CRISPR

1. Sơ lược cơ chế phân tử

2. CRISPR-technology applications
2.1. Editing – Expression gene
Base editing
Prime editing
Gene expression
Epigenetic modifications
2.2. HUMAN HEALTH APPLICATIONS
GENETIC DISEASES
Rối loạn máu di truyền (Hemoglobinopathies)
Thalassemia có 2 loại thiếu chuỗi alpha & và thiếu chuỗi beta. Βthalassemia là do
các đột biến khác nhau bao gồm các đột biến điểm hoặc chèn, mất đoạn trong gen beta
globin, dẫn đến mất hoặc giảm tổng hợp beta globin. Bệnh hồng cầu hình liềm là do đột
biến Glu thành Val trong tiểu đơn vị beta globin của hemoglobin dẫn đến hemoglobin bất
thường. Biểu hiện lại các gen γ-globin tương tự là một chiến lược phổ biến để cải thiện
các rối loạn ở gen β-globin. Chiến lược trong điều trị bệnh hồng cầu hình liềm là ức chế
gene BCL11A có chức năng ức chế gene γ-globin từ đó làm tăng biểu hiện γ-globin. Cho
đến nay, ba thử nghiệm lâm sàng nhằm điều trị bệnh nhân mắc β-thalassemia và bệnh
hồng cầu hình liềm nặng do truyền CRIPSR / Cas9 đã chỉnh sửa CD34 + ở người HSC
(CTX001) đã được CRISPR Therapeutics và Công ty TNHH Khoa học và Công nghệ Y
tế Allife khởi xướng vào năm 2019.

1
2. Bệnh mắt di truyền
Bệnh u mỡ bẩm sinh Leber (LCA) là một bệnh di truyền về mắt hiếm gặp, biểu
hiện là mất thị lực nghiêm trọng khi mới sinh hoặc trẻ sơ sinh. LCA10 do đột biến gen
CEP290 gây ra là một chứng loạn dưỡng võng mạc nghiêm trọng. Cách tiếp cận này sử
dụng SaCas9 để loại bỏ mối nối sai lệch được tạo ra bởi đột biến IVS26. Trong mô hình
chuột nhắt CEP290 IVS26 ở người, hơn 94% mắt được điều trị đạt được mức chỉnh sửa
mục tiêu điều trị (10%) khi liều AAV không dưới 1x10 12 vg/ml. Allergan và Editas
Medicine đã bắt đầu thử nghiệm lâm sàng EDIT-101 để điều trị LCA10.

2
3
 Tổng quan về cơ chế chỉnh sửa nucleotide. Bộ đệm (đường màu đỏ) liên kết với sợi bổ
sung của nó với DNA (1) hướng nickase H840A SpCas9 đến liên kết với vùng chứa PAM
(mũi tên đen) của DNA đích (2) . Sau đó, trình tự liên kết mồi (PBS) lai với DNA được
gắn vào (3) , bắt đầu kéo dài đầu 3 ′ tự do theo trình tự khuôn mẫu phiên mã ngược
(RTT) mang bản chỉnh sửa đã thiết lập (4) . Sợi mới được tổng hợp dẫn đến việc cắt bỏ
đầu 3 ′ hoặc 5 ′. Việc cắt bỏ đầu 5 ′ được ưu tiên, và nó dẫn đến sự hình thành
heteroduplex (5). Việc thay thế trình tự ban đầu thông qua cơ chế sửa chữa không phù
hợp DNA nội sinh kết hợp đột biến mong muốn tại vị trí đích (6).
3. Bệnh gan di truyền
Bệnh tyrosinemia loại I (HTI) di truyền bị mất chức năng do đột biến FAH tích tụ
các chất chuyển hoá độc hại gây tổn thương gan. CRISPS/Cas qua trung gian HDR đã
được sử dụng để sửa FAHmut/mut trong mô hình chuột HTI bằng cách tiêm các plasmid
mã hoá các thành phần CRISPR/Cas hoặc bằng tiêm kết hợp AAV mang mẫu HDR và
sgRNA và các hạt nano với Cas9 mRNA. VanLith và cộng sự cấy các tế bào gan đã được
chỉnh sửa với FAH đã được sửa chữa vào những con chuột loại bỏ FAH và những con
chuột HTI đã được chữa khỏi. Song et al. đã sử dụng ABE trong mô hình HTI của chuột
trưởng thành để điều chỉnh đột biến điểm FAH. Ngoài việc điều chỉnh FAH, một số
nhóm đã loại bỏ hydroxyphenylpyruvate dioxgenase (HPD), hoạt động ở bước thứ 2 của
quá trình dị hoá tyrosine và là một enzym ngược dòng của FAH, để ngăn chặn sự tích tụ
chất chuyển hoá độc hại và điều trị chuyển hoá HTI. Bệnh nhân bị thiếu alpha-1
antitrypsin (AATD) phát triển bệnh gan do alen đột biến tăng chức năng độc hại, cũng
như bệnh phổi tiến triển do mất chức năng AAT antiprotease. CRISPR/NHEJ qua trung
gian Cas đã được sử dụng để phá vỡ AAT đột biến nhằm giảm kiểu hình bệnh lý ở gan,
trong khi HDR được sử dụng để sửa đột biến AAT.

4
 Cấy ghép các tế bào gan đã chỉnh sửa gen ex vivo có thể chữa khỏi. (A) Sơ đồ mô tả quy
trình ex vivo . Tế bào gan Fah - / - được phân lập từ một con chuột hiến tặng, sau đó
chuyển nạp với LV-Cas9 và AAV-HT, được nuôi cấy trong thời gian <24 giờ, và được
cấy ghép vào chuột Fah - / -. Một nhóm chuột (n =3) đã được phẫu thuật cắt một phần
gan tại thời điểm cấy ghép. Nhóm thuần tập thứ hai (n =3) chỉ được tiêm lách. Sau chu
kỳ 6 tháng, phân tích dữ liệu sinh hóa và mô học đã được thu được. (B) Các con chuột đã
được bật và tắt NTBC theo chu kỳ (thanh màu xám) sau khi cấy ghép cho đến khi thu
được thập mô. (C) Sự thay đổi trọng lượng trung bình (n =3 cho mỗi nhóm) từ ngày thứ
5 sau cấy ghép cho thấy rằng những con chuột được cắt một phần gan (Hx) trở nên ổn
định về trọng lượng nhanh hơn những con chuột không được cắt một phần gan.
Nghiên cứu này nhằm mục đích chỉnh sửa di truyền và chữa bệnh kiểu hình cho
một mô hình chuột HT1 thông qua việc sử dụng một mẫu tương đồng và protein Cas9
được phân phối bởi vectơ virus bằng cách sử dụng một giao thức ex vivo . Sau khi cung
cấp LV-Cas9 và AAV-HT cho các tế bào gan đã được tinh lọc và cấy ghép chúng bằng
cách tiêm vào trong lách, chuột nhận được thay đổi chu kỳ bật và tắt NTBC để khuyến
khích sự gia tăng của các tế bào hiệu chỉnh cho đến khi đạt được mức tăng cân không phụ
thuộc vào NTBC. Như được thể hiện qua hồ sơ trọng lượng, dữ liệu sinh hóa và hình ảnh
mô học, việc điều trị đã thành công, lần đầu tiên chứng minh khái niệm về chỉnh sửa gen
hướng tế bào gan ex vivo bằng cách sử dụng CRISPR / Cas9.
4. ứng dụng CRISPR trong điều trị bệnh bằng chỉnh sửa gene tế bào gốc.

