Machine Translated by Google

Hội thảo về Sinh học Ung thư 55 (2019) 106–119

Danh sách nội dung có sẵn tại ScienceDirect

Hội thảo về sinh học ung thư

trang chủ tạp chí: www.elsevier.com/locate/semcancer

Ôn tập

CRISPR/Cas9 cho nghiên cứu và điều trị ung thư T

Tianzuo Zhana,b,1 , Niklas Rindtorffa,c,1, Johannes Betgea,b , Matthias P. Ebertb ,
Michael Boutrosa,d,⁎

aTrung tâm Nghiên cứu Ung thư Đức (DKFZ), Bộ phận Gen tín hiệu và Chức năng, và Đại học Heidelberg, Khoa Sinh học Phân tử và Tế bào, Khoa
Y học Mannheim, Heidelberg, Đức
b
Đại học Heidelberg, Khoa Nội II, Khoa Y Mannheim, Mannheim, Đức
c
Đại học Heidelberg, Khoa Y Heidelberg, Heidelberg, Đức Hiệp hội Ung thư
Đức (DKTK), Heidelberg, Đức

THÔNG TIN BÀI VIẾT TRỪU TƯỢNG

Từ khóa: CRISPR/Cas9 đã trở thành một phương pháp mạnh mẽ để thực hiện những thay đổi đối với bộ gen của nhiều sinh vật. Lần đầu tiên được phát
CRISPR hiện ở vi khuẩn như một phần của hệ thống miễn dịch thích nghi, CRISPR/Cas9 và các phiên bản sửa đổi đã tìm thấy ứng dụng rộng rãi để
Cas9
thiết kế bộ gen và kích hoạt hoặc kìm hãm sự biểu hiện của gen. Do đó, CRISPR/Cas9 hứa hẹn sẽ đẩy nhanh nghiên cứu ung thư bằng cách cung
Kỹ thuật bộ gen
cấp một công nghệ hiệu quả để mổ xẻ các cơ chế hình thành khối u, xác định mục tiêu phát triển thuốc và có thể cả tế bào cánh tay cho các
Bệnh ung thư
liệu pháp dựa trên tế bào. Ở đây, chúng tôi xem xét các ứng dụng hiện tại của công nghệ CRISPR/Cas9 cho nghiên cứu và điều trị ung thư.
Sàng lọc thông lượng cao
Chúng tôi mô tả các biến thể Cas9 mới và cách chúng được sử dụng trong hệ gen chức năng để khám phá các lỗ hổng mới dành riêng cho bệnh
Chất hữu cơ
ung thư.
Liệu pháp miễn dịch

sát thương tổng hợp Hơn nữa, chúng tôi nhấn mạnh tác động của CRISPR/Cas9 trong việc tạo ra các mô hình ung thư dạng cơ quan và chuột.

Cuối cùng, chúng tôi cung cấp cái nhìn tổng quan về các thử nghiệm lâm sàng đầu tiên áp dụng CRISPR/Cas9 như một phương pháp điều trị

chống lại bệnh ung thư.

1. Giới thiệu chức năng của nhiều gen bị đột biến [6]. Điều này đặc biệt áp dụng cho “đuôi dài”

của những biến đổi phân tử chỉ được tìm thấy thường xuyên ở tần số thấp.

Ung thư là một trong những nguyên nhân chính gây tử vong liên quan đến bệnh

tật, với tỷ lệ mắc bệnh ngày càng tăng trên toàn thế giới [1]. Đồng thời, đã có Việc phân tích chức năng có hệ thống của gen và đột biến diễn ra chậm chạp và

nhiều tiến bộ trong việc phòng ngừa và điều trị nhiều bệnh ung thư, giúp kéo dài tốn nhiều công sức. Việc phát hiện ra các đột biến gây ra kiểu hình dựa vào đột

thời gian sống sót hoặc thậm chí chữa khỏi bệnh. Trụ cột chính của sự đổi mới trong biến ngẫu nhiên hoặc gián tiếp vào sự xáo trộn các bản phiên mã của RNAi. Sự phát

liệu pháp điều trị ung thư là sự hiểu biết được cải thiện về sinh học khối u cơ triển của các nuclease được thiết kế như nuclease ngón tay kẽm hoặc TALEN đã mở ra

bản. Kiến thức này đã dẫn đến sự phát triển của các phân tử nhỏ và kháng thể nhắm khả năng nhắm mục tiêu trực tiếp và sửa đổi trình tự bộ gen [7,8]. Gần đây, công

vào các protein quan trọng của con đường truyền tín hiệu gây ung thư. nghệ gen đã được tăng tốc đáng kể nhờ sự phát triển của công nghệ CRISPR/Cas9. Kể

Một số ví dụ nổi bật bao gồm nhắm mục tiêu BCR-ABL bằng im-atinib trong bệnh bạch từ lần đầu tiên được sử dụng làm công cụ chỉnh sửa bộ gen vào năm 2013 ở tế bào

cầu dòng tủy mãn tính [2] hoặc EGFR bằng các kháng thể cụ thể trong ung thư đại động vật có vú [9,10], hộp công cụ của CRISPR/Cas9 đã liên tục được mở rộng, cho

trực tràng [3]. Trong khi các tác nhân này đã cải thiện khả năng sống sót cho một phép không chỉ sửa đổi trình tự bộ gen của tế bào và sinh vật mà còn cho phép giới

số thực thể ung thư chọn lọc, thì đối với nhiều thực thể ung thư khác, các lựa chọn thiệu các sửa đổi biểu sinh và phiên mã.

điều trị vẫn còn hạn chế và cơ chế kháng thuốc chưa được hiểu rõ. Do đó, những nỗ

lực đồng bộ của cộng đồng khoa học đã được thực hiện để mô tả đặc điểm di truyền

của bệnh ung thư và từ đó hiểu sâu hơn về vai trò của nó trong quá trình gây ung Trong bài đánh giá này, chúng tôi mô tả cách CRISPR/Cas9 mở ra con đường mới

thư và đáp ứng điều trị [4,5]. cho nghiên cứu ung thư. Ngoài ứng dụng của nó như một phương pháp sàng lọc hiệu quả

Các dự án giải trình tự quy mô lớn đã tiết lộ những thay đổi di truyền đặc trưng trong bộ gen ung thư chức năng, chúng tôi phác thảo cách sử dụng CRISPR/Cas9 để

cho một loại ung thư nhất định hoặc phổ biến cho nhiều thực thể ung thư. Tuy nhiên, khám phá bộ gen không mã hóa của bệnh ung thư.

trong khi hầu hết các biến thể di truyền của bộ gen ung thư đã được mô tả về mặt Hơn nữa, chúng tôi mô tả các mô hình ung thư in vitro và in vivo mới có thể được

cấu trúc thì người ta biết rất ít về thiết kế bởi CRISPR/Cas9. Cuối cùng, chúng tôi xem xét lâm sàng đầu tiên

⁎ Tác giả tương ứng.

Địa chỉ email: m.boutros@dkfz.de (M. Boutros).
1
Đóng góp bình đẳng.

https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2018.04.001
Nhận ngày 3 tháng 11 năm 2017; Nhận theo mẫu sửa đổi ngày 22 tháng 3 năm 2018; Được chấp nhận
ngày 4 tháng 4 năm 2018 Có sẵn trực

tuyến ngày 16 tháng 4 năm 2018 1044-579X/ © 2018 Các tác giả. Được xuất bản bởi Elsevier Ltd. Đây là bài viết truy cập mở theo

giấy phép CC BY (http://creativecommons.org/licenses/BY/4.0/).

Machine Translated by Google

T. Zhan và cộng sự.

Hội thảo về Sinh học Ung thư 55 (2019) 106–119

các thử nghiệm áp dụng CRISPR như một liệu pháp chống lại bệnh ung thư. tạo các trang web ràng buộc bổ sung cho các miền kích hoạt (được gọi là SAM)

[33]. Hiện tại VPR, SAM và SunTag được coi là hệ thống CRISPRa hiệu quả nhất [34].

2. CRISPR/Cas9 – một công cụ đa năng cho kỹ thuật gen

Để nghiên cứu bộ gen biểu sinh, các protein tổng hợp dCas9 đã được phát triển cho

Các lặp lại palindromic ngắn xen kẽ thường xuyên (CRISPR) lần đầu tiên được tìm phép sửa đổi biểu sinh theo vùng cụ thể (Hình 1C). Các protein tổng hợp dCas9-DNMT3A

thấy ở E. coli vào năm 1987 [11] và sau đó ở nhiều loài vi khuẩn khác [12]. Trong nhiều hoặc –DNMT3A-DNMT3L có thể làm tăng chọn lọc quá trình methyl hóa DNA của các họa tiết

năm, vai trò của các trình tự lặp lại ngắn vẫn còn mù mờ, cho đến năm 2005, một số CpG ở các vùng gen mục tiêu [35–37], do đó ức chế quá trình phiên mã gen. Ngược lại,

nhóm đã mô tả những điểm tương đồng của các trình tự này với DNA của phage, đưa ra giả dCas9 kết hợp với TET1 có thể được sử dụng để làm giảm quá trình methyl hóa DNA [38]

thuyết rằng các trình tự này là một phần của hệ thống miễn dịch thích nghi ở vi khuẩn và sự hợp nhất miền dCas9-p300 hoạt động như các histone acetyl-transferase có thể lập

[13–15 ] . trình để tăng khả năng tiếp cận các vùng gen [39]. Cả hai hệ thống đều có thể được sử

Những nghiên cứu này sau đó đã được mở rộng để chứng minh bằng thực nghiệm rằng CRISPR dụng để kích hoạt phiên mã các gen mục tiêu. Trên thực tế, hệ thống dCas9-p300 đã được

và các protein liên quan đến CRISPR (Cas) của nó có liên quan đến khả năng miễn dịch chứng minh là hoạt động tốt hơn dCas9-VP64 trong việc kích hoạt biểu hiện gen, đặc biệt

thích nghi nhắm vào DNA virus ngoại lai [16]. Về mặt cơ học, hai RNA riêng biệt – nhắm là khi nhắm mục tiêu vào các vùng điều hòa xa hơn của gen [39].

mục tiêu CRISPR (crRNA) và RNA hoạt hóa chuyển hóa (tracrRNA) – kích hoạt và hướng

dẫn các protein Cas liên kết các chuỗi DNA của virus, sau đó được phân cắt [17–19] .

