CARBOHYDRATE POLYMES

Tóm Tắt
Một phần polysacarit trung tính (SMPA) được điều chế từ rễ của Salvia miltiorrhiza bằng
phương pháp sắc ký DEAE-cellulose và Sephadex G-100 đã được thử nghiệm về chức năng tăng
cường miễn dịch của nó trong điều trị ung thư dạ dày do N-methyl-N -nitro-nitrosoguanidine
(MNNG) điều hành nội tâm mạc . SMPA
(200 mg / kg) điều trị không chỉ làm tăng trọng lượng cơ thể, mà còn cải thiện các chỉ số cơ quan
miễn dịch. Hơn nữa, các nghiên cứu về các hoạt động miễn dịch khác nhau ở chuột ung thư dạ
dày cho thấy SMPA kích thích tăng sinh tế bào lách một cách đáng kể, thúc đẩy sản xuất các
cytokine chống viêm (IL-2, IL-4 và IL-10), ức chế cytokine gây viêm (IL-6) và bài tiết TNF-),
tăng cường hoạt động tiêu diệt tế bào tiêu diệt tự nhiên (NK) và tế bào lympho T gây độc tế bào
(CTL), và tăng chức năng thực bào của đại thực bào ở chuột ung thư dạ dày. Ngoài ra, hệ thống
SMPA rõ ràng đã nâng tổng lượng granzyme nội bào-B và IFN-được sản xuất bởi các tế bào lách
ở chuột ung thư dạ dày. Kết hợp lại với nhau, những kết quả này cho thấy SMPA có thể hoạt
động như một chất điều hòa miễn dịch hiệu quả và có thể được khám phá như một nguồn bổ
sung tiềm năng cho liệu pháp chửa ung thư dạ dày.
1.Giới thiệu
Ung thư dạ dày là nguyên nhân phổ biến thứ hai gây tử vong liên quan đến ung thư trên toàn thế
giới (Neugut, Hayek, & Howe, 1996). Phẫu thuật, hóa trị và xạ trị vẫn là phương pháp điều trị
ung thư thông thường chính cho bệnh ác tính này (Rugge, 2007). Nhưng những liệu pháp này đã
không hiệu quả trong nhiều trường hợp do các phản ứng bất lợi của chúng (Fennelly, 1995; Ross
& Small, 2002) và khả năng phục hồi đa bào (MDR) của các tế bào khối u đối với các tác nhân
hóa trị liệu (Liscovitch& Lavie, 2002). Mặc dù các chiến lược điều trị khác nhau, việc kiểm soát
ung thư này ở giai đoạn tiến triển vẫn còn nhiều vấn đề. Do đó, có một nhu cầu cấp thiết cho việc
phát triển các chiến lược điều trị mới để cải thiện tuổi thọ của bệnh nhân ung thư dạ dày.
Theo sự thông hiểu tốt nhất của chúng tôi, ức chế miễn dịch được quan sát rõ ràng ở bệnh nhân
ung thư và động vật mang khối u, cho thấy các tế bào khối u làm suy giảm chức năng của hệ
thống miễn dịch (Vasievich& Hoàng, 2011). Lần lượt chức năng miễn dịch thấp của một sinh vật
có thể không chỉ dẫn đến sự tiến triển của khối u, mà còn có thể là một trong những yếu tố quan
trọng nhất giúp cản trở bệnh nhân khối u phục hồi. Miễn dịch hiệu quả bảo vệ chống lại mầm
bệnh, cho phép chữa lành vết thương và sửa chữa mô, và bảo vệ chống lại một số loại khối u.
Các tế bào khối u có thể trốn tránh sự phát hiện và loại bỏ miễn dịch bằng các cơ chế khác nhau
(Sephton et al., 2009). Khi điều này xảy ra, khả năng miễn dịch mạnh mẽ vẫn rất cần thiết để duy
trì sức khỏe thể chất của bệnh nhân ung thư. Việc phát hiện và xác định các loại thuốc chống ung
thư mới, có thể tăng cường chức năng miễn dịch, đã trở thành một mục tiêu quan trọng của
nghiên cứu về immunopharmacol- ogy và onc Liệu pháp (Mitchell, 2003). Trong vài thập kỷ
qua, nhiều phức hợp protein polysacarit với hoạt động điều hòa miễn dịch từ dược liệu đã hứa
hẹn là chất chống ung thư tiềm năng (Schepetkin & Quinn, 2006). Các polysacarit này thường có
độc tính thấp và ít tác dụng phụ, khiến chúng thích hợp với liệu pháp miễn dịch chống ung thư
(Liu và cộng sự, 2013; Zeng, Ju, Shen, Zhou, & Huang, 2006; Yang et al., 2013). Các cơ chế
chính mà polysacarit bảo vệ các tế bào thường được cho là thông qua kích hoạt phản ứng miễn
dịch của vật chủ.
Rễ cây khô của Salvia miltiorrhiza Bunge, được gọi là 'Dan-shen', là một trong những loại dược
liệu được sử dụng phổ biến nhất ở Trung Quốc và được liệt kê chính thức trong Dược điển Trung
Quốc (De Palma et al., 2008), và đã được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc (TCM)
trong hơn 2000 năm để ngăn ngừa và điều trị các bệnh khác nhau ở người như viêm gan, bệnh
động mạch vành, apoplexy, khối u tăng trưởng và rối loạn miễn dịch. Đặc biệt, người ta đã phát
hiện ra rằng tanshinone từ loại cây này gần đây đã được chứng minh là có một số hoạt động
chống lại các tế bào ung thư khác nhau của con người, như tuyến tiền liệt, phổi, vú, bệnh bạch
cầu, bệnh glioma, dạ dày, vòm họng và gan (Gong et al., 2011 ; Liu và cộng sự, 2013). Tuy
nhiên, theo thông hiểu tốt nhất của chúng tôi, không có thông tin nào được báo cáo về hoạt động
chống khối u của S. miltiorrhiza polysacarit đối với bệnh ung thư dạ dày in vivo, chứ đừng nói
đến cơ chế chống ung thư của nó. N-Methyl-N -nitro- nitrosoguanidine (MNNG) là một chất gây
ung thư dạ dày ở một số loài động vật và đã được sử dụng trong một số hệ thống để phân tích
tiềm năng gây ung thư của các hợp chất khác nhau trong việc gây ra ung thư tuyến dạ dày
(Ohgaki, Kleihues, , 1991; Zhang, Luo, Bi, & Chu, 2012). Do đó, mục tiêu của nghiên cứu này là
kiểm tra tiềm năng các hoạt động chống ung thư và điều hòa miễn dịch của các polysacchrides
được phân lập từ S. miltiorrhiza ở chuột ung thư dạ dày do MNNG gây ra và cố gắng làm sáng tỏ
cơ chế đằng sau nó.
2. Vật liệu và phương pháp
2.1. Vật liệu và hóa chất
S. miltiorrhiza được lấy từ Xi hèan, Trung Quốc. DEAE-52 cellulose và Sephadex G-100 được
mua từ Amersham Bioscatics Co., Piscataway, NJ, USA; mannose (Man), ribose (Rib),
rhamnose (Rham), glucuronic acid (GlcUA), galacturonic acid (GalUA), glu-cose (Glc),
galactose (Gal), xyloza (Xyl), arabin (Fuc), axit trifluoroacetic (TFA), 1-phenyl-3-methyl-5-
pyrazolone (PMP), 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bro-mide (MTT) ,
concanavalin A (Con A), lipopolysacarit (LPS) được mua từ Sigma, Chemical Co., Saint Louis,
Missouri, USA; Trung bình RPMI-1640, huyết thanh thai nhi (FCS) và dimethyl sulfox-ide
(DMSO) được mua từ Gibco, Grand Island, NY, Hoa Kỳ; Cytokine interleukin-2 (IL-2),
interleukin-6 (IL-4), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), yếu tố hoại tử khối u-TN
(TNF-), interferon- ␥ (IFN-␥), Immunoglobulin A (IgA) Immunoglobulin G (IgG) và
Immunoglobulin M (IgM) phát hiện bộ dụng cụ ELISA được điều tra từ Công ty Công nghệ sinh
học Changfeng, Chiết Giang, Trung Quốc. Tất cả các hóa chất và dung môi khác được sử dụng
là loại phân tích.
2.2. Phân lập và tinh chế polysacarit từ rễ của S. miltiorrhiza