5
 Bằng cách tiêm đồng thời Cas9 mRNA, gRNA và DNA người cho allele đột biến
CCR5Δ32 tự nhiên đã được chuyển thành công vào các phôi người 3PN ở giai đoạn sớm.
Gen đột biến sẽ thay thế protein CCR5 theo cách ngăn cản virus HIV xâm nhập vào tế
bào T đích gây nhiễm. Phân tích di truyền cho thấy 4 trong 26 phôi người đã được biến
đổi thành công. Tuy nhiên, không phải tất cả các nhiễm sắc thể của phôi đều chứa đột
biến CCR5Δ32. Một số phôi có chứa CCR5 chưa được biến đổi, trong khi một số khác lại
có các đột biến indel khác (Kang et al., 2016). Năm 2016, các nhà khoa học Trung Quốc
đã tiến hành thử nghiệm lâm sàng đầu tiên sử dụng phương pháp chỉnh sửa gen CRISPR
cho bệnh nhân ung thư phổi tế bào không nhỏ, di căn, không đáp ứng hóa trị, xạ trị hay
bất kỳ liệu pháp nào. Các tế bào T được tách từ máu bệnh nhân, sau đó sử dụng CRISPR
để loại bỏ gen mã hóa protein PD-1 có chức năng điều hòa đáp ứng miễn dịch của tế bào
T để ngăn chặn chúng tấn công các tế bào khỏe mạnh. Các tế bào T đã chỉnh sửa gen PD-
1 này được nhân bản và đưa vào mạch máu của bệnh nhân với hy vọng có thể tấn công và
tiêu diệt bệnh ung thư. Theo Lei Xu và cộng sự (2019) đã cấy ghép tế bào gốc và tế bào
gốc tạo máu được cắt bỏ CCR5 đã được chỉnh sửa CRISPR(HSPC) vào một bệnh nhân bị
nhiễm HIV-1 và bệnh bạch cầu nguyên bào lympho cấp tính. Bệnh bạch cầu nguyên bào
lumpho cấp tính đã thuyên giảm hoàn toàn ở người hiến tặng và tế bào của người hiến
tặng mang CCR5 bị cắt bỏ vẫn tồn tại hơn 19 tháng mà không có các biến cố bất lợi liên
quan đến chỉnh sửa gen.

6
 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5542791/
Kết luận và quan điểm của việc sử dụng CRISPR/Cas trong y học
CRISPR/Cas đã cho thấy tiềm năng to lớn trong việc tạo ra các chiến lược điều trị các
bệnh di truyền và ung thư khác nhau dựa trên việc chỉnh sửa gene. Điều này giúp
CRISPR có thể đẩy nhanh việc phát hiện và phát triển các loại thuốc khác nhau nhằm đáp
ứng điều trị. Ngoài các hệ thống CRISPR/Cas khác nhau cũng đã sử dụng rộng rãi, việc
tiếp tục khám phá và phát triển các hệ thống CRISPR từ các loài sinh vật nhân sơ đã tạo
ra các công nghệ mới. Ví dụ, protein dung hợp DN1S-SpCas9 chặn các sự kiện NHEJ
cục bộ và tăng tần số HDR. Hơn nữa, các công cụ nhắm mục tiêu RNA dựa trên Cas13a
cho phép các thay đổi RNA có thể kiểm soát được về mặt thời gian, đồng thời sẽ mở rộng

7
và tạo điều kiện thuận lợi cho việc áp dụng liệu pháp RNA trong các bệnh ở người. Trước
khi áp dụng CRISPR để chỉnh sửa bệnh ở người, cần có những nổ lực để tối ưu hoá và tối
đa hoá hiệu quả chỉnh sửa cũng như giảm thiểu các việc off-target của CRISPR và phát
triển các công cụ mới để nâng cao tính chính xác trong việc chỉnh sửa gen của công nghệ
này. Khi liệu pháp gen dưa trên CRISPR/Cas đi vào thử nghiệm lâm sàng, công nghệ này
có tiềm năng lớn để điều trị các bệnh di truyền, đặc biệt là các bệnh nan y hiện nay và
tăng cường các liệu pháp tế bào.
2.3. PLANTS APPLICATIONS
Plant Disease Resistance
Hệ thống CRISPR-Cas được sử dụng trên các loài thực vật khác nhau nhẳm nâng
cao khả năng kháng bệnh và mầm bệnh của cây trồng. Trong đó, các ứng dụng phổ biến
là tạo phức hợp có khả năng phân cắt (phá hủy) RNA hoặc DNA của virus, ngoài ra,
chiến lược khác được sử dụng rộng rải là cải tạo hệ gene của thực vật bằng cách gây đột
biến một số gene cụ thể nhằm cây cao khả năng kháng bệnh. Các ứng dụng phổ biến
được nghiên cứu phổ biến hiện nay trên cây cà chua (Solanum lycopersicum) và cây
thuốc lá (Nicotiana benthamiana) nhằm phát triển khả năng chống lại virus vàng lá cà
chua (Tomato yellow leaf curl virus - TYLCV), phân cắt RNA sợi đơn của virus khảm củ
cải (TuMV) ở cây thuốc lá (N. benthamiana), sản xuất lúa mì bánh mì miễn nhiễm với
bệnh phấn trắng bằng cách gây đột biến gen TaMLO-A1 và TaMLO-B, tạo ra bông đơn
bội có khả năng chống lại bệnh héo do nấm Verticillium. Đáng chú ý là nghiên cứu sử
dụng CRISPR để chống lại nấm đạo ôn Magnaporthe oryzae, một trong những nguyên
nhân gây thiệt hại to lớn đến sản xuất lúa trên toàn cầu.
Trong đó, việc sử dụng CRISPR để chống lại bệnh nấm đạo ôn Magnaporthe
oryzae được Andrew J. Foster và cộng sự (2020) cho thấy tính hiệu quả cao và cho phép
thực hiện các chỉnh sửa nucleotide đơn lẻ mà không có bất kỳ thay đổi nào khác trong
hoặc xung quanh một vị trí mục tiêu nhất định. Theo đó, sử dụng các đoạn mồi vào vùng
gene của nấm đạo ôn nhằm nhận biết sự thay đổi về sắc tố của nấm và thay đổi amino
acid trong protein từ đó làm thay đổi đặc tính gây bệnh của nấm.

8
 Phức hợp CRISPR-cas9 sẽ gây ra các đột biến indels trong vùng gene.

Các đột biến xuất hiện làm thay đổi amino acid, tại vị trí G247E, G234D làm cho nấm
trở nên nhạy cảm hơn của nhiệt độ 30°C – từ đó hạn chế độc tính của nấm trên cây.
Tượng tự với đột biến G247D.

9
 Nghiên cứu đã chỉnh sửa bộ gen kháng bệnh ở cà chua bằng cách sửa đổi một gen
cụ thể liên quan đến khả năng kháng bệnh. Cụ thể, bất hoạt một gen đơn lẻ gọi là DMR6
(downy mildew resistance 6) tạo ra khả năng kháng một số mầm bệnh ở Arabidopsis
thaliana. Gen này được điều chỉnh cụ thể trong quá trình lây nhiễm mầm bệnh và các đột
biến trong gen dmr6 dẫn đến tăng nồng độ axit salicylic. Ở cà chua SlDMR6-1
orthologue Solyc03g080190, bằng cách sử dụng hệ thống CRISPR-Cas9 đã tạo ra các cây
cà chua có sự mất đoạn nhỏ trong gen SlDMR6-1 dẫn đến hiện tượng lệch khung và cắt
ngắn protein. Đáng chú ý, những đột biến này không có tác động bất lợi đáng kể về sinh
trưởng và phát triển trong điều kiện nhà kính và cho thấy khả năng kháng bệnh đối với
các mầm bệnh khác nhau, bao gồm P. syringae , P. capsici và Xanthomonas spp.

10
 P. capsici gây bệnh oomycete cũng đã được thử nghiệm, và nó có thể lây nhiễm cho cả
loại hoang dã và dòng dmr6, nhưng các triệu chứng phát triển sớm hơn và nghiêm trọng
hơn ở các cây WT.
CRISPR-Cas9 đã được sử dụng để sản xuất lúa mì bánh mì miễn nhiễm với bệnh
phấn trắng bằng cách gây đột biến gen. Trong đó, bằng cách knock-down gene TaEDR1.
thiết kế để nhắm mục tiêu vào vùng được bảo tồn cao trong exon thứ tư. Sự di truyền ổn
định của đột biến Taedr1 sang thế hệ T 1 đã được xác nhận đối với tất cả các dạng đột
biến T 0 với tỷ lệ truyền 97,5–100%. Tóm lại, các đột biến loại bỏ TaEDR1 trong lúa mì
đã tăng cường khả năng chống lại bệnh phấn trắng và được truyền ổn định sang thế hệ
sau.