Một nhóm con của các hệ thống CRISPR này, hệ thống loại II, dựa vào một protein Cas Gần đây, các biến thể Cas9 đã được thiết kế để tạo ra những thay đổi bazơ

duy nhất để nhắm mục tiêu vào một chuỗi DNA xác định và do đó đặc biệt hấp dẫn khi nucleotide cụ thể. Các trình soạn thảo cơ sở này không giới thiệu DSB mà dựa vào Cas9-

được sử dụng làm công cụ chỉnh sửa bộ gen [19] . Việc kết hợp crRNA với tracrRNA thành nickase được kết hợp với các miền cytidine deaminase để tạo ra các chuyển đổi có mục

một RNA dẫn hướng duy nhất (sgRNA) giúp đơn giản hóa hệ thống hơn nữa [19]. Vào năm tiêu từ C sang T hoặc G sang A. Ví dụ, Komor et al. đã thiết kế một trình soạn thảo cơ

2013, protein Cas loại II từ Streptococcus pyogenes (SpCas9) đã được sử dụng để phân sở hiệu quả bằng cách kết hợp Cas9-nickase với APOBEC1 của chuột và một chất ức chế

tách DNA dưới sự hướng dẫn của RNA trong tế bào động vật có vú lần đầu tiên, tạo cơ sở sửa chữa cắt bỏ cơ sở [40]. Họ đã sử dụng cấu trúc có tên BE3 này để điều chỉnh đột

cho việc sử dụng CRISPR/Cas9 như một công cụ chỉnh sửa bộ gen được áp dụng rộng rãi biến điểm nóng Y163C của TP53 trong các dòng tế bào ung thư vú với hiệu quả cao và tỷ

[9,10] . Trước khi tách DNA mục tiêu, nuclease Cas9 trải qua những thay đổi về hình lệ hình thành indel rất thấp. Kuscu và cộng sự. gần đây đã chứng minh cách hệ thống

dạng khi liên kết với sgRNA và được hướng đến vị trí mục tiêu của nó [19–21]. Độ đặc BE3 có thể được điều chỉnh cho các màn hình CRISPR gộp [41]. Trong khi màn hình dựa

hiệu liên kết được xác định bởi trình tự 20 nucleotide trước mô-đun liền kề ba trên Wildtype Cas9 dựa vào sự hình thành indel để làm suy giảm chức năng của gen,

nucleotide protospacer nu-cleotide (PAM, bao gồm trình tự NGG hoặc NAG) [19,21,22]. CRISPR-STOP nhắm mục tiêu BE3 đến các họa tiết nucleotide chọn lọc trong đó nó đưa ra

Sau khi tháo DNA, liên kết với sự hình thành lai PAM và DNA-sgRNA, hai miền nuclease các codon dừng sớm. Mặc dù cách tiếp cận này bị hạn chế bởi số lượng vị trí liên kết

tạo ra sự đứt gãy chuỗi kép (DSB) trong chuỗi mục tiêu [18,21] (Hình 1A). Tế bào chủ sgRNA tiềm năng nhỏ hơn, nhưng nó cung cấp một giải pháp thay thế để tránh các thành

phản ứng với DSB bằng hai cơ chế sửa chữa khác nhau. phần khả năng tồn tại do DSB lặp đi lặp lại khi nhắm mục tiêu vào các gen được khuếch

đại. Một hệ thống chỉnh sửa cơ sở thay thế dựa trên protein AID để khử cytidine [42–

44]. Trong khi một số cấu trúc thể hiện hiệu suất chỉnh sửa bazơ tương đương với BE3

[43], thì ứng dụng chính của chúng là tạo ra một tập hợp đột biến điểm đa dạng tại các

Nối cuối không tương đồng (NHEJ) là một cơ chế sửa chữa dễ xảy ra lỗi, thường dẫn đến locus mục tiêu, bao gồm cả ba nucleotide thay thế. Do đó, các hệ thống này có thể được

việc chèn hoặc xóa (indel). Những indel này có thể gây ra đột biến dịch khung, codon sử dụng để tạo ra sự đa dạng nucleotide cục bộ đã được khai thác để khám phá các cơ

dừng sớm hoặc/và sự phân rã vô nghĩa đối với gen mục tiêu, dẫn đến mất chức năng. chế kháng mới đối với các chất ức chế phân tử nhỏ imatinib và bortezomib [43,44].

Ngược lại, sửa chữa theo hướng tương đồng (HDR) sử dụng sự kết hợp lại được hỗ trợ

của các mẫu DNA của người hiến để tái tạo lại DNA bị cắt. Cơ chế này có thể được khai

thác để tạo ra các đột biến được xác định rõ bằng cách chuyển các mẫu của nhà tài trợ

đã thay đổi vào các ô được nhắm mục tiêu (Hình 1A). Sức mạnh của hoạt động nuclease

được xác định phần lớn bởi hiệu quả liên kết của Cas9. Các sửa đổi có hệ thống của

giàn giáo sgRNA đã xác định cấu trúc giàn giáo được tối ưu hóa có liên quan đến hiệu 3. Thiết kế nguồn sgRNA và tin sinh học

quả liên kết cao hơn của Cas9 với DNA mục tiêu [23] (xem Hình 1B).

Không giống như các công nghệ trước đây, việc sử dụng CRISPR/Cas9 làm công cụ

chỉnh sửa bộ gen nhanh chóng lan rộng khắp cộng đồng khoa học. Sự phân phối kiến thức

Ngoài Cas9, các nuclease CRISPR Loại II khác sử dụng các vị trí PAM thay thế (Cpf1 này được hỗ trợ bởi sự phát triển các nguồn tài nguyên tin sinh học mở để thiết kế và

[24]) hoặc RNA mục tiêu (Cas13a/b [25,26]) đã được phát triển thành các công cụ kỹ phân tích các thí nghiệm liên quan đến CRISPR. Hiện tại, có một số công cụ trực tuyến

thuật bộ gen. chọn lọc sgRNA dựa trên tính hiệu quả và tính đặc hiệu của chúng. Các thuật toán xác

Ngoài việc sử dụng Wildtype SpCas9 để phân tách DNA, một sửa đổi SpCas9 thiếu nu- định hiệu quả nhắm mục tiêu của sgRNA được lấy từ dữ liệu sàng lọc lớn và tích hợp cả

clease (dCas9) đã được phát triển [27], có thể được hợp nhất với nhiều miền hiệu ứng thành phần nucleotide của vị trí liên kết cũng như vị trí tương đối của nó trong mô

khác nhau để điều hòa thao tác DNA cục bộ cụ thể (Hình 1C) . Sự can thiệp CRISPR hình gen [45,46] . Ngược lại, việc dự đoán tính đặc hiệu của sgRNA khó khăn hơn vì hầu

(CRISPRi) và kích hoạt (CRISPRa) khai thác các bộ điều chỉnh phiên mã hợp nhất để kìm hết các mục tiêu không tạo ra kiểu hình có thể phát hiện được và do đó cần phải được

hãm hoặc tạo ra sự phiên mã gen khi dCas9 được hướng đến vị trí bắt đầu phiên mã của xác định bằng thực nghiệm. Các phương pháp tiếp cận khác nhau đã được phát triển để

gen mục tiêu [12]. Trong hầu hết các trường hợp, hệ thống can thiệp CRISPR dựa vào sự phát hiện các mục tiêu ngoài mục tiêu, chẳng hạn như tích hợp oligo tổng hợp vào DSB

hợp nhất dCas9 với miền ức chế KRAB để điều hòa quá trình phiên mã gen [28]. Điều thú trong tế bào sống [47] hoặc phát hiện các vị trí cắt Cas9 bằng cách giải trình tự sâu

vị là, dCas9-KRAB cũng có thể sửa đổi các vùng tăng cường bằng cách thay đổi trạng DNA bộ gen được phân tách trong ống nghiệm [48,49]. Bài học quan trọng nhất rút ra từ

thái methyl hóa tại vị trí mục tiêu, từ đó ức chế quá trình phiên mã gen [29]. những thí nghiệm này là các mục tiêu ngoài mục tiêu có những điểm tương đồng về trình

tự với vị trí mục tiêu, nhưng không thể dự đoán tin sinh học chính xác của tất cả các

mục tiêu ngoài mục tiêu dựa trên dữ liệu hiện có [49] . Hơn nữa, để thiết kế các thư

Ngược lại, các hệ thống kích hoạt CRISPR đang sử dụng các chiến lược đa dạng để viện sgRNA tùy chỉnh và phân tích các màn hình CRISPR/Cas9 gộp, các giải pháp tin sinh

tăng cường biểu hiện gen. Hệ thống CRISPRa đầu tiên dựa trên một miền kích hoạt VP64 học cục bộ và dựa trên web cụ thể đã được phát triển [50,51].

duy nhất được hợp nhất với dCas9, từ đó kích hoạt phiên mã [28,30]. Hệ thống này đã

được cải tiến hơn nữa bằng cách thay đổi VP64 thành bộ kích hoạt ba bên VP64-p65-Rta

(VPR) [31] hoặc bằng cách tái sử dụng nhiều bộ kích hoạt phiên mã thành dCas9. Điều

thứ hai đạt được bằng cách thêm đuôi epitope dài vào dCas9 (được gọi là SunTag) [32] Một số công cụ được sử dụng thường xuyên có thể được tìm thấy trong Bảng 1.

hoặc bằng cách sửa đổi giàn giáo sgRNA để bao gồm các aptamer để

107
Machine Translated by Google

T. Zhan và cộng sự.

Hội thảo về Sinh học Ung thư 55 (2019) 106–119

Hình 1. Hàm CRISPR/Cas9 và các biến thể SpCas9 khác nhau. Tổng quan về hoạt động Cas9, cấu trúc và sửa đổi sgRNA. (A) Nuclease Cas9 được hướng tới

DNA mục tiêu bằng cách ghép cặp bazơ bổ sung với sgRNA liên kết của nó. Trang đích phải được theo sau bởi chuỗi 3′ PAM (NGG, NAG). Sự phân chia sau đây của

DNA sợi kép (dsDNA) kích hoạt cơ chế nối đầu không tương đồng (NHEJ) hoặc cơ chế sửa chữa theo hướng tương đồng (HDR). (B) Cấu trúc của một

sgRNA. sgRNA bao gồm đoạn kéo dài 20 nt xác định trình tự mục tiêu tương đồng và vùng xử lý lấy cảm hứng từ tracr-RNA để liên kết Cas9. Hơn nữa,

giàn giáo sgRNA đã được tối ưu hóa bằng cách bổ sung các bazơ cụ thể vào kẹp tóc. (C) Các protein tổng hợp SpCas9 được chọn lọc có tác dụng sinh học riêng biệt: phản ứng tổng hợp dCas9 với VP64

chất kích hoạt phiên mã (màu xanh lá cây) để kích hoạt quá trình phiên mã của gen mục tiêu bằng cách liên kết ngược dòng với vị trí bắt đầu phiên mã. Phản ứng tổng hợp dCas9 với chất ức chế KRAB (màu đỏ) thành

điều hòa quá trình phiên mã bằng cách liên kết với vị trí bắt đầu phiên mã. Phản ứng tổng hợp dCas9 với các chất biến đổi biểu sinh (ví dụ DNMT3A, màu tím) để sửa đổi quá trình methyl hóa cục bộ

các mẫu. Phản ứng tổng hợp dCas9 với các trình chỉnh sửa cơ sở (ví dụ AID, màu vàng) để trao đổi nucleotide đơn chính xác.

4. Phát hiện mục tiêu bằng màn hình CRISPR/Cas9 các bước thử nghiệm (xem Hình 2 để biết sơ đồ quy trình làm việc). Đầu tiên, sgRNA

được dự đoán là có hiệu quả sẽ được chọn lọc cho mọi gen mục tiêu. TRONG

Màn hình CRISPR/Cas9 là một công cụ gen chức năng mạnh mẽ để hầu hết các công cụ thiết kế sgRNA, các thuật toán dự đoán hiệu quả của sgRNA đều

khám phá các mục tiêu mới cho liệu pháp điều trị ung thư. Để sàng lọc tổng hợp với đã được tích hợp [50,51]. Thư viện sgRNA được tổng hợp thành một tập hợp

CRISPR/Cas9, một quần thể tế bào có nhiều loại gen đa dạng các oligonucleotide và được nhân bản vào khung plasmid lentivirus, tiếp theo là

cần phải được tạo ra. Quá trình này liên quan đến một số tin sinh học và tạo ra các hạt virus. Sau đó các hạt lentivirus được

Bảng 1

Phần mềm thiết kế và phân tích các thí nghiệm CRISPR.