Rễ cây S. miltiorrhiza được sấy khô ở 50 ◦C, cắt thành từng miếng nhỏ và chiết bằng 95%
ethanol trong 24 giờ trong thiết bị Soxhlet để loại bỏ các phân tử lipophilic và sắc tố nhỏ. Sau đó,
các cặn được tẩy nhờn được chiết bằng hai mươi thể tích nước cất nóng ở 100 ◦C trong 2 giờ mỗi
lần (n = 3), được lọc qua gạc và cô đặc trong thiết bị bay hơi dưới áp suất giảm. Chất nổi phía
trên đậm đặc được trộn với bốn thể tích ethanol 95% và giữ ở 4 ◦C trong tủ lạnh để 12 h để kết
tủa các polysacarit. Các polysacbonat kết tủa được hòa tan trong nước khử ion và sau đó protein
trong polysacarit được loại bỏ bằng cách chiết ba lần bằng thuốc thử Sevag (1-butanol /
chloroform, 1: 4, v / v) (Navarini et al., 1999). Pha nước một lần nữa được thẩm tách, cô đặc và
kết tủa bằng ethanol. Sau khi ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng / phút tại 4 ◦C, kết tủa được rửa bằng
etanol khan, acetone và ether lần lượt, sau đó sấy khô để thu được các polysacarit thô (CSMPS).
Polysacarit thô được hòa tan trong dung dịch NaCl 0,1 M, được lọc qua bộ lọc Millipore 0,45-m,
và sau đó dịch lọc được đưa vào cột cellulose DEAE-52 (chiều dài: 40 cm, đường kính trong: 2,6
cm) tách rửa với sắc ký khác nhau các bước của dung dịch NaCl từng bước (0,1 thép1,0 M).
Phân số rửa giải (5 ml) đã được thu thập và theo dõi hàm lượng carbohydrate dựa trên phương
pháp axit sunfuric phenol ở độ hấp thụ 492nm (Dubois, Gilles, Hamilton, Rebers, & Smith,
1956) và ba hỗn hợp (CSMPA, CSMPB và CSMPC) đã thu được. CSMPA được sắc ký thêm
trên máy lọc gel Sephadex G-100 (chiều dài: 100 cm, đường kính trong: 2,6 cm) và rửa giải bằng
NaCl 0,1 M với tốc độ dòng 0,5 ml / phút. Một polysacarit đã thu được, được thẩm tách và đông
khô để tạo ra một polysacarit tinh khiết màu trắng (được đặt tên là SMPA).