11
 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/tpj.13599
Ngoài ra, nghiên cứu của Chao Li và cộng sự (2017). tạo ra bông đơn bội có khả
năng chống lại bệnh héo do nấm Verticillium sử dụng hai sgRNA — GhMYB25- like-
sgRNA1 và sgRNA2.Trong nghiên cứu này, hai sgRNA, GhMYB25-like-sgRNA1 và
GhMYB25-like-sgRNA2, được thiết kế trong các vùng gen giống hệt nhau
của GhMYB25-like A và GhMYB25-like D , được mã hóa bởi codon A subgenome và D
subgenome tương ứng, được lắp ráp để chỉnh sửa trực tiếp bộ gen bông dị bội qua trung
gian Cas9. Cụ thể, khi PRC kiểm tra xảy ra hiện tượng cắt ngắn được kích hoạt ở
CRISPR-Cas9, hoặc từ vùng gen A giống GhMYB25 bị cắt ngắn hoặc từ vùng gen D
giống GhMYB25 bị cắt ngắn. Sự xóa đoạn dài của bộ gen đòi hỏi hoạt động phức hợp
Cas9-sgRNAs cao để đảm bảo hai vị trí phân cắt được thiết kế được nhận biết và phân cắt
một cách hiệu quả. Ngoài ra, tính năng chính xác và hiệu quả cao của hệ thống CRISPR -
Cas9 này đối với việc xóa đoạn DNA dài cung cấp khả năng thay thế hiệu quả khu vực
bộ gen không mong muốn bằng cách đưa vào bất kỳ đoạn trình tự được thiết kế mong
muốn thông qua cơ chế sửa chữa HRD DNA nội sinh. Kết quả giải trình tự cũng chứng
minh rằng tần số đột biến 100% và 98,8% lần lượt xảy ra trên vị trí đích GhMYB25-like-
sgRNA1 và GhMYB25-like-sgRNA2. Hiệu ứng ngoài mục tiêu được đánh giá bằng cách
sắp xếp trình tự hai vị trí giả định ngoài mục tiêu, chúng có 3 và 1 nucleotide không khớp
với GhMYB25-like-sgRNA1 và GhMYB25-like-sgRNA2, tương ứng; tất cả các mẫu
được kiểm tra không được phát hiện bất kỳ sự kiện đột biến gây ra ngoài mục tiêu. Do
đó, các kết quả này đã chứng minh rằng CRISPR - Cas9 đủ điều kiện để tạo đột biến mức
độ DNA trên bộ gen cây bông dị bội với hiệu suất cao và độ đặc hiệu cao
Sử dụng CRISPR-Cas13a ở cây thuốc lá (N. benthamiana) để phân cắt RNA sợi đơn
(ssRNA) của virus khảm củ cải (TuMV).

12
 Phức hợp pCas13a-crRNA can thiệp vào TuMV-GFP ở thực vật . pCas13a làm trung
gian can thiệp vào vi rút TuMV biểu hiện GFP ở thực vật. Các cây N. benthamiana biểu
hiện pCas13a đã được xâm nhập với TRV biểu hiện crRNA và TuMV-GFP. Ở 7 dpi, thực
vật được chụp ảnh dưới tia UV để tìm GFP. Tín hiệu GFP của những cây có crRNA đích
được so sánh với những cây không có crRNA hoặc ns-crRNA.
Phát hiện của chúng tôi cho thấy Cas13a là một ribonuclease có thể được thiết lập
để nhắm mục tiêu và phân hủy bộ gen RNA của vi rút, do đó cung cấp một công cụ đầy
hứa hẹn và hiệu quả cho nhiều loại thao tác RNA và đặc biệt can thiệp chống lại vi rút
RNA ở thực vật và tế bào nhân thực nói chung.
Genome Modification for Nutritional Improvement
Kể từ lần đầu tiên sử dụng hệ thống CRISPR/Cas để chỉnh sửa gen thực vật 2013,
nhiều nhà nghiên cứu đã tập trung vào ứng dụng của CRISPR/Cas9 trong việc tăng năng
suất, sản lượng cây trồng và khả năng chống chịu. Đến nay, chỉnh sửa gen thông qua
CRISPR/Cas9 được báo cáo trên 41 cây lương thực, 15 cây công nghiệp, 6 cây lấy dầu, 8
cây cảnh, 1 cây lấy sợi và 1 cây thức ăn cho chăn nuôi.

13
 Chất lượng cây trồng quyết định bởi tính trạng bên ngoài (kích thước, màu sắc,
hình dạng, hương thơm,..) và tính trạng bên trong (chất dinh dưỡng: protein, tinh bột,
chất béo; các chất có hoạt tính sinh học: carotenoid, lycopene, γ-aminobutyric acid,
flavonoid,…). Cải thiện chất lượng cây trồng thông qua CRISPR/Cas9 tập trung vào đặc
điểm bên ngoài, chất lượng của bộ phận thu hoạch, kết cấu quả và giá trị dinh dưỡng.
Thay đổi đặc điểm vật lí
Thay đổi hình dạng và kích thước
Năng suất hạt là một đặc điểm phức tạp do nhiều gen chi phối được gọi là locus
tính trạng số lượng (QTLs: quantitative trait loci). GRAIN SIZE3 (GS3) là QTL đầu tiên
được xác định điều chỉnh kích thước hạt (Fan và cộng sự 2006), Grain number 1a (Gn1a)
là QTL đầu tiên được xác định để kiểm soát số lượng hạt (Ashikari và cộng sự 2005). Đột
biến mất chức năng domain Ỏ ở đuôi N của GS3 cho kết quả hạt dài và năng suất hạt
tăng. Giảm hoặc mất chức năng Gn1a tăng số lượng cơ quan sinh sản dẫn đến tăng năng
suất. Người ta đã thiết kế và xây dựng một vector CRISPR / Cas9 nhắm mục tiêu đến sự
gián đoạn của cả GS3 và Gn1a sử dụng phương pháp được mô tả trước đây (Shan et al.
năm 2013; Wang và cộng sự. 2015a). Năm cây gạo Japonica cụ thể là Nam Kinh 9108
(N9108), Wuyunjing 27 (W27), Yangjing 4227 (Y4227), Zhejing 22 (Z22), và Zhejing
88 (Z88) được chọn để gây đột biến có mục tiêu. Kết quả thu được chiều dài hạt dòng T1
trong tất cả các đột biến đều dài hơn giống hoang dã.

14
15
Thay đổi màu sắc
Màu thực vật được xác định bởi các sắc tố thực vật bao gồm carotenoid,
anthocyanin và polyphenol. Đặc biệt là ở các cơ quan ăn được của thực vật, màu sắc của
quả, lá và hoa chồi ảnh hưởng đến sự lựa chọn của người tiêu dung. Các nghiên cứu đã
chỉ ra rằng kiểu hình màu hồng là do không có sắc tố flavonoid trong vỏ. Do đó, việc
điều chỉnh màu sắc của trái cây có thể đạt được bằng cách phá vỡ các gen liên quan đến
con đường tổng hợp sắc tố thông qua CRISPR / Cas9.
MYB12, như một yếu tố phiên mã theo con đường sinh tổng hợp flavonoid, ảnh hưởng
đến sự tích tụ flavonoid và chi phối kiểu hình da hồng. Cà chua đậu quả màu hồng đã
được sản xuất thành công bằng phương pháp knockout SlMYB12.

16
Một số nghiên cứu về biến đổi màu sắc hoa đã được tiến hành. Flavanone 3-hydroxylase
(F3H) là một enzym quan trọng tham gia vào quá trình sinh tổng hợp flavonoid, không
thể thiếu cho sự tích tụ của anthocyanins. Các giống hoa torenia màu xanh nhạt đã được
tạo ra bằng cách phá vỡ F3H với CRISPR/Cas9. Nghiên cứu đã xây dựng vectơ nhị phân

17
bằng cách sử dụng chủng S. pyogenes được tối ưu hóa codon thực vật (pcoCas9) và
gRNA đích của gen torenia F3H và sau đó tạo ra 24 cây biến đổi gen bằng phương pháp
biến nạp qua trung gian Agrobacterium Sau một số lần nuôi cấy, các cây chuyển gen sẽ
ra hoa trong ống nghiệm trong vòng 8 tháng. Những bông hoa sớm nhất được quan sát
thấy chưa đầy 4 tháng. Các cây biểu hiện một số màu hoa khác nhau: 4 trong số 24 dòng
có hoa màu tím, giống với các cây đối chứng không biến đổi kiểu hoang dã. Mười lăm
dòng tạo ra hoa màu xanh lam nhạt (gần như trắng), trong khi ba dòng (số 22–24) mang
hoa màu tím nhạt. Dòng 15 bông hoa tím hoặc xanh nhạt tùy theo cành nhân giống. Dòng
số 7 cây sinh ra hoa có nhiều màu khác nhau, nhưng kiểu hình không ổn định.