Phần mềm thiết kế các sgRNA đơn

Phần mềm Nền tảng Tham khảo sinh vật URL

E-CRISP Dựa trên web [126] Nhiều http://www.e-crisp.org/

Công cụ thiết kế CRISPR Dựa trên web [127 ] Nhiều http://crispr.mit.edu/

CHOPCHOP v2 Dựa trên web [128] Nhiều http://chopchop.cbu.uib.no/

Bàn làm việc Protospacer Giao diện ngoại tuyến/đồ họa [129] Nhiều www.protospacer.com
Quét CRISPR Dựa trên web [130] Nhiều http://www.crisprscan.org/

Trình ghi bàn sgRNA 1.0 Dựa trên web [131] Nhân loại http://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorer

Phần mềm thiết kế thư viện sgRNA

Phần mềm Nền tảng Tài liệu tham Sinh vật URL

HƯỚNG DẪN Dựa trên web khảo Người và chuột http://guides.sanjanalab.org/#/

Nhà thiết kế thư viện CRISPR (CLD) Giao diện ngoại tuyến/đồ họa [50] [51] Nhiều https://github.com/boutroslab/cld

Phần mềm phân tích màn hình CRISPR gộp

Phần mềm Nền tảng Tham khảo Sinh URL

caRpools R/Chất dẫn sinh học [132] http://github.com/boutroslab/caRpools

MageCK-VISPR Giao diện ngoại tuyến/đồ họa [133] https://bitbucket.org/liulab/mageck-vispr/
Màn hìnhBEAM Giao diện ngoại tuyến/đồ họa [134] https://github.com/jyyu/ScreenBEAM

CRISPRanalyzeR (CAR) Giao diện dựa trên web và ngoại tuyến/đồ họa [135] vật / / / / http://www.crispr-analyzer.org

http://www.github.com/boutroslab/CRISPRAnalyzeR

108
Machine Translated by Google

T. Zhan và cộng sự.

Hội thảo về Sinh học Ung thư 55 (2019) 106–119

đề xuất [56]. Một quan sát chính từ các màn hình lựa chọn tiêu cực là một số gen

rất cần thiết trong phần lớn các dòng tế bào (được gọi là “tính thiết yếu cốt

lõi”), trong khi các gen khác chỉ cần thiết cho các dòng tế bào có nền tảng di

truyền hoặc mô cụ thể (được gọi là “phụ thuộc vào bối cảnh”). tính thiết yếu”)

(xem Hình 4). Ví dụ, để xác định các gen thiết yếu cho bệnh bạch cầu dòng tủy

cấp tính, Tzelepis et al. tập trung vào tám dòng tế bào AML và xác định 429 ứng

cử viên, trong đó KAT2A được đặc hiệu hóa như một mục tiêu cụ thể có thể uống

được và bệnh bạch cầu [57]. Do các màn hình CRISPR được công bố cho đến nay đã

tiết lộ nhiều gen thiết yếu chưa được biết đến, nên đang có những nỗ lực nghiên

cứu áp dụng phương pháp này để xác định tính thiết yếu của gen trong một nhóm

lớn hơn các dòng tế bào ung thư [56].

Dọc theo những dòng này, Rauscher et al. gần đây đã chứng minh làm thế nào dữ

liệu về tính chất thiết yếu của gen từ các màn hình CRISPR khác nhau có thể

được tích hợp để tạo ra bản đồ tương tác di truyền trong tế bào ung thư, từ đó

tiết lộ các gen thiết yếu mới phụ thuộc vào ngữ cảnh [58] .

Khái niệm về tính thiết yếu của gen cũng có thể được thu hẹp thành các vùng

gen mã hóa các miền protein thiết yếu. Ngược lại với RNAi làm cạn kiệt bản phiên

mã của gen mục tiêu, có thể phá vỡ các miền protein cụ thể bằng cách sử dụng

CRISPR/Cas9, bằng cách nhắm mục tiêu vào trình tự bộ gen tương ứng. Phương pháp

sàng lọc này – được gọi là sàng lọc miền – được sử dụng để xác định các miền

protein xác định tính thiết yếu của một gen cụ thể, điều này có thể tạo điều

kiện thuận lợi hơn nữa cho việc phát triển thuốc. Ví dụ: màn hình CRISPR nhắm

mục tiêu các exon của miền điều hòa chất nhiễm sắc đã tiết lộ một số miền mới
cần thiết cho AML [59]. Một cách tiếp cận tương tự đã xác định rằng các dòng tế

bào AML mang đột biến gen NPM1 phụ thuộc đặc biệt vào vị trí liên kết menin của

protein MLL1 [60]. Hỗ trợ quan sát này, sự ức chế dược lý của vị trí gắn kết này

có tác dụng chống bệnh bạch cầu rõ rệt. Mặc dù việc sàng lọc các gen và miền

thiết yếu đã tiết lộ nhiều gen có kiểu hình gây chết người khi bị gián đoạn,

nhưng một nhược điểm lớn là chỉ một số ít trong số các ứng cử viên này có thể bị

nhắm mục tiêu trực tiếp bởi thuốc.

Hình 2. Đường ống cho các nhóm tế bào loại trực tiếp thế hệ. Tổng quan về các
bước riêng lẻ trong thiết kế và nhân bản thư viện sgRNA cũng như tạo ra các nhóm
tế bào loại trực tiếp. Các vị trí liên kết sgRNA thích hợp cho các gen được chọn
Một cách tiếp cận sàng lọc bổ sung để xác định các mục tiêu có thể đánh
được xác định trong silico bằng các công cụ phần mềm thiết kế thư viện (A). Sau
thuốc được dựa trên khái niệm sát thương tổng hợp, đây là một dạng cụ thể của
đó, một nhóm oligo chứa các trình tự sgRNA được tạo ra bằng quá trình tổng hợp
tính thiết yếu của gen phụ thuộc vào ngữ cảnh (xem Hình 4B tựa C). Tóm lại, hiện
dựa trên chip (B) và được nhân bản thành vectơ khung lentivirus (C). Mỗi hạt
tượng chết tổng hợp xảy ra nếu một tế bào có thể bù đắp cho sự thay đổi chức
lentivirus chứa một băng biểu hiện sgRNA riêng biệt được tạo ra và sử dụng để lây
nhiễm các tế bào biểu hiện Cas9 ở mức bội nhiễm thấp (MOI) (D). Sau khi lựa chọn
năng của gen A hoặc B, nhưng không thể tồn tại nếu gen A và B bị thay đổi đồng

kháng sinh, nhóm này chứa các tế bào được loại bỏ gen riêng biệt có thể được sử thời (Hình 4B, bên phải). Chuyển sang sinh học ung thư, điều này có nghĩa là các

dụng cho nhiều phương pháp sàng lọc khác nhau. gen không thiết yếu trước đây có thể trở nên thiết yếu do mất chất ức chế khối

u cụ thể hoặc kích hoạt gen gây ung thư [61]. Với kiến thức ngày càng tăng về sự

thay đổi cấu trúc của bệnh ung thư, phương pháp này có thể mở rộng đáng kể phạm
được sử dụng để lây nhiễm các tế bào biểu hiện Cas9 với tỷ lệ lây nhiễm thấp, do
vi mục tiêu thuốc tiềm năng.
đó mọi tế bào đều có khả năng mang một băng sgRNA riêng biệt và loại bỏ gen cụ
Sự liên quan tịnh tiến của khái niệm này gần đây đã được chứng minh bằng một thử
thể. Sau đó, nhóm tế bào bị loại này được nuôi cấy trong một khoảng thời gian cố
nghiệm lâm sàng cho thấy độ nhạy cao hơn đối với ung thư vú mang đột biến dòng
định hoặc tiếp xúc với các ống pertubation chọn lọc, sau đó các tế bào được thu
mầm của BRCA đối với sự ức chế PARP [62]. Một số màn hình CRISPR/Cas9 đã được
hoạch và DNA bộ gen của chúng được chiết xuất.
thực hiện để xác định các tương tác gây chết người tổng hợp. Trong màn hình
Bằng cách khuếch đại và giải trình tự các băng sgRNA tích hợp, có thể xác định
CRISPR trên toàn bộ bộ gen, Steinhart et al. đã phát hiện ra rằng các dòng tế
được số lượng tế bào mang một loại phân tử cụ thể. Bằng cách này, có thể theo
bào pan-creatic mang đột biến ở ubiquitin-ligase RNF43 đặc biệt dễ bị tổn thương
dõi tác động kiểu hình của việc loại bỏ gen cụ thể trong quần thể tế bào. Việc
trước sự loại bỏ thụ thể phối tử Wnt FZD5 [63]. Điều thú vị là, tác dụng này chỉ
thiết lập màn hình CRISPR này có thể được sửa đổi bằng cách sử dụng các biến thể
dành riêng cho FZD5 và nhắm vào thụ thể có kháng thể làm giảm khả năng sống sót
Cas9 khác nhau để thực hiện, chẳng hạn như màn hình tăng chức năng hoặc để điều
trong các cơ quan khối u có nguồn gốc từ ung thư tuyến tụy và đại trực tràng đột
tra các tương tác thuốc-gen bằng cách thêm các phân tử nhỏ làm nhiễu loạn (Hình
biến RNF43 [63]. Trong một màn hình toàn bộ bộ gen khác được thực hiện trong một
3 ) .
bảng gồm 14 dòng tế bào AML đột biến và không đột biến RAS, một bộ gen được
Một mục tiêu chính của màn hình CRISPR/Cas9 tổng hợp trong nghiên cứu ung
phát hiện là có khả năng gây chết người tổng hợp với các đột biến RAS gây ung
thư là xác định các lỗ hổng cụ thể theo kiểu gen (Hình 3). Những gen 'thiết yếu'
thư [64]. Chọn gen PREX1 làm ví dụ, cho thấy hầu hết các ứng cử viên được xác
này có thể là mục tiêu tiềm năng của thuốc vì sự suy giảm chức năng của chúng
định đều tương tác trực tiếp với con đường RAS. Một cách tiếp cận tương tự đã
dẫn đến giảm khả năng sống sót. So với shRNA, CRISPR được chứng minh là nhạy hơn
được sử dụng để xác định các mục tiêu trong các tế bào ung thư bạch cầu chứa gen
trong việc phát hiện các gen thiết yếu [52]. Do đó, sàng lọc CRISPR/Cas9 quy mô
gây ung thư tổng hợp MLL-AF4. Bằng phương pháp sàng lọc CRISPR ở quy mô bộ gen,
lớn đã được tiến hành để khám phá một cách có hệ thống các gen thiết yếu trên
gen ENL không có đặc điểm trước đây được phát hiện là cần thiết cho sự tăng
nhiều dòng tế bào ung thư [53–55]. Trong sàng lọc CRISPR/Cas9 ở quy mô bộ gen ở
trưởng và tăng sinh ở các dòng AML dương tính MLL-AF4 [60]. ENL là một thành
mười dòng tế bào ung thư, khoảng 1500 gen quan trọng đã được xác định, cao gấp
phần của phức hợp siêu kéo dài và sự thoái biến của ENL làm giảm quá trình phiên
5 lần so với sàng lọc shRNA được phát hiện trước đó [54] . Tuy nhiên, việc cắt
mã của các gen gây ung thư như MYC [60]. Tuy nhiên, cơ chế phân tử mà ENL tương
Cas9 ở các gen có độ khuếch đại cao có thể tạo ra phản ứng phá hủy DNA gây chết
tác theo cách tổng hợp gây chết người với MLL-AF4 vẫn chưa được giải quyết. Cùng
người, do đó tạo ra các kết quả dương tính giả trong màn hình gộp [53,55]. Để
với nhau, những nghiên cứu này nhấn mạnh rằng màn hình CRISPR có thể tiết lộ vô
khắc phục hiệu ứng này, gần đây các phương pháp tính toán khác nhau đã được
số tương tác tổng hợp gây chết người. Các

109
Machine Translated by Google

T. Zhan và cộng sự.

Hội thảo về Sinh học Ung thư 55 (2019) 106–119

Hình 3. Các phương pháp sàng lọc CRISPR/Cas9 gộp.

