cooking of boiling and
microwave on tylosin residue in chicken meat. Iranian Journal of Nutrition Sciences & Food Technology, 8(1), 231–240.
ICH Harmonised Tripartite Guideline. (2005). Validation of analytical procedures: Text and methodology Q2(R1). Retrieved
November 21, 2022, from https://database.ich. org/sites/default/files/Q2%28R1%29%20Guideline.pdf.
Jabbar, A., & Rehman, S. (2021). Microbiological evaluation of antibiotic residues in meat, milk and eggs. Journal of Microbiology,
Biotechnology and Food Sciences, 2(5), 2349–2354.
Jammoul, A., & El Darra, N. (2019). Evaluation of antibiotics residues in chicken meat samples in Lebanon. Antibiotics, 8(2), 69.
Joint, FAO, WHO Expert Committee on Food Additives. (1995). Evaluation of certain veterinary drug residues in food: Forty-second
report of the joint FAO/WHO Expert committee on food Additives (p. 851). WHO technical report series.
Joint, FAO, WHO Expert Committee on Food Additives. (2002). Evaluation of certain veterinary drug residues in food : Fifty-eighth
report of the joint FAO/WHO Expert committee on food additives (p. 911). WHO technical report series
23
 THANK YOU
FOR LISTENING