Cải thiện kết cấu cây trồng

Thay đổi kết cấu quả để kéo dài thời gian bảo quản mà vẫn giữ được màu sắc,
hương vị và hàm lượng dinh dưỡng là mục tiêu mà ngành nông nghiệp hướng tới.
Một nghiên cứu cho thấy đột biến alc không chỉ kéo dài thời gian bảo quản mà còn giữ
màu sắc và hương thơm của quả. Thay thế gen qua trung gian HDR đã được sử dụng để
tạo ra các đột biến gen ALC ở cà chua, và các đột biến đồng hợp tử alc mong muốn ở thế
hệ T1 thể hiện hiệu suất lưu trữ tuyệt vời. Cơ sở phân tử của đột biến alc là sự thay thế
thymine bằng adenin ở vị trí 317 của trình tự mã hóa của gen NOR, đột biến một cặp
bazơ này là một sự thay đổi axit amin không đồng nghĩa, cụ thể là valin (Val) được thay
thế bằng axit aspartic. (Asp). Do đó, xác nhận nó là alen của gen Nor. Một hệ thống
CRISPR / Cas9 phù hợp để chỉnh sửa bộ gen thực vật đã được sử dụng để xác định hiệu
quả khi không có và có mặt của mẫu sửa chữa của dsDNA. Kết quả cho thấy rằng cả đột

18
biến locus xác định trước và các sự kiện thay thế gen mục tiêu đều có thể xảy ra tương
ứng và alen của ALC được thay thế bằng gen alc thông qua con đường sửa chữa HDR.

Figure2. Phenotypic detection of wild type fruits and mutant fruits.

(A) Phenotype Value:‘PH’meansplant height, ‘SSC’ means soluble solid content, ‘FT’
means flesh thickness, ‘CR’ means compression resistance, ‘M’ means mutation, ‘W’

19
 means wild-type. (B) Comparison of bisected fruit at the ripening stage. (C)
Developmental series of wild-type fruits (up) and mutant fruits (down). (D) Comparison
of fruits after 40 days of storage at room temperature, left is homozygous T1 mutants and
right is wild-type. Bars:1 cm.

Tăng cường hàm lượng dinh dưỡng

Sở thích của người tiêu dùng đang chuyển sang các sản phẩm thực phẩm lành
mạnh và giàu dinh dưỡng. Vì vậy, các nhà nghiên cứu đã được khuyến khích để tạo ra
các sản phẩm mới để phục vụ cho thị trường. Nhiều nguyên tố dinh dưỡng trong rau củ
quả có tác dụng kháng viêm, chống ung thư, chống oxy hóa. Các chương trình nhân
giống đã được thực hiện dựa trên quá trình vi sinh hóa các chất dinh dưỡng đa dạng bao
gồm carotenoid, axit γ-aminobutyric (GABA), hàm lượng sắt và kẽm trong các loại cây
trồng khác nhau.
Tăng hàm lượng Carotenoid
Carotenoid đã tham gia vào quá trình chống oxy hóa và ngăn ngừa các bệnh liên
quan đến mắt. Tuy nhiên, con người không thể tổng hợp carotenoid và phải ăn chúng từ
chế độ ăn uống của họ. Ngoài ra, lycopene và phytoene giúp giảm nguy cơ ung thư và
bệnh tim mạch. Trước đây, các nhà nghiên cứu đã đồng thời đưa vào gen CrtI và PSY và
tổng hợp β-caroten trong cây lúa thông qua kỹ thuật di truyền cổ điển. Tuy nhiên, loại
gạo vàng biến đổi gen (GM) như vậy đã khiến công chúng hoang mang theo chế độ quản
lý nghiêm ngặt về biến đổi gen. Chỉnh sửa bộ gen qua trung gian CRISPR / Cas9 đã được
áp dụng trong quá trình sinh tổng hợp carotenoid ở gạo, cà chua và chuối. Sự biểu hiện
quá mức của các gen tổng hợp phytoene thông qua sự kích hoạt CRISPR / Cas9 áp đặt
dòng carbon vào con đường sinh tổng hợp carotenoid. Bằng cách này, một băng
carotenogenesis chứa các gen CrtI và PSY đã được tích hợp vào vị trí mục tiêu ở lúa. Kết
quả là chủng đột biến chứa 7,9 µg / g β-caroten trọng lượng khô.
Tăng hàm lượng axit γ-Aminobutyric
GABA là chất dẫn truyền thần kinh hoạt động trong hệ thống kiểm soát huyết áp
và chống lo âu. Do đó, việc phát triển các loại thực phẩm mới giàu GABA đã trở thành
trọng tâm của ngành công nghiệp thực phẩm. Glutamate decarboxylase (GAD) là một
enzym quan trọng xúc tác quá trình khử carboxyl của glutamate thành GABA. GAD có
domain đuôi C, miền này điều chỉnh tiêu cực hoạt động của GAD. Để tăng nội dung của
GABA, đuôi C đã được xóa hoàn toàn bằng cách sử dụng CRISPR / Cas9. Sự tích lũy
GABA trong cà chua đột biến tăng gấp bảy lần
Tăng cường vi chất dinh dưỡng sinh học
Khoảng hai tỷ người hiện đang bị thiếu các vi chất dinh dưỡng, như selen, kẽm,
sắt và iốt. Tăng sinh tổng hợp vi chất dinh dưỡng cho cây trồng sẽ là một cách tiếp cận

20
bền vững cho những người có chế độ ăn uống không cân bằng. Ở cây lúa, ví dụ tiềm
năng để sử dụng phương pháp CRISPR / Cas9 là loại bỏ các gen Vacuolar Iron
Transporter (VIT), chẳng hạn như OsVIT2, để tăng hàm lượng Fe trong ngũ cốc. Trong
một nghiên cứu gần đây, sự đột biến của OsVIT2 dẫn đến tăng phân phối Fe vào phôi và
nội nhũ của hạt, và cuối cùng làm tăng hàm lượng Fe trong hạt đã đánh bóng mà không
ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất. Ngoài ra, đột biến kháng arsenite 1 (astol1) tăng cường
chức năng của gạo làm tăng đáng kể hàm lượng selen (Se) trong hạt, một vi chất dinh
dưỡng thiết yếu có tác dụng chống oxy hóa cho con người. Sự phát triển của gạo và hạt
lúa mì giàu vi chất dinh dưỡng cũng có thể được hưởng lợi từ phương pháp chỉnh sửa gen
bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của các gen liên quan đến cân bằng nội môi ion.
Các quy định về cây trồng biến đổi gen: tầm nhìn và cơ hội sử dụng kỹ thuật
CRISPR ‐ Cas9
Cây trồng biến đổi gen: cách tiếp cận chỉnh sửa bộ gen
Cây trồng biến đổi gen lần đầu tiên được thương mại hóa vào năm 1996 và đến
năm 2018, diện tích trồng trọt đã tăng gấp 113 lần và vẫn đang tiếp tục phát triển. Trong
kịch bản hiện tại, cây trồng biến đổi gen được dự đoán sẽ phát triển trên thị trường trong
thập kỷ tới. Ban đầu, cây trồng biến đổi gen như bông Bt kháng sâu bệnh và cây trồng
kháng sâu bệnh đã được đưa vào trồng đại trà. Những cây trồng này có lợi cho người
trồng do năng suất tốt hơn. Vì lợi ích của người tiêu dùng, một số cây trồng như gạo
vàng, chứa hàm lượng cao beta-carotene và ngô biến đổi gen, trong đó mức ascorbate đã
được cải thiện để ngăn ngừa bệnh scorbut được đưa vào trồng trên quy mô lớn. Cây trồng
biến đổi gen cũng rất có ảnh hưởng trong việc giảm thiểu các bệnh như bệnh tim, ung thư
và béo phì. Sự tiến bộ nhanh chóng của các công nghệ chỉnh sửa gen thế hệ mới như
CRISPR-cas9, TALEN và ZFNs có thể làm cho việc chỉnh sửa gen trở nên ưu tiên hơn và
giảm nguy cơ xuất hiện các đột biến không mong muốn để giảm nguy cơ sức khỏe
Tại sao cây trồng được chỉnh sửa CRISPR / Cas9 không được coi là cây trồng biến
đổi gen?