Ba phương pháp sàng lọc khác nhau được trình bày dưới dạng
sơ đồ. Trong màn hình lựa chọn âm tính (ví dụ để xác định
các gen thiết yếu) (A), nhóm các ô bị loại được ủ trong một
khoảng thời gian xác định. Sự phong phú của các sgRNA khác

nhau trong nhóm được xác định vào thời điểm đầu (Ngày 0) và
ở cuối màn hình (Ngày X) bằng cách giải trình tự sâu. Các
tế bào mang sgRNA nhắm vào các gen thiết yếu sẽ bị cạn kiệt
trong nhóm tế bào trong quá trình ủ. Để nghiên cứu các tương
tác gen-thuốc (B), nhóm tế bào loại được tách ra và xử lý
bằng hợp chất hoặc dung dịch mang (đối chứng) trong một
khoảng thời gian xác định. Sự phong phú của các tế bào với
các băng sgRNA khác nhau được xác định trong nhóm kiểm soát

và điều trị bằng thuốc. Các tế bào có sgRNA nhắm mục tiêu
vào các gen có khả năng kháng thuốc khi bị loại sẽ được làm
giàu trong khi những tế bào dẫn đến tăng độ nhạy cảm với
thuốc sẽ bị cạn kiệt trong nhóm cuối cùng. Để sàng lọc những

thay đổi về phiên mã tế bào đơn lẻ do loại bỏ gen (C), một

mã vạch có biểu hiện cao bổ sung được mã hóa trên vectơ
lentivirus (được mô tả dưới dạng biểu tượng nhỏ). Sau khi
phân loại các ô đơn lẻ khỏi nhóm các ô bị loại, mRNA của
các ô riêng lẻ bao gồm cả mã vạch được các hạt ghi lại và

sau đó được giải trình tự. Sau đó, các bản phiên mã của tế
bào được gán cho các sgRNA tương ứng bằng cách sử dụng mã
vạch.

Hình 4. Các khái niệm về tính tất yếu. Tổng quan về các cơ chế thiết yếu khác nhau trong bệnh ung thư. (A) Tính thiết yếu cốt lõi mô tả sự phụ thuộc tuyệt đối của tế bào hoặc sinh
vật vào một gen cụ thể, bất kể nền tảng di truyền của chúng. Nền tảng di truyền được mô tả dưới dạng sơ đồ trong sơ đồ ở phía bên phải bên cạnh mỗi hình ảnh tế bào. Sự xáo trộn của
gen thiết yếu cốt lõi X (ví dụ POLR2A) dẫn đến chết tế bào ở tất cả các loại tế bào quan sát được. Hầu hết các gen thiết yếu cốt lõi đều được liên kết với các chức năng cơ bản của
tế bào như tổng hợp protein hoặc phân chia tế bào. (B) Tính thiết yếu phụ thuộc vào bối cảnh mô tả sự phụ thuộc tương đối của tế bào hoặc sinh vật vào một gen cụ thể khi có sự thay
đổi di truyền thứ hai. Trong bệnh ung thư, sự thay đổi thứ hai này thường là một gen gây ung thư hoạt động hoặc mất đi chất ức chế khối u. Trong trường hợp nghiện gen gây ung thư,
các tế bào có gen gây ung thư D bị biến đổi (ví dụ KRAS G12V) sẽ chết tế bào nếu D bị xáo trộn, trong khi các tế bào không có sự thay đổi này có thể bù đắp cho việc mất D.
Khả năng gây chết tổng hợp là một trường hợp khác về tính thiết yếu phụ thuộc vào bối cảnh. Trong khi các tế bào có sự biến đổi của gen A (ví dụ BRCA1/2) có lợi thế tăng trưởng,
chúng lại phụ thuộc rất nhiều vào chức năng của gen B (ví dụ PARP1/2). Do đó, nếu gen B bị xáo trộn, các tế bào có gen A bị thay đổi sẽ chết, trong khi tế bào có gen A hoang dã sẽ
có thể bù đắp sự mất mát của gen B.

thách thức trong tương lai sẽ là giải quyết các cơ chế cơ chế phân tử cơ bản
và xác định các tương tác gây chết tổng hợp (có thể sử dụng được) có thể được
chuyển thành các liệu pháp.
Một ứng dụng chính khác của sàng lọc CRISPR/Cas9 là phân tích các tương
tác hóa học-di truyền, cho phép hiểu rõ hơn về cách ung thư phản ứng với điều
trị bằng thuốc. Việc kết hợp sàng lọc CRISPR gộp với một loại thuốc dưới dạng
nhiễu loạn có thể xác định các loại gen có tác dụng hiệp đồng hoặc tạo ra khả
năng kháng tác nhân (Hình 3B).
Tại một trong những màn hình CRISPR tổng hợp đầu tiên, việc xử lý quy mô bộ gen
thư viện loại bỏ các tế bào khối u ác tính bằng chất ức chế BRAF vemur-afinib
đã phục hồi các gen được biết là có khả năng kháng thuốc [65]. Tương tự như
vậy, màn hình CRISPR gộp có thể xác định một cách đáng tin cậy cả bộ điều
chỉnh tích cực và tiêu cực của con đường TRAIL, khi các tế bào ung thư được
điều trị bằng phối tử TRAIL [51]. Sau đó, một loạt màn hình CRISPR đã được
thực hiện để xác định gen điều chỉnh phản ứng của tế bào với các loại thuốc cụ
thể, chẳng hạn như ATR [66] hoặc chất ức chế con đường Ras [67]. Chiến lược
này cũng được sử dụng để khám phá phương thức tác dụng của các loại thuốc
chống ung thư có đặc tính kém. Ví dụ, apilimod được biết đến

110
Machine Translated by Google

T. Zhan và cộng sự.

Hội thảo về Sinh học Ung thư 55 (2019) 106–119

chất ức chế phosphatidylinositol-3-phosphate 5-kinase, nhưng cơ chế tác dụng gây độc Một nghiên cứu khác sử dụng CRISPR để xác định các chất tăng cường chức năng của TP53

tế bào của nó vẫn chưa được hiểu rõ. CRISPR gen mục tiêu [77]. Với mục đích này, các thư viện sgRNA chống lại bộ gen

màn hình cho thấy các gen liên quan đến nội bào/lysosomal các vùng hiển thị cả thuộc tính liên kết TP53 và điểm đánh dấu chất tăng cường

con đường này tạo ra sự đề kháng khi bị loại trừ, cho thấy độc tính tế bào của apilimod Đã được thiết kế. Việc loại bỏ phần tử tăng cường có liên quan sẽ dẫn đến

chủ yếu phụ thuộc vào sự cân bằng nội môi/lysosomal tại nhà [68]. Gần đây, các phương khả năng đề kháng của tế bào chống lại sự lão hóa do HRASG12V gây ra, phụ thuộc vào

pháp sàng lọc CRISPR tổ hợp TP53. Các tác giả đã xác định một số chất tăng cường gần với CDKN1A mà sau khi chỉnh

đã được phát triển sử dụng các plasmid lentivirus mã hóa hai sgRNA được xác định trước. sửa đã dẫn đến việc điều chỉnh giảm

Cách tiếp cận này không chỉ cho phép mổ xẻ di truyền CDKN1A và thoát khỏi sự lão hóa do gen gây ung thư. Một lớp khác

sự tương tác của việc loại bỏ gen theo cặp mà còn cho phép xác định trong số các yếu tố di truyền chưa được hiểu rõ là các RNA không mã hóa. Để phân tích

của các mục tiêu thuốc hiệp đồng. Han và cộng sự. tạo ra một sgRNA kép lớn một cách có hệ thống vai trò của lncRNA trong tế bào ung thư, ba sàng lọc

thư viện nhắm mục tiêu 21.321 cặp mục tiêu thuốc tiềm năng để kiểm tra sự kết hợp tác các phương pháp tiếp cận sử dụng các biến thể Cas9 khác nhau đã được áp dụng. Zhu và cộng sự. đã sử dụng

dụng hiệp đồng trong dòng tế bào AML [69]. Họ đã xác định được một thế mạnh các sgRNA được ghép nối để xóa trình tự bộ gen của 651 lncRNA và

sự phối hợp giữa việc loại bỏ MCL1 và BCL2L1 có thể do đó đã xác định được 51 lncRNA cho thấy kiểu hình tăng sinh bị thay đổi khi bị loại

được sao chép bằng cách sử dụng các chất ức chế hóa học của hai gen. Tương tự, Thần bỏ [78]. Ngược lại, CRISPRi được Liu và cộng sự sử dụng.

et al. đã sử dụng phương pháp sàng lọc loại trực tiếp kép để nhắm mục tiêu theo cặp để sàng lọc 16401 locus lncRNA trong sáu dòng tế bào để tìm ảnh hưởng đến khả năng sống của tế bào

73 gen ung thư và phát hiện ra một số gen đã biết (ví dụ BRCA-PARP) [79]. Tổng cộng có 499 lncRNA được phát hiện là cần thiết cho hoạt động của tế bào.

và các tương tác gây chết người tổng hợp chưa được biết đến, một số trong đó có thể sự phát triển. Điều thú vị là phần lớn các lncRNA này

hiện tượng sử dụng kết hợp thuốc [70]. Vì tình trạng kháng thuốc có thể được yêu cầu theo cách thức cụ thể của dòng tế bào, hỗ trợ các quan sát trước đó cho

cũng là kết quả của sự biểu hiện quá mức của gen, Konermann et al. đã sử dụng thấy biểu hiện của lncRNA rất khác nhau giữa các bệnh ung thư

CRISPRa để thực hiện thí điểm sàng lọc kích hoạt quy mô bộ gen để xác định từ các nền mô khác nhau [80]. Theo cách tiếp cận tương tự, CRISPRa

các gen có khả năng kháng lại sự ức chế BRAF [33]. Trong số hàng đầu đã được sử dụng để xác định các lncRNA làm trung gian cho khả năng kháng lại sự ức chế BRAF

lượt truy cập đã được nhiều cơ quan quản lý con đường Ras, bao gồm cả EGFR với tư cách là khi kích hoạt phiên mã [81]. Một số locus ứng cử viên đã được tìm thấy,

gen kháng thuốc đã biết. Dự kiến màn hình CRISPR sẽ được sử dụng nhưng kiểu hình chủ yếu là do sự kích hoạt của các gen mã hóa protein lân cận. Kết quả

để phân tích các tương tác hóa học-di truyền của nhiều loại thuốc hơn, cho phép này phản ánh một trong những nhược điểm chính của việc sử dụng CRISPRi/a để nhắm mục

hiểu sự đóng góp của mô và nền tảng di truyền cho thuốc tiêu lncRNA. Vì nhiều lncRNA có

phản ứng. các trình tự khởi đầu hai chiều hoặc nằm trong các gen mã hóa protein, nó là

Trong khi hầu hết các kỹ thuật sàng lọc CRISPR gộp đều được thiết kế để hiếm khi có thể nhắm mục tiêu lncRNA mà không ảnh hưởng đến các gen mã hóa protein lân

xác định các gen biểu hiện một kiểu hình cụ thể khi cạn kiệt, mới lạ cận [82]. Vì vậy, vẫn chưa xác định được

Các phương pháp sàng lọc nhằm mục đích đạt được cái nhìn sâu sắc toàn cầu hơn về những công nghệ CRISPR/Cas9 nào phù hợp nhất để điều tra lncRNA

thay đổi sinh học liên quan đến sự nhiễu loạn gen cụ thể. Như gần đây chức năng.