2.3. Phân tích thành phần

Tổng hàm lượng carbohydrate của mẫu tinh khiết được xác định theo phương pháp axit sunfuric
phenol, sử dụng glucose làm chất chuẩn (Dubois et al., 1956). Hàm lượng axit Uronic được xác
định bằng phương pháp axit sunfuric carbazole, sử dụng axit glucuronic làm tiêu chuẩn (Bitter &
Muir, 1962). Ngoài ra, protein trong polysac- charides được định lượng theo phương pháp
Lowry sử dụng albumin huyết thanh bò (BSA) làm tiêu chuẩn (Lowry, Rosebrough, Farr, &
Randall, 1951), kết hợp với quét hấp thụ tia cực tím trên máy quang phổ UV UV (Tập đoàn
Shimadzu, Nhật Bản) ở 200 đến 300nm.
Trọng lượng phân tử trung bình của SMPA được xác định bởi HPGPC trên hệ thống HPLC
Shimadzu được trang bị TSK G3000

Cột PWxl (7 ×m × 7,8 mm × 300 mm) và máy dò RID-10A có chỉ số khúc xạ. Mẫu được hòa tan
trong dung môi pha động và được đưa qua bộ lọc 0,45 ␮m trước khi được nạp vào cột HPLC.
Các điều kiện thí nghiệm chi tiết là như sau: pha động: NaNO3 0,1 M; tốc độ dòng chảy: 0,9 ml /
phút; nhiệt độ cột: 45 C; thể tích tiêm: 20 l. Trọng lượng phân tử được ước tính bằng cách tham
khảo đường cong hiệu chuẩn được tạo ra từ tiêu chuẩn Dextran T-series có trọng lượng phân tử
đã biết (6100, 16.500, 26.290, 40.000, 84.000, 158.000) (Sun, Tang, Gu, & Li, 2005).
Thành phần monosacarit trung tính được phân tích theo quy trình sau như được mô tả bởi Dai,
Zhu, Tang, Wang, và, Chen (2007). Tóm lại, SMPA (10 mg / ml) đã được thủy phân trong 1 ml
TFA (4 mol / l) ở 110 C trong ống kín trong 2 giờ. Sau khi loại bỏ TFA bằng metanol, cặn được
hòa tan trong NaOH và phản ứng với PMP để chuyển đổi các monosacarit thành các dẫn xuất
PMP của chúng. Các dẫn xuất PMP của mười loại đường tiêu chuẩn (Man, Rib, Rham, GlcUA,
GalUA, Glc, Gal, Xyl, Ara, Fuc) và SMPA đã được phân tích trên
cột DIKMA Inertsil ODS-3 (4,6 mm × 250 mm) được kết nối với hệ thống HPLC Shimadzu.

2.4. Động vật và điều trị

Chuột Wistar đực 6 tuần tuổi được mua từ Trung tâm Ani của Đại học Quân y thứ tư (Trung
Quốc). Tất cả các thủ tục trên động vật được thực hiện tuân thủ các hướng dẫn được phê duyệt
bởi Hiệp hội Chăm sóc Động vật Phòng thí nghiệm Trung Quốc và Ủy ban Chăm sóc Động vật
Thể chế của Đại học Quân y thứ tư.
Sau 1 tuần thích nghi, chuột được chia ngẫu nhiên thành ba nhóm (n = 10). Tất cả các động vật
được cho uống MNNG với liều 200 mg / kg trọng lượng cơ thể trong nước uống mỗi ngày một
lần cho 15 tuần, ngoại trừ nhóm bình thường. Ngày sau 15 tuần dùng đường uống của MNNG
được lấy là ngày số không. Nhóm I đóng vai trò kiểm soát bình thường và được cho uống nước
cất trong 6 tuần. Nhóm II đóng vai trò kiểm soát mô hình và được cho uống nước trong 6 tuần.
Nhóm III nhận SMPA (200 mg / kg trọng lượng cơ thể, hòa tan trong nước cất) trong suốt thời
gian nghiên cứu. Tất cả các phương pháp điều trị đã được đưa ra sau khi cảm ứng khối u, một lần
mỗi ngày trong 6 tuần. Trọng lượng cơ thể của các động vật từ mỗi nhóm được ghi lại vào lúc
bắt đầu và khi kết thúc thí nghiệm. Sau liều cuối cùng và 24 giờ nhịn ăn, tất cả chuột bị giết chết
do trật khớp cổ tử cung. Máu được thu thập và tách huyết tương được sử dụng để phân tích.
Đồng thời, tuyến ức và lá lách được lấy từ chuột. Tác động lên cơ quan miễn dịch được đánh giá
dựa trên chỉ số tuyến ức và chỉ số lách (Liu và cộng sự, 2008).

2.5. Xét nghiệm tăng sinh lách

Lá lách được lấy ra một cách vô trùng từ những con chuột bị hy sinh bằng kéo và kẹp trong dung
dịch muối đệm phốt phát lạnh (PBS) và nhẹ nhàng đồng nhất với một cái chày bằng tanh lỏng.
Tế bào lách (5 × 105 tế bào / giếng) được nuôi cấy trong môi trường RPMI-1640 được bổ sung
10% huyết thanh bò sơ sinh (NBS) ở 37 C trong môi trường ẩm ướt với 5% CO2 với sự hiện
diện của Con A (kết hợp cuối cùng 5 G / ml), LPS (nồng độ cuối cùng 10 ␮g / ml) hoặc môi
trường RPMI 1640. Sau khi xử lý trong 72 giờ, 50 ␮l dung dịch MTT (2 mg / ml) đã được thêm
vào mỗi ô và đĩa được ủ cho một cái khác 4 h. Sau đó, tấm được ly tâm với tốc độ 2000 vòng /
phút trong 10 phút và MTT chưa được xử lý đã được loại bỏ cẩn thận bằng cách trộn. Tổng cộng
150 ll DMSO đã được thêm vào mỗi giếng. Sau đó, tấm được lắc cho đến khi các tinh thể bị hòa
tan và độ hấp thụ được đánh giá trong máy đọc ELISA (Bio-Rad, USA) ở bước sóng 570nm sau
15 phút.