Cả hai phương pháp này tương đương nhau vì chúng đều gây đột biến . Bằng cách
sử dụng phương pháp CRISPR / Cas9, không có DNA ngoại lai nào còn sót lại trong cây
bị đột biến khiến nó không được xem là GMO và các quy định về GMO. Ngoài ra, gRNA
được sử dụng trong hệ thống CRISPR/Cas9 không phải là rDNA (DNA tái tổ hợp).

21
Oligonucleotide direct mechanism là cơ chế mà hướng nó tới 1 đoạn gene nhất định (có
nguồn gốc từ loài khác) được coi là GMO. Ở các sinh vật GM hoặc quá trình chuyển gen
truyền thống, không có sự kiểm soát về vị trí đưa vào gen và về sự khuếch đại của nó
(các bản sao,) trong khi ở các sinh vật GE (sử dụng nucleaza bao gồm CRISPR / Cas9),
bất kỳ gen nào cũng có thể được đưa vào hoặc xóa tại một vị trí chuyên biệt giúp sự sửa
đổi DNA. Do đó, kỹ thuật này cho thấy nhiều ưu điểm hơn GM thế hệ đầu tiên do độ
chính xác, tính chất có thể kiểm soát
Cải thiện cây trồng bằng cách sử dụng công nghệ CRISPR ‐ Cas9
Với sự gia tăng dân số, nhu cầu thực phẩm cũng tăng lên. Cải tiến cây trồng là một
nỗ lực quan trọng để đáp ứng yêu cầu này. Hệ thống CRISPR / Cas9 hoạt động như một
công nghệ mang tính cách mạng trong cải tiến cây trồng, chủ yếu tập trung vào việc cải
thiện năng suất, quản lý căng thẳng và chất lượng bằng cách loại bỏ các gen biểu hiện các
đặc điểm không mong muốn. Kỹ thuật này được sử dụng để đạt được tính kháng bệnh
phấn trắng ở lúa mì (Triticum aestivum) và cà chua bằng cách loại bỏ gen MLO. Ở đậu
nành, gen Axit béo Desaturase chuyển axit Oleic thành axit Linolenic. Hệ thống
CRISPR-cas9 có thể được áp dụng để gây đột biến ở FAD2-1A và FAD2-1B hạn chế
chuyển đổi thành axit linolenic và do đó nâng cao chỉ số dinh dưỡng và thời hạn sử dụng
của nó. Các nghiên cứu cải thiện giống cây trồng đã được đề cập ở phần trên.
Các khái niệm quản lý đối với cây trồng GE
Công nghệ CRISPR / Cas9 có tiềm năng to lớn trong việc cách mạng hóa công
nghệ nhân giống do nhắm mục tiêu chính xác gen quan tâm. Các công nghệ chỉnh sửa
gen mới này có thể tạo ra các sản phẩm tương tự như các sản phẩm được sản xuất bằng
cách chăn nuôi thông thường nhưng các quốc gia khác nhau áp dụng các cách tiếp cận
khác nhau về mặt quy định của nó. Hệ thống quản lý đối với GMO có sự khác biệt đáng
kể trên toàn cầu. Nhiều quốc gia đã thực hiện các loại hệ thống phê duyệt quản lý GMO
khác nhau, trước khi phát hành và sử dụng GMO về môi trường. Ở đây, mối quan tâm
chính là đánh giá sự an toàn của con người và rủi ro môi trường. Nhìn chung, hai cách
tiếp cận quy định khác nhau được các quốc gia khác nhau áp dụng được đề cập là quy
định dựa trên sản phẩm và quy trình.

22
 1. Hoa Kỳ

Hoa Kỳ có diện tích cây trồng biến đổi gen lớn nhất trên thế giới, với gần 75 triệu ha
vào năm 2018.Trong Hoa Kỳ, cây trồng biến đổi gen đã được đặc trưng và xác định bởi
quy luật ba thế hệ. Thế hệ đầu tiên bao gồm những đặc điểm nâng cao khả năng chống
chịu thuốc diệt cỏ và khả năng chống lại stress sinh học và phi sinh học. Thế hệ thứ hai
bao gồm những đặc điểm cải thiện dinh dưỡng cho thức ăn và thế hệ thứ ba bao gồm sản
xuất dược phẩm. Cơ quan đầu tiên là Cơ quan Bảo vệ Môi trường (EPA) điều chỉnh cây
trồng thế hệ đầu tiên theo “Đạo luật liên bang về Thuốc diệt côn trùng, Thuốc diệt nấm
và Thuốc diệt chuột”. Cơ quan quản lý thứ hai là Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm
(FDA) điều chỉnh cây trồng thế hệ thứ hai theo “Đạo luật Thực phẩm, Dược phẩm và Mỹ
phẩm Liên bang”. Những loại cây trồng này không cần được phê duyệt trước ở Hoa Kỳ
trừ khi có tài liệu về sự biểu hiện của các protein lạ khác với protein tự nhiên và chứa các
chất bảo vệ thực vật kết hợp. Cơ quan quản lý thứ ba là Dịch vụ Kiểm tra Sức khỏe Động
vật và Thực vật (APHIS), cơ quan quản lý việc bảo vệ sức khỏe thực vật và sinh phẩm
thú y, đồng thời sửa đổi chính sách, và cuối cùng, miễn thực vật hoặc sinh học thú y khỏi

23
bất kỳ quy định bổ sung nào được làm từ công nghệ CRISPR / Cas9 hoặc cây trồng trong
đó có những thay đổi nhỏ đã được đưa ra
2. Brazil

Brazil có diện tích trồng cây biến đổi gen lớn thứ hai sau Hoa Kỳ với hơn 53 triệu ha.
Đất nước này là một trong những nước xuất khẩu đậu tương, ngô và bông hàng đầu. Nghị
quyết quy phạm CNTBio số 16 (RN16) được giới thiệu vào ngày 15 tháng 1 năm 2018
dựa trên hệ thống phân tích từng trường hợp cụ thể. Tài liệu này đã được cung cấp dựa
trên các tiêu chí khác nhau, trong đó các sản phẩm được phát triển từ NBT không được
coi là GMO vì không có DNA tái tổ hợp, sự hiện diện của đột biến vòng xảy ra tự nhiên
hoặc được gây ra thông qua bức xạ và hoặc tiếp xúc với hóa chất. Do đó, nếu bất kỳ sản
phẩm nào được gắn thẻ là GMO, thì sản phẩm đó phải được kiểm tra các yêu cầu về an
toàn sinh học và chỉ được chấp thuận sau khi đánh giá mọi rủi ro. Vào tháng 12 năm
2018, một kiểu gen của ngô được coi là không biến đổi gen và được chấp thuận để
thương mại hóa ở Brazil. Cây trồng này đã được phát triển với sự trợ giúp của CRISPR-
Cas9 để vô hiệu hóa một con đường trao đổi chất cụ thể để sản xuất amylose. Tương tự,
một chủng nấm men cũng đã được phê duyệt, trong đó, thao tác di truyền của bốn gen đã
được thực hiện bằng công nghệ CRISPR-Cas9. Chủng này được phát triển để cải thiện
sản xuất rượu từ mía và nó được coi là men thông thường
3. Argentina