được mô tả, kết hợp các nền tảng giải trình tự RNA tế bào đơn với

Sàng lọc CRISPR làm tăng khả năng giải thích của CRISPR 6. Chỉnh sửa bộ gen để tạo ra các mô hình ung thư dạng cơ quan

xét nghiệm [71–73] (Hình 3C). Nói tóm lại, một nhóm tế bào mang các

loại bỏ được tạo ra, sau đó là thu giữ tế bào đơn lẻ và giải trình tự RNA của các bản Các chất hữu cơ có nguồn gốc từ tế bào gốc trưởng thành ngày càng phổ biến ở

phiên mã riêng lẻ của mỗi tế bào. Để liên kết mô hình ống nghiệm của biểu mô người còn nguyên vẹn và bị bệnh [83]. Tế bào gốc từ

bản phiên mã của một tế bào để nhận dạng sgRNA được tải nạp bằng nhiều loại mô trưởng thành có thể được phân lập và nuôi cấy ở dạng 3D. Qua

độ tin cậy cao, mã vạch hướng dẫn được thể hiện cao bổ sung hoặc kích thích bằng các yếu tố tăng trưởng đặc hiệu của mô, tế bào gốc sinh sôi nảy nở,

điểm đánh dấu [74] được tích hợp vào vectơ lentivirus. Những xét nghiệm này biệt hóa và hình thành các chất hữu cơ trong đĩa nuôi cấy tế bào. Khả năng để

được gọi là Perturb- hoặc CROP-Seq, cho phép so sánh các bản phiên mã của các tế bào nuôi cấy cả mô khỏe mạnh và mô ung thư cho phép nghiên cứu khối u

với các loại gen khác nhau và từ đó nhóm lại phát triển và tiến triển trong ống nghiệm.

và gán gen cho các quá trình sinh học cụ thể. Sử dụng những phương pháp này, Schwank và cộng sự. là những người đầu tiên sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 trong

các cơ quan điều chỉnh mới [71] về sự biệt hóa tế bào miễn dịch và các nhánh kép chưa các chất hữu cơ có nguồn gốc từ chuột [84]. Hai năm sau, hai nhóm

biết [73] của phản ứng protein chưa được mở ra trong kiểu hình đồng thời được báo cáo là đã biến đổi ruột người khỏe mạnh

quần thể tế bào đồng nhất đã được xác định. các chất hữu cơ thành các đối tác ung thư của chúng bằng cách tóm tắt lại chuỗi ung

thư biểu mô tuyến của ung thư ruột kết bằng CRISPR/Cas9 [85,86].

5. Thẩm vấn bộ gen không mã hóa của bệnh ung thư Phá vỡ các thuốc ức chế khối u như APC, TP53 và SMAD4

khi việc chỉnh sửa di truyền các gen gây ung thư như KRAS và PI3K dẫn đến các dạng cơ quan

Phần lớn bộ gen của con người bao gồm các phi protein mô hình ung thư ruột kết trong ống nghiệm (Hình 5). Điều đáng chú ý là những tế bào này đã

vùng mã hóa chứa nhiều yếu tố điều hòa như chất tăng cường hoặc RNA không mã hóa. Cho phát triển độc lập với bất kỳ yếu tố tăng trưởng nào thường cần thiết cho

đến nay, hầu hết các bộ gen không mã hóa nuôi cấy các chất hữu cơ chưa được biến đổi, từ đó cho phép lựa chọn các chất hữu cơ

chưa được đặc trưng về mặt chức năng, chủ yếu là do thiếu các công cụ thử nghiệm phù biến đổi gen phụ thuộc vào kiểu hình. Gần đây, Drost

hợp. Trong bệnh ung thư, biểu hiện không mã hóa et al. [87] cũng đã mô hình hóa bệnh ung thư đại trực tràng thiếu sửa chữa không phù hợp bằng cách

RNA được biết là bị rối loạn điều hòa [75] và sự phiên mã của gen gây ung thư có thể xóa các gen sửa chữa DNA trong các cơ quan đại tràng. Điều này cho phép phát hiện các

được kiểm soát bởi các yếu tố tăng cường gần và xa [74]. dấu hiệu đột biến cũng được quan sát thấy ở các nhóm bệnh nhân có khiếm khuyết tương

Vì vậy, sự hiểu biết toàn diện về các yếu tố không mã hóa tự. Bằng cách hợp nhất văn hóa có thể mở rộng và gần như nguyên vẹn

sẽ cung cấp những hiểu biết sâu sắc hơn về sinh học ung thư. Gần đây, CRISPR/ sinh lý học, các chất hữu cơ có thể được sử dụng để xác nhận những phát hiện từ các

Cas9 đã được chứng minh là một công cụ mạnh mẽ để thẩm vấn các phần tử không mã hóa. hệ thống mô hình trong môi trường ex vivo [88]. Hơn nữa, những hiểu biết mới có thể được

Để xác định các vùng tăng cường của ba gen liên quan đến ung thư CUL3, NF1 và NF2, thu được bằng cách sử dụng vật liệu có nguồn gốc từ bệnh nhân cho các xét nghiệm chức năng như

sàng lọc CRISPR đã được thực hiện màn hình ghép hoặc CRISPR, được xem xét thêm trong Driehuis et al. [89].

nhắm mục tiêu các vùng gen 700 kb xung quanh phần đọc mở

khung của các ứng cử viên [76]. Kể từ khi loại trực tiếp một trong hai ứng cử viên 7. Các phương pháp phân phối CRISPR/Cas9 in vivo

dẫn đến sự đề kháng với chất ức chế BRAF vemurafinib, làm gián đoạn

của bất kỳ yếu tố tăng cường nào dẫn đến sự điều hòa của gen Để áp dụng CRISPR/Cas9 in vivo, việc phân phối hiệu quả cả Cas9 và

sẽ hiện tượng kháng thuốc. Trên thực tế, những thay đổi cụ thể sgRNA đến ô đích là bắt buộc. Tốt nhất, phương pháp này nên

vị trí bộ gen ở phía dưới và phía trên của gen CUL3 đã thay đổi sự chiếm giữ của các mang lại hiệu quả chỉnh sửa cao, gây ra khả năng miễn dịch thấp và cho phép

yếu tố phiên mã cụ thể và làm giảm biểu hiện CUL3. Cas9/sgRNA sẽ được chuyển đến cơ quan hoặc loại tế bào được lựa chọn. Các

111
Machine Translated by Google

T. Zhan và cộng sự.

Hội thảo về Sinh học Ung thư 55 (2019) 106–119

Hình 5. Mô hình hóa trình tự u tuyến-ung thư biểu mô ở các cơ quan ruột của chuột. Sự nhiễu loạn di truyền của các chất hữu cơ trong đại tràng trong ống nghiệm ảnh hưởng đến cả
kiểu hình (A) và các yêu cầu thích hợp (B) của các chất hữu cơ. (A) Việc mất dần các chất ức chế khối u và kích hoạt các gen gây ung thư dẫn đến các cơ quan có khả năng tăng sinh
cao với khả năng hình thành khuẩn lạc được tăng cường. (B) Tín hiệu Wnt bị kích hoạt quá mức do mất APC dẫn đến sự độc lập khỏi các yếu tố tăng trưởng kích hoạt Wnt (Wnt3A và R-
Spondin1) trong môi trường. Nguyên tắc tương tự cũng áp dụng cho đột biến KRAS tuần tự, làm cho các chất hữu cơ ít phụ thuộc hơn vào EGF (Rindtorff và cộng sự, chưa được công bố).

phương pháp chỉnh sửa bộ gen đầu tiên trong tế bào động vật có vú dựa vào
sự biểu hiện dựa trên plasmid của Cas9 và sgRNA [9,10]. Trong các sinh
vật mô hình như chuột, phương pháp này cũng phù hợp cho các ứng dụng in
vivo vì plasmid có thể được chuyển đến mô bằng phương pháp tiêm thủy động
lực học [ 90] hoặc điện di [91,92]. Tuy nhiên, hiệu quả chỉnh sửa thấp và
hoạt động Cas9 có thể được kiểm soát kém. Để cải thiện khả năng phân phối
Cas9/sgRNA in vivo, các phương pháp virut và phi virut khác nhau đã được
phát triển.
Virus liên quan đến Adeno (AAV) được coi là một công cụ mạnh mẽ vì
chúng không tích hợp, có hiệu suất tải nạp cao và tương thích về mặt huyết
thanh học với phần lớn dân số loài người [93] . Hơn nữa, họ AAV được đặc
trưng bởi sự đa dạng phong phú của các kiểu huyết thanh với các khuynh
hướng mô riêng biệt, cho phép nhắm mục tiêu có chọn lọc vào các cơ quan
khác nhau [94]. Tuy nhiên, do kích thước hàng hóa của AAV bị hạn chế nên
spCas9 và sgRNA cần được mã hóa trên các vectơ riêng biệt [95]. Để chỉnh
sửa bộ gen, AAV có thể được áp dụng trực tiếp vào cơ quan đích hoặc được
quản lý một cách có hệ thống. Wu và cộng sự. cho thấy rằng việc tiêm AAV
dưới võng mạc có thể chỉnh sửa gen NRL một cách hiệu quả trong các tế bào
cảm quang võng mạc sau khi phân bào [96]. Tương tự như vậy, việc tiêm trực
tiếp AAV vào thể vân của chuột có thể biến đổi cục bộ gen Huntingtin [97].
Đối với các ứng dụng AAV mang tính hệ thống, tính chọn lọc mô của quá
trình chỉnh sửa bộ gen đạt được bằng cách sử dụng các kiểu huyết thanh AAV
thích hợp và các chất kích thích đặc hiệu mô cho Cas9. Cách tiếp cận này đã được sử dụng thành công
để chỉnh sửa gen ornithine transcarbamylase ở gan chuột [98] và gen
dystrophin trong mô cơ [99,100]. Sau khi ứng dụng hệ thống, tần số chỉnh
sửa dao động từ 10% [98] đến 70% [99], đủ để đo lường sự cải thiện về kiểu
hình trong mô hình chuột mắc các bệnh di truyền [98,99]. Mặc dù cả biểu
hiện Cas9 và AAV đều gây ra phản ứng miễn dịch dịch thể, nhưng không thấy
tổn thương tế bào trên diện rộng [101]. Một cách tiếp cận khác để phân
phối virus là ứng dụng các hạt nano lipid. Ưu điểm chính của hạt nano là
chúng có thể được sản xuất ở quy mô công nghiệp và cho phép sử dụng liều
lượng tương tự như các loại thuốc thông thường [102].
Các hạt nano lipid đã được sử dụng để cung cấp thành công siRNA [102] hoặc
mRNA [103] trong các thử nghiệm lâm sàng. Gần đây, một loạt nghiên cứu đã
chỉ ra rằng Cas9 mRNA và sgRNA có thể được nạp vào các hạt nano lipid và
đưa đến gan chuột với hiệu quả cao [104–106]. Hơn nữa, các hạt nano biến
đổi có thể được nạp thêm một mẫu cho và do đó cũng cho phép sửa chữa theo
hướng tương đồng [107]. Sự điều chỉnh gen dystrophin đã được quan sát thấy
sau khi tiêm bắp các hạt nano mang mẫu của người cho, nhưng hiệu quả chỉnh
sửa thấp (5,3%) [107]. Do những nỗ lực lớn hiện đang được thực hiện nhằm
thiết lập và cải tiến CRISRP/Cas9 như một công cụ sửa chữa gen nên dự kiến
kiến thức này cũng sẽ được sử dụng để phát triển CRISPR/Cas9 thành một tác
nhân trị liệu chống lại bệnh ung thư. Sự thành công của phương pháp này
sẽ phụ thuộc rất nhiều vào những tiến bộ trong mô

112
Machine Translated by Google

T. Zhan và cộng sự.

Hội thảo về Sinh học Ung thư 55 (2019) 106–119

Hình 6. Các màn hình CRISPR/Cas9 gộp lại trên chuột.