2.6. Phát hiện cytokine huyết thanh

Nồng độ huyết thanh của IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-, IgA, IgG và IgM được xác định bằng bộ
dụng cụ ELISA thương mại (R & D Systems Inc., Minneapolis, USA) theo chỉ định của nhà sản
xuất. Các kết quả được biểu thị bằng số lượng trên mỗi ml huyết tương.

2.7. Độc tế bào tế bào NK

Độc tính tế bào tế bào NK được xác định bằng cách sử dụng xét nghiệm giải phóng 51Cr tiêu
chuẩn như được mô tả trước đây với một số sửa đổi (Zeytin et al., 2008). Tóm lại, các tế bào
YAC-1 (tế bào đích) đã được mua từ Bộ sưu tập văn hóa kiểu Mỹ (Rockville, MD, Hoa Kỳ) và
được duy trì trong môi trường RPMI-1640 được bổ sung 10% FCS trong máy ấp 5% CO2 ở 37
◦C để đo NK tế bào (tế bào effector) hoạt động. Các tế bào đích này (1 × 106) được dán nhãn
250 ␮Ci Na2 [51Cr] O4 trong 30 phút ở 37 C, rửa sạch và được gửi lại ở nồng độ 1 × 105 tế
bào / ml. Do đó, các tế bào NK (100 ␮l) được thu thập từ các nhóm được kiểm soát hoặc SMPA
được trộn lẫn với Na2 [51Cr] O4 có nhãn Yac-1 (100 l) ở tỷ lệ tác động đến mục tiêu (E: T) của
25: 1 trong đĩa 96 ô . Sau khi ủ trong 5 giờ ở 37 ◦C trong môi trường 5% CO2, các chất siêu
nhiên không có tế bào đã được thu hoạch và chất phóng xạ được đếm bằng máy đếm Beckman
5500 (Dụng cụ khoa học Beckman, Irvine, CA). Độc tế bào cụ thể tế bào được tính theo công
thức sau: tỷ lệ phần trăm của độ phân giải cụ thể = (cpm thử nghiệm - cpm tự phát) / (cpm tối đa
- cpm tự phát) × 100. Các điều khiển để giải phóng 51Cr tự phát hoặc tối đa là các tế bào đích ở
mức trung bình hoặc 1,5% Triton, tương ứng. Cpm tự phát là phóng xạ từ các giếng với các tế
bào đích. Tất cả các xét nghiệm đã được thực hiện trong ba lần.
2.8. Xét nghiệm tế bào lympho T tế bào lympho T (CTL)

Các tế bào HGC-27 (tế bào đích) được lấy từ Bộ sưu tập văn hóa kiểu Mỹ phù hợp (Rockville,
MD, Hoa Kỳ) và được nuôi cấy trong môi trường chim ưng sửa đổi Dulbecco (DMEM) chứa
10% FCS, Penicillin 100 U / ml và 100 g / ml streptomycin ở trong tủ ấm độ ẩm 5% CO2 ở 37
C. Hoạt động CTL được phân tích bằng phương pháp giải phóng 51Cr tiêu chuẩn như được mô
tả ở trên. Ngắn gọn, lách các tế bào (2 × 106) được nuôi cấy với các tế bào HGC-27 được chiếu
xạ 2 × 105 trong 5 ngày để tạo ra CTL (tế bào effector). Sau 5 ngày, CTL đã được thu hoạch và
kết dính với Na2 [51Cr] O4 có nhãn HGC-27 (1 × 104 tế bào / ô ) ở tỷ lệ effector-to-target (E: T)
là 25: 1 trong 5 giờ trong các tấm đáy tròn 96 ô . Tiêu diệt tế bào mục tiêu được xác định bởi bộ
đếm gamma Beckman 5500. Tỷ lệ độc tế bào được tính toán như mô tả ở trên.

2.9. Xác định chức năng thực bào của đại thực bào
Sau liều cuối cùng và 24 giờ nhịn ăn, một con chuột từ mỗi nhóm được tiêm tế bào đỏ gà (1 ml,
5%). Sau 12 giờ, những con chuột đã bị hy sinh và 2 ml nước muối bình thường được tiêm vào
khoang bụng của mỗi con chuột. Sau đó, dịch màng bụng (1 ml) được nhào từ bụng của mỗi con
chuột được thu thập và một giọt được đặt trên một phiến kính. Sau khi ủ 30 phút, dịch màng
bụng được cố định bằng hỗn hợp acetone / metanol (1: 1, v / v) và nhuộm 4% Giemsa cho 3 phút
Sau khi sấy khô, đại thực bào phúc mạc được đếm dưới kính hiển vi. Hiệu quả của CE-SB đối
với quá trình thực bào của đại thực bào enterocoelia được đánh giá bằng tỷ lệ thực bào tế bào
hồng cầu và chỉ số thực bào (Liu và cộng sự, 2008), được tính toán bằng các công thức sau: tỷ lệ
thực bào = (đại thực bàomà RBC thực hiện / tổng đại thực bào) × 100%; chỉ số thực bào = tế bào
đỏ gà phagocyted / tổng đại thực bào.