Argentina đã nổi lên là nước trồng cây biến đổi gen lớn thứ ba với 24,5 triệu ha. Đây
là một trong sáu quốc gia sáng lập bắt đầu trồng cây biến đổi gen. Nó đã trở thành nhà
xuất khẩu dầu đậu nành và bột đậu nành lớn nhất, nhà xuất khẩu hạt ngô lớn thứ hai, nhà
sản xuất và xuất khẩu hạt đậu nành lớn thứ ba, và nhà sản xuất cây trồng GE lớn thứ ba
sau Mỹ và Brazil. Việc áp dụng cây trồng biến đổi gen đã mang lại nền nông nghiệp bền
vững với các tác động tích cực về tài chính và sản xuất ở Argentina. Bằng cách sử dụng
công nghệ CRISPR / Cas9, Argentina đã phát triển một loại khoai tây không hóa nâu,
trong đó gen polyphenol oxidase được chỉnh sửa thành công tạo thành củ không có màu
nâu do enzym, đậu tương chịu được thuốc diệt cỏ

24
 4. Ấn Độ

Ấn Độ là quốc gia lớn thứ tư về trồng cây biến đổi gen với ước tính khoảng 11,6
MHa. Bông bt là cây trồng chuyển gen đầu tiên được Chính phủ Ấn Độ (GOI) và GEAC
(Ủy ban phê duyệt kỹ thuật di truyền) phê duyệt để trồng trọt chống lại sâu hồng đục quả.
Gần đây, công nghệ mới cũng đã tạo ra những tiến bộ trong nông nghiệp Ấn Độ, nơi có
gen được biến đổi chính xác bằng cách sử dụng RNAi và công nghệ CRISPR / Cas9 để
tạo ra những quả táo không bị thâm và khoai tây kháng bệnh mốc sương.

Quan điểm của công chúng đối với cây trồng GM và GE

Vấn đề chính mà cây trồng GM và GE phải đối mặt là sự chấp nhận của công chúng.
Những cây trồng biến đổi gen này đã được trồng thương mại từ những năm 1990 và đã
mở rộng sang nhiều quốc gia khác nhau bao gồm Mỹ, Brazil và Ấn Độ. Nhưng đồng thời,
một số người cũng không chấp nhận được các sản phẩm thực phẩm có biến đổi gen.
Nguyên nhân chính của điều này có thể là do các rủi ro tiềm ẩn về môi trường và sức
khỏe do thay đổi gen không mong muốn, thiếu tin tưởng vào các công ty hóa chất nông
nghiệp đa quốc gia, thiếu kiến thức về cây trồng GE, các vấn đề đạo đức, sự đầy đủ của
hệ thống quản lý và đột biến ngoài mục tiêu. Nhiều cuộc khảo sát cũng cho thấy ở các
nước Châu Âu, người tiêu dùng quan tâm hơn đến vấn đề an ninh lương thực. Người tiêu
dùng ở các nước Châu Âu cũng nhấn mạnh đến các vấn đề bao gồm nguồn gốc và chất
lượng của các sản phẩm thực phẩm. Để vượt qua những thách thức này, mọi người cần
hiểu rõ hơn về sự khác biệt giữa cây trồng GM và cây trồng GE với những ưu và nhược
điểm của kỹ thuật nhân giống. Cây trồng GE không có gen chuyển, do đó không có dòng
chuyển gen và không ảnh hưởng đến sự đa dạng sinh học nói chung.

25
 2.4. ANIMAL BREEDING APPLICATIONS
CRISPR Technology in Insects
Ứng dụng của CRISPR sử dụng trong nghiên cứu hệ gene của các loài côn trùng
và điều phối gene (gene drive). Các thay đổi trên NST có khả năng di truyền cho thế hệ
sau theo quy luật của Mendel có thể thay đổi quần thể côn trùng trong khoảng thời gian
vài năm. Endonuclease CRISPR-Cas9 có chức năng như gene drive systems ở Anopheles
gambiae, nguyên nhân chính gây bệnh sốt rét. Đã xác định được ba gen
(AGAP005958 , AGAP011377 và AGAP007280) tạo ra kiểu hình bất dục ở cái lặn khi khi
xuất hiện các đột biến dựa trên CRISPR-Cas9. Đối với mỗi vị trí gene đích, chúng tôi
quan sát thấy strong gene drive ở cấp độ phân tử, với tỷ lệ truyền cho thế hệ con cháu là
91,4 đến 99,6%. Các thí nghiệm mô hình quần thể và trong lồng chỉ ra rằng cấu trúc
CRISPR-Cas9 nhắm mục tiêu đến một trong những locus này, AGAP007280 , đáp ứng
yêu cầu tối thiểu đối với gene drive nhắm mục tiêu sinh sản của cá thể cái trong quần thể
côn trùng. Những phát hiện này có thể thúc đẩy sự phát triển của các gene drive tiềm
năng để ngăn chặn quần thể muỗi không có khả năng làm trung gian lây truyền bệnh sốt
rét.

26
 Ngoài ra, CRISPR được sử dụng ở côn trình điển hình trong nghiên cứu biểu hiện
và chức năng của hệ gene ở eukaryote. Một phương pháp đơn giản và hiệu quả cao để tạo
và phát hiện các đột biến của bất kỳ gen nào trong Drosophila melanogaster thông qua
việc sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9. Việc tiêm RNA vào phôi Drosophila có thể gây đột
biến gen hiệu quả cao đối với các gen mục tiêu mong muốn ở 88% số ruồi được tiêm.
Các đột biến này có thể được truyền qua dòng mầm để tạo ra các dòng ổn định. Hệ thống
của chúng tôi cung cấp hiệu quả cải thiện ít nhất 10 lần so với các báo cáo đã xuất bản
trước đây, cho phép áp dụng kỹ thuật này rộng rãi hơn. Ban đầu chúng tôi thiết kế một
sgRNA để nhắm mục tiêu đứt gãy sợi kép ở đầu exon thứ hai của gen yellow ở ruồi (y1,
Hình 2A và 2B), vì dễ dàng phát hiện các đột biến trong gene khi các vị trí đó trên cơ thể
của ruồi bị mất sắc tố. Và gene này liên kết với NST X, có nghĩa là chỉ cần đột biến xuất
hiện trên NST thì dễ dàng dẫn đến một kiểu hình có thể nhìn thấy ở ruồi đực thuộc thế hệ
được tiêm (G0).

27
 Các đột biến trên gene do CRISPR/Cas9 gây ra ở Loci yellow and white

(A) Một giản đồ của các gen yellow và white hiển thị các vị trí đích của sgRNA. Exon
được hiển thị dưới dạng hộp đen, vị trí bắt đầu phiên mã dưới dạng mũi tên và vị trí đích
của sgRNA thể hiện dưới dạng hình tam giác màu đen.
(C) Biểu hiện Mosaic yellow ở ruồi G0 được tiêm. Ruồi cái có biểu hiện mosaic yellow
khi tiêm mRNA Cas9 và sgRNA y1 được hiển thị. Có thể quan sát thấy các mảng mô đột
biến yellow (đầu mũi tên) và được phác thảo bằng các đường chấm .
(D) Biểu hiện màu trắng khảm ở ruồi G0 được tiêm. Ruồi cái và ruồi đực có biểu hiện
màu trắng khảm khi được tiêm mRNA Cas9 và sgRNA w2 được hiển thị. Có thể quan sát
thấy các mảng mô đột biến màu trắng (đầu mũi tên) .
(E) Sắp gióng cột các đột biến gây ra ở gen yellow. Dòng đầu tiên trong mỗi hàng biểu
thị trình tự kiểu WT và các dòng tiếp theo hiển thị các bản sao đột biến. Các vị trí mục
tiêu được biểu thị bằng màu cam, PAM màu đỏ và các vị trí phân cắt bằng hình tam giác
màu đen. Các vị trí đột biến xóa được thể hiện bằng dấu gạch ngang, và các đột biến
thêm hoặc thay thế được biểu thị bằng chữ thường.
(F) Sắp gióng cột các đột biến gây ra ở gen white, tương tự như (E).
CRISPR in Xenotransplantation Research
So với các ứng dụng hiện tại của công nghệ CRISPR trong các lĩnh vực y tế như
ung thư học, khoa học thần kinh hoặc sinh học phát triển, vẫn còn một số hạn chế trong
việc ứng dụng kĩ thuật này trong việc cấy ghép. Tuy nhiên, những cải tiến đầy hứa hẹn
đang tiếp tục phát triển, đặc biệt là những cải tiến liên quan đến cấy ghép xenotransplant.
Trong phần này, các ứng dụng đang thực hiện và tiềm năng trong tương lai của hệ thống
mang tính cách mạng này từ cấp độ tế bào đến cơ quan để cấy ghép sẽ được thảo luận và
tóm tắt trong hình dưới.