Khái niệm này được minh họa bằng một nghiên cứu
được thực hiện bởi Chen et al. [109]. Các tế bào
ung thư biểu hiện Cas9 không di căn đã bị nhiễm thư
viện sgRNA (toàn bộ gen) ex vivo (A), trước khi
nhóm tế bào đột biến được cấy dưới da vào chuột suy
giảm miễn dịch (B).
Bằng cách phân tích phân tử các chuỗi sgRNA được
làm giàu trong các khối u và di căn tiến triển, các

gen liên quan đến sự tiến triển của khối u và quá

trình di căn đã được xác định (C). Nguyên tắc này
đã được áp dụng cho một số loại ung thư khác để xác

định các gen liên quan đến sự phát triển và di căn

của khối u.

phân phối Cas9/sgRNA cụ thể và dựa trên kinh nghiệm thu được từ các thử nghiệm mã hóa các plasmid vào tuyến tụy của chuột có KRAS gây ung thư gây ra sự hình

hiện tại và tương lai với liệu pháp điều trị bằng RNA [108]. thành các khối u tuyến tụy [91]. Một cách tiếp cận khác được áp dụng trong điện

di vào tử cung của não trước đang phát triển với nhiều sgRNA nhắm vào các chất

8. Chỉnh sửa bộ gen in vivo và sàng lọc di truyền ở chuột ức chế khối u quan trọng, dẫn đến chuột phát triển u thần kinh đệm trong vòng

chưa đầy sáu tháng [92]. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng sự chuyển đoạn nhiễm sắc thể

Sàng lọc CRISPR in vivo khác với các xét nghiệm sàng lọc dựa trên in vitro không mong muốn có thể là hậu quả của việc nhắm mục tiêu sgRNA đa kênh [91].

về sự cạnh tranh tăng trưởng mạnh mẽ hơn giữa các tế bào được cấy ghép và các Việc giới thiệu sgRNA bởi virus liên quan đến adeno (AAV) đưa ra một giải pháp

yếu tố ảnh hưởng bổ sung của môi trường vi mô như hệ thống miễn dịch của vật thay thế cho các phương pháp tiếp cận dựa trên sự truyền máu. Trong một bằng

chủ. Hai khái niệm cơ bản về sàng lọc in vivo tồn tại: cấy ghép các tế bào ung chứng nghiên cứu nguyên tắc, Platt et al. đã chuyển giao mã hóa AAV cho ba sgRNA

thư đã được chỉnh sửa ex vivo và cung cấp các thành phần CRISPR/Cas9 in vivo vào nhắm mục tiêu LKB1, TP53 và KRAS kết hợp với mẫu cho KRAS gây ung thư vào phổi

mô chuột, từ đó tạo ra các khối u. của chuột biểu hiện Cas9 [113]. Kết quả là có thể quan sát được sự hình thành

Việc cấy ghép các tế bào đã chỉnh sửa CRISPR ex vivo cho phép sàng lọc sgRNA ung thư phổi ở cấp độ vĩ mô. Trong một nghiên cứu khác, Chow et al. đã tiêm thư

với thông lượng cao. Ví dụ, Chen và cộng sự. đã thực hiện sàng lọc mất chức năng viện CRISPR qua trung gian AAV được sử dụng vào não của những con chuột biểu

CRISPR trên toàn bộ bộ gen trong các tế bào ung thư phổi ở chuột để xác định các hiện Cas9 có điều kiện và giải trình tự các locus di truyền mục tiêu sau khi

gen thúc đẩy sự tiến triển và di căn [109]. Họ đã tải nạp một dòng ung thư phổi phát triển khối u có thể nhìn thấy được [114]. Các gen nhắm mục tiêu sgRNA thường

không di căn bằng thư viện sgRNA và cấy các tế bào này dưới da vào chuột. Các tế xuyên bị đột biến trong u nguyên bào thần kinh đệm ở người cũng được phát hiện

bào được cấy ghép đã hình thành các khối u cục bộ và di căn phổi. Các tế bào này là có nhiều trong các tổn thương được chiết xuất. Hơn nữa, các sgRNA cùng xuất

được chiết xuất và phân tích để làm giàu các sgRNA cụ thể, từ đó xác định các hiện đã được xác định cho thấy một tập hợp các đột biến hiệp đồng trong u nguyên

yếu tố thúc đẩy sự phát triển và di căn của khối u (Hình 6). Một sàng lọc mất bào thần kinh đệm. Tóm lại, việc phân phối sgRNA và Cas9 in vivo và ex vivo cho

chức năng khác được thực hiện với các tế bào tiền thân gan ở chuột thiếu TP53 màn hình mất chức năng đều có thể được thực hiện và tiếp tục mang lại những hiểu

và biểu hiện quá mức MYC [110]. Những tế bào này cũng được cấy ghép dưới da sau biết mới về chức năng của các gen liên quan đến ung thư.

khi tải nạp bằng thư viện sgRNA ở quy mô bộ gen. Phân tích các khối u được cấy

ghép gợi ý các gen ức chế khối u quan trọng mới trong ung thư biểu mô tế bào gan

Bên cạnh các dòng tế bào bám dính, một nghiên cứu gần đây của Roper et al. đã 9. Ứng dụng lâm sàng đầu tiên của CRISPR

chứng minh tính khả thi của việc cấy ghép chỉnh hình các cơ quan đại tràng đã

được chỉnh sửa CRISPR [111]. Các cơ quan đột biến APC được cấy ghép một cách Khả năng chỉnh sửa gen, không chỉ trong các mô hình nuôi cấy tế bào và sinh

hiệu quả vào đại tràng trong vòng vài tuần. Hơn nữa, các cơ quan khối u có nguồn vật mẫu, mà còn ở con người, đã được thảo luận từ lâu trước khi các công nghệ

gốc từ bệnh nhân đã tái hấp thu mô và di căn khi cấy ghép chỉnh hình. Do đó, chỉnh sửa gen được phát triển. Liệu pháp gen soma theo truyền thống có nghĩa là

việc kết hợp sàng lọc dựa trên CRISPR trong các cơ quan với cấy ghép chỉnh hình đưa vật liệu di truyền mới vào tế bào soma (bất kỳ tế bào nào khác ngoài giao tử

có thể là một cách tiếp cận phù hợp để xác nhận các trình điều khiển khối u giả hoặc tế bào mầm) để biểu hiện các sản phẩm gen trị liệu nhằm điều trị bệnh. Các

định trong các giai đoạn tiến triển bệnh khác nhau. thử nghiệm liệu pháp gen đã được thực hiện từ những năm 1980 và phần lớn không

thành công trong nhiều năm do các vấn đề về làm im lặng các sản phẩm gen, phản

ứng miễn dịch của vật chủ, vectơ virus và đột biến gen [115]. Mặc dù hầu hết các

Chỉnh sửa bộ gen in vivo trực tiếp là một cách tiếp cận mạnh mẽ để nghiên vấn đề này vẫn chưa được giải quyết cơ bản nhưng các kết quả đầy hứa hẹn của

cứu ảnh hưởng của sự thay đổi di truyền đến quá trình gây ung thư trong môi liệu pháp gen soma đã được công bố gần đây [116–119]. Các công nghệ chỉnh sửa

trường vi mô mô bản địa. Bằng chứng đầu tiên cho thấy chỉnh sửa gen in vivo có gen mới có thể khắc phục một số vấn đề hiện tại và cho phép sửa đổi vĩnh viễn

thể dẫn đến hình thành khối u được cung cấp bởi Xue et al. [90]. Trong nghiên các tế bào soma. Giống như trong các nghiên cứu trên động vật, cả hai phương

cứu này, Cas9 và sgRNA mã hóa plasmid chống lại PTEN và TP53 đã được chuyển vào pháp in vivo và ex vivo đều được nghiên cứu.

tế bào gan chuột bằng cách tiêm tĩnh mạch đuôi thủy động lực, dẫn đến hình thành

ung thư gan. Sau đó, phương pháp tương tự đã được sử dụng để cung cấp các plasmid

mã hóa Cas9/sgRNA nhắm vào một bộ mười gen, dẫn đến sự phát triển của ung thư Thử nghiệm lâm sàng đầu tiên cho thấy tính khả thi của việc chỉnh sửa gen

biểu mô tế bào gan và tế bào đường mật trong mô hình chuột có nền KRAS gây ung trong bối cảnh lâm sàng đã được công bố năm 2014 và không sử dụng CRISPR/Cas9 mà

thư [112] . Tương tự, điện di đa kênh của sgRNA- sử dụng nuclease ngón tay kẽm (ZFN) [120]. Trong thử nghiệm này, CCR5 đồng thụ