2.10. Xác định granzyme nội bào-B và IFN- trong tế bào lách chuột

Các tế bào lách (1 × 106) thu được từ các nhóm đối chứng hoặc được điều trị SMPA được nuôi
cấy trong tủ ấm CO2 5% trong 12 giờ. Sau khi ủ, các tế bào được rửa hai lần bằng PBS và tái
lơ lửng trong bộ đệm cố định ô sử dụng các ô 100 100l / 1 × 106 cho 15 phút. Một lần nữa các tế
bào được rửa một lần trong PBS và được nối lại trong bộ đệm hoán vị sử dụng các tế bào 50 ␮l /
1 × 106. Kháng thể kháng chuột granzyme-B-phycoerythrin (PE) đã được thêm vào để ủ trong
30 phút trong bóng tối. Sau khi ủ, các mẫu được rửa hai lần với PBS và được gửi lại trong 500
␮l PBS. Hai mươi ngàn sự kiện đã được phân tích trong một máy đo lưu lượng dòng chảy
Facscalibur bằng phần mềm Cell Quest. Nồng độ của các cytokine IFN-␥ trong siêu sinh của tế
bào lách được xác định bằng bộ dụng cụ ELISA thương mại.

2.11. Phân tích thống kê

Giá trị dữ liệu trung bình được trình bày với độ lệch của chúng (trung bình ± SD). Phân tích
phương sai (ANOVA) được theo dõi bằng thử nghiệm Dunnett Phụ để so sánh theo cặp. Ý nghĩa
thống kê được xác định là P <0,05 cho tất cả các xét nghiệm.

3. Kết quả
3.1. Cách ly và đặc tính của SMPA
Polysacarit thô từ rễ của S. miltiorrhiza được phân lập và tinh chế bằng sắc ký cellulose DEAE-
52 vào ba polysacarit CSMPA, CSMPB và CSMPC (Hình 1A). Năng suất của polysacarit thô
CSMPS là 5,23% nguyên liệu thực vật và năng suất của ba polysacarit là 41,34%, 9,53% và
10,94% cho CSMPA, CSMPB và CSMPC của polysaccha gốc-đi xe CSMPS, tương ứng. Xem
xét năng suất cao của nó và nhu cầu cho số lượng đáng kể vật liệu cho các thí nghiệm trên động
vật, CSMPA đã được chọn để phân đoạn thêm bởi một cột Sephadex G-100 sắc ký lọc gel, cho
một polysaccha đồng nhất-đi xe SMPA (Hình 1 B) với trọng lượng phân tử trung bình 43 kD
như được xác định bởi HPGPC. Tổng lượng đường và axit uronic nội dung của SMPA lần lượt là
91,67% và 13,14%. SMPA đã có một đỉnh hấp thụ ở 200nm và không có hấp thụ ở 260 và
280nm trong phổ UV, cho thấy sự vắng mặt của protein và axit nucleic. Phân tích GC cho thấy
SMPA bao gồm Gal, Glc, Rham, Man và GalUA theo tỷ lệ mol là 2,14: 1,42: 1,16: 2,15: 1 (Bảng
1).

3.2. Tác dụng của SMPA đối với các chỉ số nội tạng và trọng lượng cơ thể ở chuột ung thư dạ
dày

Trong nhóm bình thường, những con chuột trông hoàn toàn thoải mái, di chuyển nhanh chóng và
ăn uống tốt. Lông của nó trông sáng, và mặt nó cứng và hạt. Trong những con chuột của các
nhóm được điều trị bằng MNNG, sự chuyển động tự động dần dần trở nên chậm hơn, với long
bóng mượt, chán ăn và tăng cân chậm; ngược lại, chuột trong các nhóm được điều trị SMP rất
mạnh mẽ với bộ lông sáng bóng và tăng trọng lượng cơ thể nhanh chóng, cho thấy tình trạng
chung tốt. Ngoại lệ bệnh lý cho thấy teo và loạn sản niêm mạc dạ dày là biểu hiện ở chuột được
điều trị bằng MNNG, cho thấy mô hình ung thư dạ dày đã được thiết lập thành công (dữ liệu
không được hiển thị).
Như được hiển thị trong Bảng 2, trọng lượng cơ thể của chuột trong các nhóm khác nhau đã
không khác nhau trước khi thử nghiệm (P> 0,05). Cho đến khi kết thúc thí nghiệm, trọng lượng
cơ thể của chuột trong nhóm mô hình thấp hơn đáng kể so với những người trong nhóm đối
chứng bình thường (P <0,05). Sự gia tăng trọng lượng cơ thể trung bình đã được quan sát thấy ở
những con chuột được điều trị SMPA so với những con chuột điều khiển mô hình (P <0,05).
Quan trọng hơn, SMPA có thể làm tăng đáng kể trọng lượng lá lách và tuyến ức tương đối của
chuột (P <0,05 hoặc P <0,01) so với nhóm mô hình theo cách phụ thuộc liều. Tuy nhiên, chỉ số
lách trong nhóm được điều trị bằng MNNG thấp hơn so với nhóm chứng bình thường (P <0,01),
cho thấy tác dụng ức chế của khối u trên hệ thống miễn dịch như đã báo cáo trước đây. Kết hợp
với những dữ liệu này, kết quả cho thấy SMPA không chỉ làm tăng cơ thể

hình 2. Ảnh hưởng của SMPA đến các tế bào NK và hoạt động CTL ở chuột ung thư dạ dày. Giá
trị là thể hiện như là phương tiện ± S.D. (n = 10); * P <0,05 so với nhóm bình thường; ## P
<0,01 so với mô hình điều khiển . Trọng lượng nhưng cũng cải thiện các chỉ số cơ quan miễn
dịch ở chuột mô hình được điều trị bằng MNNG.
3.3. Tác dụng của SMPA đối với sự tăng sinh tế bào lách ở chuột ung thư dạ dày