28
Các ứng dụng đang thực hiện và tương lai của công nghệ CRISPR để cấy ghép nội tạng.
A) Các ứng dụng của công nghệ dựa trên CRISPR ở cấp độ tế bào để cảm ứng dung sai.
B) Các chiến lược nghiên cứu qua trung gian CRISPR. C) Cấy xenot từ động vật chuyển
gen CRISPRed và động vật khảm CRISPRed cho cơ quan rắn. D) Ứng dụng CRISPR ex-
vivo tiềm năng cho các cơ quan rắn bên trong máy bơm. (ECD: Nhà tài trợ theo tiêu chí
mở rộng, SCNT: Chuyển hạt nhân tế bào xôma, HSC: tế bào gốc tạo máu, MSC: Tế bào
gốc trung mô).

1. In vivo and ex vivo gene editing at cellular level

Các thử nghiệm lâm sàng dựa trên CRISPR ban đầu (tổng cộng 33 nghiên cứu giai
đoạn I / II) được thực hiện để chữa bệnh ung thư và các bệnh liên quan đến tế bào máu
bằng cách điều khiển tế bào T và tế bào gốc tạo máu (HSC) ex-vivo. Các nghiên cứu liên
quan đến tế bào gốc đa năng (PSC) và tế bào gốc cảm ứng (iPSC) kết hợp với chỉnh sửa
gen CRISPR đã mở ra cơ hội to lớn để hiểu y học tái tạo và các cơ sở bệnh tật. Các nhà
nghiên cứu vẫn chưa thể tạo ra một cơ quan từ tế bào gốc in vitro với công nghệ hiện tại.
Mặt khác, trong bệnh di truyền tyrosinemia loại 1 (HT1), cấy ghép tế bào gan/tế bào gan
dị sinh có tiềm năng điều trị. Các nghiên cứu trên chuột của bệnh này, cả CRISPR in vivo
và ex-vivo thực hiện chỉnh sửa gen trong tế bào gan đã cải thiện sự trao đổi chất ở gan và
chứng minh tiềm năng của hệ thống CRISPR như một liệu pháp thay thế cho việc cấy
ghép tế bào / cơ quan. Một mục tiêu tiềm năng khác cho liệu pháp dựa trên tế bào là tế
bào mô đệm / gốc trung mô (MSC) do đặc tính chống viêm, điều hòa miễn dịch và sửa
chữa mô có thể đóng những vai trò quan trọng trong quá trình cấy ghép nội tạng. Thao
tác CRISPR đối với các tế bào đó sẽ chứng minh các phương pháp điều trị tiềm năng
trong tương lai gần.

29
 2. Gene editing at organ level
Nhu cầu ngày càng tăng của những người hiến tặng nội tạng cho bệnh nhân giai đoạn
cuối buộc các nhà nghiên cứu và bác sĩ lâm sàng phải đánh giá các lựa chọn thay thế (ví
dụ như cấy ghép xenotransplant, organoids, 3D bioprinting). Các phương pháp thay thế
này đang tận dụng những phát triển từ công nghệ CRISPR để rút ngắn thời gian cần thiết
cho việc chuyển các ứng dụng từ tiền lâm sàng sang nghiên cứu lâm sàng.
Xenotransplantation and humanized pig liver
Động vật trang trại và động vật linh trưởng không phải con người (NHP) đã được coi
là nguồn cung cấp nội tạng thay thế kể từ những năm 1900 cùng với một số vấn đề về y
tế, luật pháp và đạo đức. Tinh tinh và khỉ đầu chó đã được sử dụng trong những thử
nghiệm ban đầu, nhưng trong thời đại hiện đại của phương pháp cấy ghép ngoài da, lợn
hiện đang được ưa chuộng hơn do kích thước cơ quan tương tự của chúng, dễ sinh sản và
ít nguy cơ truyền bệnh hơn so với NHP. Tuy nhiên, vẫn còn ba rào cản chính ngăn cản
việc cấy ghép nội tạng từ lợn sang linh trưởng (người) thành công: i) Glycans trên bề mặt
tế bào nội mô của lợn hoạt động giống như xenoantigens (α-Gal, Neu5Gc, SDa) và gây ra
đào thải hyperacute (HAR) , ii) rối loạn đông máu do sự bất đồng giữa hệ thống đông
máu của lợn và người (THBD, TFPI, CD39) và iii) các retrovirus nội sinh của lợn
(PERV) trong bộ gen của lợn có thể truyền theo chiều dọc vào tế bào người và gây ra
bệnh hẹp bao quy đầu. Do hiệu quả và tính đơn giản của chỉnh sửa gen CRISPR. Gần
đây, G. Church và các đồng nghiệp đã thiết lập lợn chuyển gen tiên tiến nhất bằng cách
sử dụng công nghệ CRISPR, trong đó họ đã xóa thành công 3 gen lợn (GGTA1, CMAH,
B4GALNT2) và đặc biệt đưa vào 9 gen chuyển của người (CD46, CD55, CD59, B2M,
HLA- E, CD47, THBD, TFB1, CD39) trong một locus duy nhất cùng với sự bất hoạt của
25 locus PERV trong tế bào lợn . Các công ty công nghệ sinh học như eGenesis (Boston),
Qihan (Trung Quốc) và United Therapeutics (MD) đã đẩy nhanh tiến độ để bắt đầu thử
nghiệm đầu tiên trên người. Những cải tiến hơn nữa có thể được dự đoán ở những động
vật chuyển gen này sau khi đánh giá kết quả của các thử nghiệm đầu tiên dẫn đến hiểu rõ
hơn về cơ chế đáp ứng miễn dịch xeno. Một cách khả thi để cải thiện quá trình cấy ghép
xenot là xác định các gen mới không phải là gal xenoantigens và sàng lọc CRISPR toàn
bộ gen mạnh mẽ có thể là một phương pháp phù hợp để đánh giá vai trò của các gen lợn
liên quan đến việc đào thải miễn dịch. Tính đến ngày hôm nay, chỉ có một nghiên cứu
được thực hiện với thư viện CRISPR lợn. Đáng chú ý, công nghệ CRISPR với các tiện
ích trong tương lai có thể sẽ cải thiện tính khả thi của dự án bộ gen (GP) - nhằm mục đích
tạo ra một bộ gen không có các gene của virus và với mong muốn có được các gene đã
chỉnh sửa.
Chimeric Organs and Blastocyst Complementation

30
 Với các công nghệ hiện nay, không thể tạo ra các bộ phận cơ thể người in vitro ; tuy
nhiên, động vật có thể xem như là nơi để sản xuất ít nhất một phần nội tạng của con
người. Về lý thuyết, các cơ quan khảm phù hợp với miễn dịch và cụ thể của bệnh nhân có
thể được tạo ra bằng cách tiêm tế bào gốc/đa năng của người vào phôi nang động vật (bổ
sung phôi bào) hoặc cơ quan đích của tử cung (cấy ghép tử cung). Tuy nhiên, tỷ lệ
chimerism (chỉ một cơ thể sinh vật hoặc một mô hay một cơ quan mang nhiều bộ nhiễm
sắc thể khác nhau (gồm nhiều bộ ADN khác nhau), thường được tạo thành qua sự hợp
nhất của nhiều hợp tử khác nhau hoặc sự dung hợp các bộ gen của các loài khác nhau) là
rất thấp đối với chimeras giữa các loài như người/lợn hoặc người / cừu. Chỉnh sửa gen
CRISPR làm tăng the efficiency of human/animal chimerism của người / động vật bằng
cách vô hiệu hóa sự phát triển của cơ quan cụ thể trong hợp tử vật chủ có thể được lấp
đầy bởi tế bào người. Trong các nghiên cứu tạo cơ quan chimeric trong tương lai, các nhà
khoa học sẽ sử dụng lợn hoặc cừu chuyển gen qua trung gian CRISPR tiên tiến nhất làm
nguồn cung cấp hợp tử và động vật thay thế.
Application CRISPR increasing food production