thể HIV chính được ZFN nhắm tới trong tế bào T tự thân ex vivo để cảm ứng

113
Machine Translated by Google
T. Zhan và cộng sự.
khả năng chống nhiễm virus. Nghiên cứu cho thấy khả năng dung nạp tốt khi
truyền tế bào T đã biến đổi CCR5 và quả thực, các tế bào loại bỏ CCR5 giảm ít
hơn đáng kể khi có virus trong máu so với các tế bào đối chứng không biến
đổi. Mặc dù phương pháp điều trị này không có tác dụng điều trị lâu dài [121]
nhưng thử nghiệm này đã mở đường cho các thử nghiệm chỉnh sửa gen ex vivo
khác.
Thử nghiệm lâm sàng đầu tiên sử dụng CRISPR để điều trị ung thư đã ghi
danh bệnh nhân đầu tiên tại Bệnh viện Tây Trung Quốc của Đại học Tứ Xuyên ở
Thành Đô vào năm 2016 [122]. Trong nghiên cứu giai đoạn I không ngẫu nhiên,
nhãn mở này (NCT02793856), tính an toàn của tế bào T chết tế bào được lập
trình protein-1 (PD-1) được xử lý ex vivo được đánh giá trong điều trị ung
thư phổi không phải tế bào nhỏ di căn đã tiến triển sau tất cả các phương
pháp điều trị tiêu chuẩn. Bộ điều chỉnh điểm kiểm soát miễn dịch PD-1 là một
thụ thể tế bào T chịu trách nhiệm ức chế hoạt hóa tế bào T, từ đó điều chỉnh
khả năng miễn dịch và giảm các phản ứng tự miễn dịch, nhưng cũng cho phép hệ
miễn dịch thoát khỏi bệnh ung thư [123] . Các kháng thể trung hòa PD-1 hoặc
phối tử PD-L1 của nó được sử dụng thành công để điều trị ung thư phổi, cùng
nhiều loại khác [124]. Các bệnh nhân tham gia thử nghiệm chỉnh sửa gen đang
cung cấp tế bào lympho máu ngoại vi và việc loại bỏ tế bào T PD-1 bằng CRISPR/
Cas9 được thực hiện ex vivo. Các tế bào lympho đã chỉnh sửa được chọn lọc,
nhân rộng và sau đó được truyền trở lại bệnh nhân (Hình 7). Bốn thử nghiệm
khác áp dụng cùng khái niệm loại bỏ PD-1 để điều trị các loại ung thư khác,
bao gồm ung thư tuyến tiền liệt, bàng quang, thực quản và tế bào thận đã được
đăng ký (xem Bảng 2 ) .
Mặc dù khái niệm này đầy hứa hẹn, vẫn có những nghi ngờ rằng các tế bào
T được xử lý bằng công nghệ loại bỏ PD-1 sẽ được ưa chuộng hơn các kháng thể
PD-1 hoặc PD-L1 trong môi trường lâm sàng, vì quá trình biến đổi gen, nhân
giống và truyền tế bào T tốn nhiều công sức [122]. Do đó, những thử nghiệm
này có thể được coi là nghiên cứu chứng minh khái niệm đầu tiên về việc áp
dụng phương pháp loại bỏ CRISPR/Cas9 ex vivo trong điều trị ung thư, trong
khi các mục tiêu khác để loại bỏ hoặc kết hợp với loại bỏ PD-1 có thể hứa hẹn
hơn cho các ứng dụng lâm sàng trong tương lai. Một ví dụ là một thử nghiệm
giai đoạn I/II đã được đăng ký khác (NCT03044743) bổ sung khả năng loại bỏ
PD-1 vào tế bào T tự thân đặc hiệu của virus Eppstein-Barr (EBV) để điều trị
ung thư dương tính với EBV. Một phương pháp ex vivo khác là tạo ra kháng nguyên khảm
sinh vật. Tiềm năng của CRISPR/Cas9 cho cả nghiên cứu ung thư cơ bản và tịnh
Hình 7. CRISPR/Cas9 như một công cụ trị liệu. Nguyên tắc của các thử nghiệm lâm
sàng giai đoạn I đầu tiên sử dụng phương pháp loại bỏ CRISPR/cas9 ex vivo được thể
hiện: Tế bào lympho máu ngoại vi được thu thập từ bệnh nhân có khối u rắn (A) và
việc loại bỏ gen điểm kiểm tra miễn dịch PD1 qua trung gian CRISPR/Cas9 được thực
hiện trong Tế bào T (B–C). Các tế bào T loại bỏ PD1 được nhân rộng ex vivo và sau
đó được truyền trở lại bệnh nhân (D), tại đây chúng được cho là sẽ tạo ra phản ứng
miễn dịch chống lại các tế bào khối u.
114
Hội thảo về Sinh học Ung thư 55 (2019) 106–119
tế bào T thụ thể (CAR) với sự trợ giúp của CRISPR/Cas9. CAR là các thụ thể
tổng hợp được chuyển vào tế bào T của bệnh nhân để lập trình lại các tế bào
T nhằm tấn công các tế bào ác tính. Trong một nghiên cứu tiền lâm sàng gần
đây nhắm mục tiêu chuyển gen CAR đến locus chuỗi α thụ thể tế bào T (TRAC)
bằng cách sử dụng CRISPR Cas9 tạo ra các tế bào T có hoạt tính đào thải khối
u được tăng cường đáng kể so với các tế bào T CAR được sản xuất thông thường
bằng cách sử dụng vectơ tích hợp ngẫu nhiên [ 125 ]. Những dữ liệu thú vị này
từ mô hình chuột rất có thể sẽ thúc đẩy các thử nghiệm lâm sàng trong tương
lai gần. Đáng chú ý, bằng cách loại bỏ locus TRAC, thậm chí có thể tạo ra các
tế bào CAR T không có hoạt tính dị sinh, có thể được tạo ra từ tế bào T của
những người hiến tặng khỏe mạnh để lưu trữ và sau đó truyền cho nhiều bệnh
nhân khi cần. Cách tiếp cận này trước đây đã được thực hiện bằng cách sử dụng
TALEN (được xem xét bởi [121]).
So với chỉnh sửa bộ gen ex vivo, chỉnh sửa bộ gen in vivo vẫn chưa được
thực hiện trong các thử nghiệm lâm sàng. Một thử nghiệm lâm sàng đã đăng ký
duy nhất chưa được tuyển dụng (NCT03057912) có kế hoạch sử dụng các plasmid
TALEN hoặc CRISPR/Cas9 nhắm mục tiêu DNA HPV16 và HPV18 E6/E7. Các cấu trúc
này được cung cấp kèm theo một loại gel bôi cục bộ lên cổ tử cung bị nhiễm
HPV. Bên cạnh chế độ an toàn và liều lượng, sự thay đổi của HPV 16 hoặc 18,
cũng như tế bào học và mô học cổ tử cung sẽ được đánh giá trong thử nghiệm
giai đoạn 1 dự kiến bắt đầu vào đầu năm 2018. Đáng chú ý, một nghiên cứu có
khái niệm rất giống sử dụng ZFN đã hoàn thành giai đoạn thu thập dữ liệu
(NCT02800369). Những cải tiến về tính đặc hiệu của Cas9 để nhắm mục tiêu vào
các vùng gen được xác định rõ mà không có tác dụng ngoài mục tiêu và những
tiến bộ trong phương pháp phân phối nhằm vào các cơ quan hoặc khối u cụ thể
bằng cấu trúc CRISPR/Cas9 chắc chắn sẽ thúc đẩy sự phát triển của các thử
nghiệm lâm sàng chỉnh sửa gen in vivo hơn nữa trong tương lai.
10. Triển vọng tương lai của CRISPR cho nghiên cứu ung thư
Kể từ khi phát triển thành một công cụ chỉnh sửa bộ gen, công nghệ CRISPR/
Cas9 đã cách mạng hóa sinh học bằng cách cung cấp một phương pháp đơn giản
và linh hoạt để thao tác bộ gen, hệ phiên mã và hệ biểu sinh trên nhiều loại
tiến vẫn chưa bắt đầu được bộc lộ.
Trong tương lai, màn hình CRISPR tổng hợp sẽ cung cấp một bộ gen thiết yếu
toàn diện trên hầu hết các dòng tế bào ung thư. Nguồn tài nguyên này, kết hợp
với thông tin sẵn có về đặc điểm di truyền và biểu sinh của dòng tế bào ung
thư, sẽ cho phép xác định rộng rãi các tương tác gây chết tổng hợp và tạo
điều kiện thuận lợi cho việc khám phá các mục tiêu thuốc mới. Tuy nhiên, sẽ
cần nghiên cứu thực nghiệm đáng kể để hiểu đầy đủ các cơ chế sinh học đằng
sau nhiều tương tác di truyền được tiết lộ bởi màn hình CRISPR/Cas9.
Hơn nữa, CRISPR/Cas9 cung cấp một công cụ để thao tác các vùng không mã hóa
của bộ gen và sẽ đẩy nhanh việc khám phá chức năng về một khía cạnh có đặc
điểm kém cho đến nay của bộ gen ung thư. Kỹ thuật chính xác về các đột biến
phổ biến và hiếm gặp bằng CRISPR/Cas9 – kết hợp với nuôi cấy cơ quan tiên
tiến – sẽ cho phép các nhà nghiên cứu ung thư sao chép trình tự di truyền gây
ung thư của nhiều thực thể ung thư.
Điều này sẽ cung cấp những hiểu biết sâu sắc hơn về những thay đổi sinh học
được gây ra bởi các đột biến cá nhân và để tách biệt người lái khỏi đột biến
hành khách. Cuối cùng, chúng tôi hy vọng sẽ thấy được những kết quả chưa thể
đoán trước từ các thử nghiệm lâm sàng thí điểm áp dụng CRISPR/Cas9 như một
công cụ trị liệu nhắm vào hệ thống miễn dịch chống lại ung thư. Việc sử dụng
CRISPR/Cas9 trong tương lai trong y học tịnh tiến sẽ phụ thuộc phần lớn vào
khả năng phát triển các biến thể Cas9 với hiệu ứng tối thiểu hoặc không có
tác dụng ngoài mục tiêu và các phương pháp mới để cải thiện kỹ thuật thay đổi
di truyền chính xác nhưng kém hiệu quả bằng cách sửa chữa theo hướng tương
đồng. Hơn nữa, sẽ cần phải cải tiến các phương pháp phân phối vi-rút và không
vi-rút trong tương lai để cải thiện ứng dụng CRISPR/Cas9 in vivo, tạo nền
tảng cho việc sử dụng CRISPR trong điều trị trong tương lai. Tóm lại, sự
phát triển của công nghệ CRISPR/Cas9 đã và sẽ thúc đẩy đáng kể việc nghiên
cứu ung thư trong nhiều lĩnh vực.
Machine Translated by Google

T. Zhan và cộng sự. Hội thảo về Sinh học Ung thư 55 (2019) 106–119

Bảng 2

Các thử nghiệm lâm sàng đã đăng ký sử dụng CRISPR/Cas9 để điều trị khối
u. từ lâm sàng.gov, truy cập ngày 18-03-2018.

Mã định danh Tình trạng Điều trị theo giai đoạn

NCT03081715 Ung thư thực quản II Tế bào T loại bỏ PD-1

NCT02863913 Ung thư bàng quang TÔI Tế bào T loại bỏ PD-1

NCT02867345 Ung thư tuyến tiền liệt kháng nội tiết tố TÔI Tế bào T loại bỏ PD-1

NCT02867332 Ung thư biểu mô tế bào thận TÔI Tế bào T loại bỏ PD-1

NCT02793856 Ung thư phổi không phải tế bào nhỏ TÔI Tế bào T loại bỏ PD-1

NCT03044743 EBV dương tính giai đoạn ác tính Tôi/II EBV-CTL loại bỏ PD-1

NCT03166878 U lympho tế bào B/bệnh bạch cầu Tôi/II CRISPR-Cas9 đã chỉnh sửa các tế bào CAR-T nhắm mục tiêu CD19

NCT03057912 Tân sinh nội biểu mô cổ tử cung liên quan đến HPV TÔI
Gel CRISPR/Cas9-sg HPV E6/E7 để phá vỡ các tế bào T tự thân DNA của

NCT03399448 Đa u tủy, sarcoma hoạt dịch, sarcoma mỡ dạng myxoid/tế bào tròn, u ác tính TÔI
HPV nhắm vào kháng nguyên khối u NY-ESO-1, được chỉnh sửa bằng CRISPR-Cas9 để phá vỡ các tế bào TCRα, TCRβ và PD-1

nội sinh (Tế bào T NYCE)

NCT03398967 U lympho tế bào B/bệnh bạch cầu Tôi/II CRISPR-Cas9 đã chỉnh sửa các tế bào CAR-T nhắm mục tiêu CD19 và CD20 hoặc CD22

Xung đột lợi ích K. Leinonen, J. Lin, Y. Liu, M. Miller, SM Reynolds, H. Rovira, I. Shmulevich, V. Thorsson, D. Yang,

W. Zhang, S. Amin, C.-J. Ngô, C.-C. Wu, R. Akbani, K. Aldape, KA Baggerly, B. Broom, TD

Casasent, J. Cleland, C. Creighton, D. Dodda, M. Edgerton, L. Han, SM Herbrich, Z. Ju, H. Kim , S.

Không có.
Lerner, J. Li, H. Liang, W. Liu, PL Lorenzi, Y. Lu, J. Melott, GB Mills, L. Nguyen, X. Su, R.

Verhaak, W. Wang, JN Weinstein, A. Wong, Y. Yang, J. Yao, R. Yao, K. Yoshihara, Y. Yuan, AK Yung,

Sự nhìn nhận N. Zhang, S. Zheng, M. Ryan, DW Kane, BA Aksoy, G. Ciriello, G Dresdner, J. Gao, B. Gross, A.

Jacobsen, A. Kahles, M. Ladanyi, W. Lee, K.-V. Lehmann, ML Miller, R. Ramirez, G. Rätsch, B. Reva,

C. Sander, N. Schultz, Y. Senbabaoglu, R. Shen, R. Sinha, SO Sumer, Y. Sun, BS Taylor, N. Weinhold ,

Chúng tôi cảm ơn Florian Heigwer và Luisa Henkel vì đã đọc kỹ bản S. Fei, P. Spellman, C. Benz, D. Carlin, M. Cline, B. Craft, K. Ellrott, M. Goldman, D. Haussler, S. Ma,

thảo và đóng góp những ý tưởng quý giá. TZ được hỗ trợ bởi chương trình S. Ng, E. Paull, A . Radenbaugh, S. Salama, A. Sokolov, JM Stuart, T. Swatloski, V. Uzunangelov, P.

Waltman, C. Yau, J. Zhu, SR Hamilton, G. Getz, C. Sougnez, S. Abbott, R . Abbott, ND Dees, K. Delehaunty,
nghiên cứu “Nicht codierende RNA” của Baden-Württemberg Stiftung. JB
L. Ding, DJ Dooling, JM Eldred, CC Fronick, R. Fulton, LL Fulton, J. Kalicki-Veizer, K.-L. Kanchi,
được hỗ trợ bởi chương trình “Nhà khoa học bác sĩ dịch thuật (TRAPS)” C. Kandoth, DC Koboldt, DE Larson, TJ Ley, L. Lin, C. Lu, VJ Magrini, ER Mardis, MD McLellan, JF

của Khoa Y Mannheim, Đại học Heidelberg và Bang Baden-Württemberg. McMichael, CA Miller, M. O'Laughlin, C. Pohl, H. Schmidt, SM Smith, J. Walker, JW Wallis, MC Wendl, RK

Wilson, T. Wylie, Q. Zhang, R. Burton, MA Jensen, A. Kahn, T. Pihl, D. Pot, Y. Wan, DA Levine,

AD Black, J. Bowen, J. Frick, JM Gastier-Foster, HA Harper, C. Helsel, KM Leraas, TM Lichtenberg, C.