Khả năng của các tế bào lympho đáp ứng với mitogen phản ánh tiềm năng miễn dịch của sinh vật
(Zeng et al., 2013). Để tìm hiểu xem SMPA có tăng cường tiềm năng miễn dịch của sinh vật hay
không, chúng tôi đã đo lường tác dụng của SMPA đối với sự tăng sinh tế bào được kích thích
bằng mitogen ở chuột ung thư dạ dày. Như thể hiện trong Bảng 3, sự tăng sinh tế bào lách được
kích thích bởi Con A- và LPS trong nhóm được điều trị bằng MNNG thấp hơn đáng kể so với
nhóm đối chứng bình thường (P <0,05 hoặc P <0,01). Tuy nhiên, SMPA cho thấy một hoạt động
đáng kể trên các tế bào lympho kích thích ConA- hoặc LPS (P <0,01) với liều 200 mg / kg.
Trong sự suy giảm của mitogen (Con A hoặc LPS), SMPA cũng cho thấy một hoạt động giảm
thiểu vừa phải để tăng sinh tế bào, cho thấy rằng nó có lợi ích trực tiếp cho sự tăng sinh tế bào
lách. Các kết quả hiện tại chỉ ra rằng SMPA có tác dụng giảm thiểu hoặc gây bệnh trực tiếp lên
sự tăng sinh tế bào lách của chuột để tăng cường đáp ứng miễn dịch và cải thiện khả năng miễn
dịch.

3.4. Tác dụng của SMPA đối với nồng độ huyết thanh của IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-, IgA,
IgG và IgM ở chuột ung thư dạ dày

Như đã thấy trong Bảng 4, IL-2, IL-4, IL-10, IgA, IgG và IgM ở chuột kiểm soát mô hình được
điều trị bằng MNNG thấp hơn đáng kể so với chuột kiểm soát bình thường (P <0,05 hoặc P
<0,01), trong khi đó nồng độ cytokine IL-6 và TNF-in ở chuột điều khiển mô hình được xử lý
bằng MNNG cao hơn rõ rệt so với chuột điều khiển thông thường (P <0,01). Điều này chỉ ra rằng
chức năng miễn dịch đã giảm ở chuột kiểm soát mô hình ung thư dạ dày. Điều trị SMPA đã làm
tăng đáng kể nồng độ IL-2, IL-4, IL-10, IgA, IgG và IgM trong máu và làm giảm nồng độ IL-6
và TNF-in ở chuột ung thư dạ dày so với những con chuột bị ung thư khí ( P <0,05 hoặc P
<0,01). Những kết quả này cho thấy điều trị SMPA có thể cải thiện chức năng miễn dịch ở chuột
ung thư dạ dày một phần thông qua việc thúc đẩy sản xuất IL-2, IL-4, IL-10, IgA, IgG và IgM và
ức chế bài tiết cytokine IL-6 và TNF-.
3.5. Tác dụng của SMPA đối với độc tế bào tế bào NK và đáp ứng CTL ở chuột ung thư dạ dày

Loại bỏ tế bào khối u được biết là qua trung gian một phần bởi hoạt động gây độc tế bào của tế
bào NK và CTL (Sunila, Hamsa, & Kuttan, 2011). Do đó, chúng tôi đã đo lường tác động của
SMPA đối với các hoạt động gây độc tế bào của tế bào NK và CTL, và kết quả được thể hiện
trong hình 2. Rõ ràng hoạt động của tế bào NK và CTL ở chuột kiểm soát mô hình ung thư dạ
dày đã bị ức chế và thấp hơn đáng kể so với sự kiểm soát bình thường (P <0,05), trong khi sự gia
tăng đáng kể hoạt tính đã được quan sát thấy ở các nhóm được điều trị SMPA với liều 200 mg /
kg so với những con chuột bị ung thư dạ dày (P <0,01). Những kết quả này tiết lộ thêm rằng
SMPA có thể tăng cường chức năng miễn dịch bằng cách tăng lên các tế bào NK và kích hoạt
CTL ở chuột ung thư dạ dày.

3.6. Tác dụng của SMPA đối với chức năng thực bào của đại thực bào ở chuột ung thư dạ dày

Các đại thực bào được coi là một trong những miễn dịch quan trọng tế bào bảo vệ vật chủ chống
lại sự phát triển của khối u (Fidler & Kleinerman, 1993). Chức năng thực bào của đại thực bào
có thể phản ánh chức năng miễn dịch ở một mức độ nào đó (Wu et al., 2004). Như thể hiện trong
Bảng 5, so với nhóm đối chứng bình thường, điều trị MNNG đã làm giảm chỉ số thực bào và tỷ
lệ thực bào đáng kể (P <0,05). Tuy nhiên, chức năng thực bào của đại thực bào đã tăng đáng kể ở
nhóm 200 mg / kg so với kiểm soát mô hình được điều trị bằng MNNG (P <0,05 hoặc P <0,01).
SMPA uống với liều 200 mg / kg làm tăng tỷ lệ thực bào và chỉ số thực bào lên 45,04% và 0,87,
tương ứng. Kết quả cho thấy điều trị SMPA góp phần cải thiện hoặc tăng cường chức năng thực
bào của đại thực bào ở chuột ung thư dạ dày, cho thấy SMPA có thể cải thiện chất lượng cuộc
sống của bệnh nhân mắc bệnh ác tính trong điều kiện lâm sàng.
3.7. Tác dụng của SMPA đối với sản xuất granzyme-B và IFN nội bào trong tế bào lách chuột