31
 Cho đến nay, động vật trang trại đã được biến đổi gen, bao gồm: lợn, gia súc, cừu, dê
và cá da trơn. Một trong những gen được biến đổi gen đầu tiên ở động vật trang trại là
myostatin . Những thay đổi trong gen này có thể cải thiện đáng kể hiệu quả kinh tế của
sản xuất thịt. Ruiqiang Li và cs (2020) sử dụng CRISPR để đưa vào thành công hai đột
biến (PVD20H và GP19del) trong MSTN vùng signal-peptide của giống lợn bản địa
Trung Quốc, lợn Đốm Nhỏ Liang Guang. Cả hai đột biến ở signal-peptide đều làm tăng
khối lượng cơ mà không ức chế sản xuất peptit MSTN trưởng thành trong tế bào. Phân
tích mô cho thấy khối lượng cơ tăng lên ở lợn MSTN+/PVD20H chủ yếu là do sự gia
tăng số lượng các sợi cơ. Ngoài ra, kĩ thuật knock-out gene MSTN bằng CRISPR ở dê và
thỏ cũng ghi nhận kết quả khả quan khi làm tăng trọng lượng sơ sinh và tăng đáng kể tỷ
lệ trọng lượng của cơ tứ đầu và cơ bắp tay so với toàn bộ cơ thể ở thỏ, và tốc độ sinh
trưởng giai đoạn đầu của dê. Các đột biến liên quan đến kiểu hình cơ bắp kép ở bò Bỉ
Blue và bò Piedmontese được tìm thấy trong gen MSTN, dẫn đến sự gia tăng đáng kể về
cơ bắp so với bò thông thường. Trong nghiên cứu này, CRISPR / Cas9 đã được sử dụng
để nhắm mục tiêu thành công gen ức chế cơ MSTN trên cá da trơn (Ictalurus dotatus).
CRISPR / Cas9 gây ra tỷ lệ đột biến cao (88–100%) ở các vị trí mã hóa protein mục tiêu

của MSTN. Cá được chỉnh sửa MSTN có nhiều tế bào cơ hơn so với đối chứng và trọng
lượng cơ thể trung bình của cá được chỉnh sửa gen tăng 29,7%.

a Hình ảnh lợn MSTN+/ PVD20H 120 ngày tuổi cho thấy khối lượng cơ tăng lên khi
so sánh với đối chứng kiểu hoang dã (WT). b Nhuộm hematoxylin và eosin các khu vực
mặt cắt của cơ longissimus dorsi từ lợn WT 120 ngày tuổi và MSTN+/ PVD20H .)

32
33
34
 Đánh giá sự tăng trưởng ở cá con một tháng tuổi được nuôi dưỡng bằng myostatin
(MSTN).
Nghiên cứu của Karim Khalil và cs (2017) cho thấy kiểu đột biến nặng hơn đáng kể
so với kiểu WT. Chiều dài của thể đột biến lớn hơn đáng kể so với kiểu WT.
3. Limitations of CRISPR
Off-target effects of CRISPR/Cas
In vivo delivery of CRISPR/Cas
Immune response stimulated by CRISPR/Cas
Độc tính miễn dịch
Ngoài những hạn chế về mặt kỹ thuật, CRISPR / Cas9, giống như liệu pháp gen
truyền thống, vẫn gây ra những lo ngại về độc tính sinh miễn dịch. Charlesworth
và cộng sự cho thấy rằng hơn một nửa số đối tượng là con người trong nghiên cứu
của họ sở hữu các kháng thể kháng Cas9 đã có từ trước chống lại các chỉnh thể vi
khuẩn được sử dụng phổ biến nhất là SaCas9 và SpCas9. Hơn nữa, vectơ AAV
cũng được sử dụng rộng rãi để cung cấp các thành phần CRISPR cho liệu pháp
gen. Để đạt được mục đích này, một số trực tiếp Cas9 và các kiểu huyết thanh
AAV đã được thử nghiệm dựa trên sự tương đồng về trình tự và dự đoán độ bền
liên kết với MHC lớp I và lớp II để sàng lọc các trực giao miễn dịch có thể được
sử dụng để lặp lại an toàn liệu pháp gen AAV-CRISPR. Mặc dù không có hai kiểu
huyết thanh AAV nào được tìm thấy để phá vỡ hoàn toàn khả năng nhận dạng
miễn dịch, nhưng nghiên cứu đã xác minh 3 trực tiếp Cas9 [SpCas9, SaCas9 và
Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9)] cho thấy hiệu quả chỉnh sửa mạnh mẽ và
dung nạp lặp lại do giảm độc tính sinh miễn dịch ở chuột được miễn dịch AAV và
Cas9 ( 76). Một cảnh báo chính là khả năng miễn dịch đã có từ trước ở người
chống lại 2 trong số các ortholog này - SpCas9 và SaCas9, điều đó cho thấy
CjCas9 là lựa chọn hiện tại duy nhất cho nhóm bệnh nhân này. Tuy nhiên, bộ
chỉnh hình này chưa được nghiên cứu kỹ so với 2 bộ chỉnh hình còn lại và sẽ cần
được điều tra thêm để cung cấp bằng chứng về tính an toàn và hiệu quả của nó khi
sử dụng trong lâm sàng. Các nghiên cứu trong tương lai cũng có thể xác định các
trực giao miễn dịch Cas9 khác cho liệu pháp gen lặp lại an toàn.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7427626/
Bằng chứng ban đầu về khả năng sinh miễn dịch Cas9 ở chuột
Mặc dù có nhiều thành công trong các nghiên cứu tiền lâm sàng, các protein
nuclease SpCas9 đã được phát hiện để tạo ra cả phản ứng kháng thể và tế bào T ở
chuột có năng lực miễn dịch khi được phân phối qua adenovirus đến gan hoặc khi
biểu hiện quá mức như một gen chuyển trong cơ bằng cách sử dụng vectơ AAV
hoặc kết hợp điện. Các khối u biểu hiện quá mức của SpCas9 được cấy vào chuột

35
 có khả năng miễn dịch bị từ chối bởi phản ứng tế bào T hướng Cas9 .Quan trọng
là, một bài báo gần đây của Li et al. đã chứng minh rằng việc tiêm chủng cho
chuột với protein SaCas9 một tuần trước khi điều trị gen AAV-gan đã ngăn chặn
sự tồn tại lâu dài của các tế bào gan đã được chỉnh sửa gen in vivo . Vẫn chưa
được làm sáng tỏ liệu các chất ức chế miễn dịch cổ điển, được sử dụng trên lâm
sàng và trên các mô hình động vật lớn, có thể làm giảm các phản ứng trí nhớ tế
bào T như vậy sau khi sử dụng AAV hay không.

Nguy cơ miễn dịch đối với việc đào thải qua trung gian tế bào T anti-Cas9 của các tế bào / mô đã
chỉnh sửa gen.

Liệu pháp gen CRISPR-Cas9 in vivo yêu cầu biểu hiện Cas9. Các quá trình phân hủy protein nội bào dẫn
đến sự biểu hiện peptit của các đoạn Cas9 trên bề mặt tế bào của các tế bào đã được chỉnh sửa gen có thể
được các tế bào T phản ứng với SpCas9. Phản ứng quá mức của tế bào T (Teff) có thể ảnh hưởng đến sự
thành công của liệu pháp gen. Tuy nhiên, các nghiên cứu trong ống nghiệm chứng minh các tế bào Treg
chống SpCas9 CD4 + có thể ức chế sự tăng sinh và chức năng của các tế bào Teff chống Cas9 ở tỷ lệ Treg
trên Teff cao. Giải pháp tiềm năng: Tăng cường phản ứng của tế bào Treg chống Cas9 trước hoặc trong
quá trình điều trị gen CRISPR-Cas9 in vivo.

36
 https://www-ncbi-nlm-nih-gov.translate.goog/pmc/articles/PMC8455332/?
_x_tr_sl=en&_x_tr_tl=vi&_x_tr_hl=vi&_x_tr_pto=sc
DNA damage response activated by CRISPR/Cas
4. Risk of CRISPR

37