Sản xuất granzyme-B và IFN-␥ (P <0,05) thấp hơn đáng kể đã được tìm thấy trong nuôi cấy tế
bào lách của chuột trong dạ dày so với chuột bình thường. Tuy nhiên, điều trị bằng SMPA ở mức
200 mg / kg gây ra sự gia tăng đáng kể các biểu hiện của granzyme-B (Hình 3) hoặc IFN-(Hình
3B), cho thấy SMPA kích hoạt tổng số granzyme nội bào-B và IFN- nội dung giúp tiêu diệt các
tế bào đích bị nhiễm bệnh hoặc tế bào ung thư.

4. Thảo luận và kết luận

Hệ thống miễn dịch đóng một vai trò quan trọng trong phòng chống ung thư (Zamarron & Chen,
2011; Zhang và cộng sự, 2011). Nhiều nghiên cứu cho thấy hoạt động chống ung thư của
polysaccha từ một số loại thảo mộc truyền thống của Trung Quốc có thể đạt được bằng cách cải
thiện khả năng miễn dịch (Gao, Bi, Ma, & Lu, 2010; Jeong, Koyyalamudi, Jeong, Song, & Pang,
2012; Wenner et al., 2012). Việc phát hiện và xác định các loại thuốc chống ung thư mới, có thể
làm tăng cường chức năng miễn dịch đã trở thành mục tiêu quan trọng của nghiên cứu về miễn
dịch học và điều trị ung thư (Yuan, Song, Li, Li, & Dai, 2006). Do đó, chúng tôi đã phân lập
SMPA polysac- tinh khiết từ rễ của S. miltiorrhiza và nghiên cứu tác dụng của SMPA đối với
đáp ứng miễn dịch ở chuột trong dạ dày để phân tích cơ chế hoạt động chống ung thư của nó.
MNNG đã được sử dụng thành công để gây ung thư dạ dày ở chuột bằng cách tiêm tĩnh mạch
trong 15 tuần liên tục. Theo dõi SMPA (200 mg / kg) trong 6 tuần nữa không chỉ làm tăng trọng
lượng cơ thể, mà còn cải thiện các chỉ số cơ quan miễn dịch, chẳng hạn như lá lách và tuyến ức.
Những kết quả này chứng minh rằng SMPA có tác dụng chống ung thư thông qua kích hoạt phản
ứng miễn dịch của sinh vật chủ và không cho thấy tác dụng phụ rõ rệt.
Tăng sinh tế bào lympho là chỉ số trực tiếp nhất về tình trạng miễn dịch của vật chủ (Tu, Sun, &
Ye, 2008). Phản ứng miễn dịch của cơ thể đối với một khối u bao gồm cả miễn dịch tế bào và thể
dịch (Reuschenbach, von Knebel Doeberitz, & Went chụcen, 2009). Phản ứng miễn dịch thể dịch
của tế bào lympho B là một phản ứng kháng thể kháng nguyên đặc hiệu. Phòng thủ miễn dịch
qua trung gian tế bào được trung gian đặc biệt bởi tế bào lympho T, đóng vai trò quan trọng
trong việc tăng cường chức năng miễn dịch của sinh vật (Ali, Kumar, Naqvi, & Rao, 2013). Khả
năng khơi gợi khả năng miễn dịch tế bào T và B hiệu quả có thể được thể hiện bằng cách kích
thích đáp ứng tăng sinh tế bào lympho (Marciani et al., 2000). Người ta thường biết rằng Con A
kích thích tế bào T và LPS kích thích tăng sinh tế bào B. Thử nghiệm tăng sinh cho thấy SMPA
có thể thúc đẩy đáng kể sự tăng sinh tế bào lách Con A-, LPS hoặc kích thích trung bình trong
các cytokine như IL-1␤, IL-6, TNF-và GMCSF đóng vai trò là yếu tố tăng trưởng autocrine cho
sự hình thành khối u. Các cytokine này có thể là di căn hoặc pro-angiogen và điều hòa của các
cytokine này có liên quan chặt chẽ với viêm mãn tính và ung thư (Aggarwal, Shishodia, Sandur,
Pandey, & Sethi, 2006; Obameso, Akinyele, Oladunmoye, 2011 , 2011). Cùng với các cytokine
tiền viêm, còn có các cytokine chống viêm (IL-2, IL-4, IL-10). Chúng có tác dụng ngược lại,
trong đó chúng giúp hạn chế bất kỳ tình trạng viêm nào. IL-2 là một cytokine quan trọng được
bài tiết bởi các tế bào T được kích hoạt, thể hiện các hoạt động tế bào học cao chống lại các tế
bào khối u tự trị (Xu et al., 2009a). IL-4 đã được chứng minh là có tác dụng ức chế trực tiếp
nhưng khiêm tốn đến sự phát triển của các tế bào khối u khác nhau in vitro và in vivo, bao gồm u
ác tính ở người, u lympho B ác tính không Hodgkin, và đại tràng, thận, dạ dày và vú ung thư
biểu mô (Luo & Wu, 2011). IL- 10 là một cytokine điều hòa miễn dịch quan trọng ức chế chức
năng tế bào T bằng cách ngăn chặn sự biểu hiện của các cytokine tiền viêm (chủ yếu là các
cytokine Th1), như IL-1␤, IL-6, TNF-, IL-8 và IL-12 Malefyt và cộng sự, 1991). Hơn nữa, ba
nhóm immunoglobulin chính (IgG, IgA và IgM) đã được chứng minh để cung cấp phần lớn khả
năng miễn dịch cho hầu hết các tác nhân hoặc khối u truyền nhiễm (Staff et al., 2012). Kết quả
hiện tại của chúng tôi cho thấy điều trị SMPA có thể làm tăng nồng độ IL-2, IL-4, IL-10 trong
máu và giảm nồng độ IL-6 và TNF-in ở chuột ung thư dạ dày. Ngoài ra, điều trị SMPA vẫn có
thể tăng cường nồng độ IgA, IgG và IgM trong máu ở chuột ung thư dạ dày. Những kết quả này
cho thấy rằng điều trị SMPA có thể cải thiện chức năng miễn dịch ở chuột ung thư dạ dày một
phần thông qua việc ức chế sản xuất cytokine tiền viêm và thúc đẩy sản xuất kháng thể cytokine
và immunoglobulin chống viêm.
Tế bào NK và CTL đại diện cho hai quần thể tế bào lympho gây độc tế bào (Xu, Yao, Sun, &
Wu, 2009b) và đóng vai trò chính trong việc bảo vệ chống lại cả khối u và virus (Andersen,
Schrama, Thor Straten, & Becker, 2006; Boon và cộng sự, 1994; Kawai & Akira, 2006; Smyth
và cộng sự, 2005). Cả hai đều có thể tiêu diệt các tế bào tự thân bị nhiễm mầm bệnh nội bào,
cũng như các tế bào khối u. Tế bào NK là một loại tế bào lympho gây độc tế bào quan trọng đối
với hệ thống miễn dịch bẩm sinh. Vai trò của tế bào NK tương tự như tế bào T gây độc tế bào
(CTL) trong đáp ứng miễn dịch thích nghi của động vật có xương sống (Vivier et al., 2011). Hầu
hết các thụ thể tế bào T biểu hiện CTL (TCR) có thể nhận ra một kháng nguyên cụ thể thường
được sản xuất bởi các tế bào ung thư hoặc virus. Tuy nhiên, không giống như CTL, việc tiêu diệt
tế bào NK là không đặc hiệu. Các tế bào NK không cần nhận ra kháng nguyên / MHC trên các tế
bào đích và có thể phản ứng chống lại và phá hủy một tế bào đích mà không cần phải ngồi trước
nó. Do đó, chúng tôi đã đo các hoạt động gây độc tế bào của NK và CTL bằng cách sử dụng xét
nghiệm phát hành 51Cr. Kết quả hiện tại của chúng tôi cho thấy SMPA gây ra sự tăng cường
hoạt động tiêu diệt tế bào NK và CTL từ tế bào lách ở chuột ung thư dạ dày, cho thấy SMPA có
thể tăng cường các hoạt động tế bào học đặc hiệu và không đặc hiệu chống lại khối u trong cơ
thể.
Đại thực bào là thực bào quan trọng nhất và đóng vai trò thiết yếu và then chốt trong việc bảo vệ
vật chủ chống lại mọi loại tế bào xâm lấn bao gồm các tế bào khối u (Katsiari, Liossis, &
Sfikakis, 2010). Đại thực bào bảo vệ vật chủ bằng thực bào, hiện diện kháng nguyên đối với tế
bào lympho và giải phóng nhiều yếu tố tế bào làm chậm hoạt động của các tế bào khác (Jiao et
al., 2009). Trong thí nghiệm, polysacarit SMPA đã tăng cường đáng kể các chức năng thực bào
của đại thực bào phúc mạc ở chuột ung thư dạ dày, ngụ ý rằng phản ứng miễn dịch này cũng có
thể góp phần vào cơ chế chống khối u của SMPA in vivo.
Hơn nữa, SMPA làm tăng rõ rệt nồng độ granzyme-B trong tế bào lách chuột, cho thấy SMPA
tăng hoạt động NK / CTL ít nhất một phần thông qua việc tăng mức độ nội bào của phân tử tế
bào này, cho thấy đặc tính chống ung thư của nó. IFN-là cytokine đặc trưng của các tế bào T
CD4 + loại Th1 có đặc tính chống khối u và điều hòa miễn dịch (Blankenstein & Qin, 2003).
IFN-␥ có thể ức chế sự tăng sinh tế bào và sự hình thành mạch trong môi trường vi mô khối u
(Masuda et al., 2009; Wang, Zhu,
& Lin, 2012). Trong nghiên cứu hiện tại, hàm lượng IFN-␥ được tiết ra bởi các tế bào lách trong
chuột ung thư dạ dày đã tăng đáng kể bởi SMPA. Sự gia tăng cũng có thể giải thích các đặc tính
chống ung thư của polysacarit này.
Ở giai đoạn nghiên cứu này, kết quả của chúng tôi cung cấp một manh mối cho thấy SMPA
dường như đáng được xem là một tác nhân kích thích miễn dịch hiệu quả trong điều trị khối u
nơi xảy ra ức chế miễn dịch. Cần điều tra thêm để làm sáng tỏ và xác nhận hiệu quả của việc
khôi phục đáp ứng miễn dịch của SMPA trong điều trị khối u.

Lời cảm ơn

Công trình này được hỗ trợ bởi Cơ quan khoa học tự nhiên quốc gia Trung Quốc (cấp số
81200330 và số 81272201