MPE được hỗ trợ bởi các khoản tài trợ từ Bang Baden-Württemberg cho McAllister, NC Ramirez, S. Sharpe, L. Wise, E. Zmuda, SJ Chanock, T. Davidsen, JA Demchok, G. Eley, I.

“Trung tâm Ung thư Lão khoa (ZOBEL) – Perspektivförderung” và “Sinh học Felau, BA Ozenberger, M. Sheth, H. Sofia, L. Staudt, R. Tarnuzzer, Z. Wang, L. Yang, J.

về sự yếu đuối – Sonderlinie Medizin”. Nhóm MB và MPE được hỗ trợ bởi Zhang, L .Omberg, A. Margolin, BJ Raphael, F. Vandin, H.-T. Wu, MDM Leiserson, SC Benz, CJ Vaske, H.

Noushmehr, T. Knijnenburg, D. Wolf, LV Veer, EA Collisson, D. Anastassiou, T.-HO Yang, N. Lopez-

Quỹ Hector II. Chúng tôi xin lỗi tất cả các đồng nghiệp có tác phẩm
Bigas, A. Gonzalez-Perez , D. Tamborero, Z. Xia, W. Li, D.- Y. Cho, T. Przytycka, M. Hamilton,
không thể được trích dẫn do hạn chế về không gian. S. McGuire, S. Nelander, P. Johansson, R. Jörnsten, T. Kling, J. Sanchez, JN Weinstein, EA

Collisson, GB Mills, KRM Shaw, BA Ozenberger, K. Ellrott, I. Shmulevich, C. Sander, JM Stuart, Dự án phân

tích ung thư toàn bộ bản đồ bộ gen ung thư, Nat. Genet. 45 (2013) 1113–1120, http://dx.doi.org/
Người giới thiệu
10.1038/ng.2764.

[1] LA Torre, F. Bray, RL Siegel, J. Ferlay, J. Lortet-Tieulent, A. Jemal, Toàn cầu

Thống kê ung thư, 2012, CA. Ung thư J. Lâm sàng. 65 (2015) 87–108, http://dx.doi.org/ 10.3322/caac.21262.

[2] H. Kantarjian, C. Sawyers, A. Hochhaus, F. Guilhot, C. Schiffer, C. Gambacorti-Passerini, D.

Niederwieser, D. Resta, R. Capdeville, U. Zoellner, M. Talpaz, B . Druker, J. Goldman, SG

O'Brien, N. Russell, T. Fischer, O. Ottmann, P. Cony-Makhoul, T. Facon, R. Stone, C. Miller, M. Tallman,

[5] Hiệp hội bộ gen ung thư quốc tế TICG, TJ Hudson, W. Anderson, A. Artez, AD Barker, C. Bell, RR Bernabé,
R. Brown, M. Schuster, T. Loughran, A. Gratwohl, F. Mandelli, G. Saglio, M. Lazzarino, D. Russo,
MK Bhan, F. Calvo, I. Eerola, DS Gerhard, A. Guttmacher, M. Guyer, FM Hemsley, JL Jennings, D.
M. Baccarani, E. Morra, Phản ứng về huyết học và tế bào học đối với imatinib me-sylate trong
Kerr, P. Klatt, P. Kolar, J. Kusada, DP Lane, F. Laplace, L. Youyong, G. Nettekoven, B. Ozenberger,
bệnh bạch cầu dòng tủy mãn tính, N. Anh. J. Med. 346 (2002) 645–652, http://dx.doi.org/10.1056/
J. Peterson, TS Rao, J. Remacle, AJ Schafer, T. Shibata, MR Stratton, JG Vockley, K. Watanabe, H.
NEJMoa011573.
Yang, MMF Yuen, BM Knoppers, M. Bobrow, A. Cambon-Thomsen, LG Dressler, SOM Dyke, Y. Joly , K.

Kato, KL Kennedy, P. Nicolás, MJ Parker, E. Rial-Sebbag, CM Romeo-Casabona, KM Shaw, S. Wallace, GL

[3] D. Cunningham, Y. Humblet, S. Siena, D. Khayat, H. Bleiberg, A. Santoro, D. Bets, M. Mueser, A. Harstrick,
Wiesner, N. Zeps, P. Lichter, AV Biankin, C. Chabannon , L. Chin, B. Clément, E. de Alava, F. Degos,
C. Verslype, I. Chau, E. Van Cutsem, Cetuximab đơn trị liệu và cetuximab cộng với irinotecan trong bệnh
ML Ferguson, P. Geary, DN Hayes, TJ Hudson, AL Johns, A. Kasprzyk, H. Nakagawa, R. Penny, MA Piris,
ung thư trực tràng màu di căn kháng irinotecan, N. Engl. J. Med. 351 (2004) 337–345, http://dx.doi.org/
R . Sarin, A. Scarpa, T. Shibata, M. van de Vijver, PA Futreal, H. Aburatani, M. Bayés, DDL
10.1056/NEJMoa033025 .
Botwell, PJ Campbell, X. Estivill, DS Gerhard, SM Grimmond, I. Gut, M. Hirst, C. López-Otín, P. Majumder,

M. Marra, JD McPherson, H. Nakagawa, Z. Ning, XS Puente, Y. Ruan, T. Shibata, MR Stratton, HG

[4] K. Chang, CJ Creighton, C. Davis, L. Donehower, J. Drummond, D. Wheeler, A. Ally, M. Balasundaram, I.
Stunnenberg, H. Swerdlow, VE Velculescu , RK Wilson, HH Xue, L. Yang, PT Spellman, GD Bader,
Birol, YSN Butterfield, A. Chu, E. Chuah, H .- JE Chun, N. Dhalla, R. Guin, M. Hirst, C. Hirst,

RA Holt, SJM Jones, D. Lee, HI Li, MA Marra, M. Mayo, RA Moore, AJ Mungall, AG Robertson, JE Schein, P. PC Boutros, PJ Campbell, P. Flicek, G. Getz, R. Guigó, G. Guo, D. Haussler, S. Heath, TJ Hubbard, T.

Jiang, SM Jones, Q. Li, N. López-Bigas, R. Luo, L. Muthuswamy, BFF Ouellette, JV Pearson, XS

Sipahimalani, A. Tam, N. Thiessen, RJ Varhol, R. Beroukhim, AS Bhatt, AN Brooks, AD Cherniack,
Puente, V. Quesada, BJ Raphael, C. Sander, T. Shibata, TP Tốc độ, LD Stein, JM Stuart, JW
SS Freeman, SB Gabriel, E. Helman, J. Jung, M. Meyerson, AI Ojesina, CS Pedamallu, G. Saksena, SE

Schumacher, B. Tabak, T. Zack, ES Lander, CA Bristow, A. Hadjipanayis, P. Haseley, R. Kucherlapati, S. Teague, Y. Totoki, T. Tsunoda, A. Valencia, DA Wheeler, H. Wu, S. Zhao, G. Chu, LD Stein, R. Guigó,

TJ Hubbard, Y. Joly, SM Jones, A. Kasprzyk, M. Lathrop, N. López-Bigas, BFF Ouellette, PT

Lee, E. Lee, LJ Luquette, HS Mahadeshwar, A. Pantazi, M. Parfenov, PJ Park, A. Protopopov, X. Ren, N.
Spellman, JW Teague, G. Thomas, A. Valencia, T. Yoshida, KL Kennedy, M. Axton, SOM Dyke, PA Futreal, DS
Santoso, J. Seidman, S. Seth, X. Song, J. Tang, R. Xi, AW Xu, L. Yang, D. Zeng, JT Auman, S.
Gerhard, C. Gunter, M. Guyer, TJ Hudson, JD McPherson, LJ Miller, B. Ozenberger, KM Shaw, A.
Balu, E. Buda, C. Fan, KA Hoadley, CD Jones, S. Meng, PA Mieczkowski, JS Parker, CM Perou, J.
Kasprzyk, LD Stein, J. Zhang, SA Haider, J. Wang, CK Yung , A. Cros, A. Cross, Y. Liang, S.
Roach, Y. Shi, GO Silva , D. Tan, U. Veluvolu, S. Waring, MD Wilkerson, J. Wu, W. Zhao, T. Bodenheimer,
Gnaneshan, J. Guberman, J. Hsu, M. Bobrow, DRC Chalmers, KW Hasel, Y. Joly, TSH Kaan, KL
DN Hayes, AP Hoyle, SR Jeffreys, LE Mose, JV Simons, MG Soloway, SB Baylin, BP Berman, MS Bootwalla, L.
Kennedy, BM Knoppers, WW Lowrance , T. Masui, P. Nicolás, E. Rial-Sebbag, LL Rodriguez, C.
Danilova, JG Herman, T. Hinoue, PW Laird, SK Rhie, H. Shen, T. Triche, DJ Weisenberger, SL
Vergely, T. Yoshida, SM Grimmond, AV Biankin, DDL Bowtell, N. Cloonan, A. DeFazio, JR Eshleman,
Carter, K. Cibulskis, L. Chin, J. Zhang, G. Getz, C. Sougnez, M. Wang, G. Saksena, SL Carter,
D. Etemadmoghadam, BB Gardiner, BA Gardiner, JG Kench, A. Scarpa, RL Sutherland, MA Tempero, NJ Waddell,
K. Cibulskis, L. Chin, J. Zhang, G. Getz, H. Dinh, HV Doddapaneni, R. Gibbs, P. Gunaratne, Y.
PJ Wilson,
Han, D. Kalra, C. Kovar, L. Lewis, M. Morgan, D. Morton, D. Muzny, J. Reid, L. Xi, J. Cho, D. DiCara,

S. Frazer, N. Gehlenborg, DI Heiman, J. Kim, MS Lawrence, P. Lin, Y. Liu, MS Noble, P. Stojanov,

D. Voet, H. Zhang, L. Zou, C. Stewart, B. Bernard, R. Bressler, A . Eakin, L. Iype, T. Knijnenburg, R.

Kramer, R. Kreisberg,

115
Machine Translated by Google
T. Zhan và cộng sự.
JD McPherson, S. Gallinger, M.-S. Tsao, PA Shaw, GM Petersen, D. Mukhopadhyay,
L. Chin, RA DePinho, S. Thayer, L. Muthuswamy, K. Shazand, T. Beck, M. Sam, L. Timms, V.
Ballin, Y. Lu , J. Ji, X. Zhang, F. Chen, X. Hu, G. Chu, Q. Yang, G. Tian, L. Zhang,
X. Xing, X. Li, Z. Zhu, Y. Yu, J . Yu, H. Yang, M. Lathrop, J. Tost, P. Brennan, I. Holcatova,
D. Zaridze, A. Brazma, L. Egevard, E. Prokhortchouk, RE Banks, M. Uhlén, A. Cambon- Thomsen,
J. Viksna, F. Ponten, K. Skryabin, MR Stratton, PA Futreal, E. Birney, A. Borg, A.-
L. Børresen-Dale, C. Caldas, JA Foekens, S. Martin, JS Reis -Filho, AL Richardson,
C. Sotiriou, HG Stunnenberg, G. Thoms, M. van de Vijver, L. van't Veer, F.
Calvo, D. Birnbaum, H. Blanche, P. Boucher, S. Boyault, C. Chabannon, I. Gut, JD Masson-
Jacquemier, M. Lathrop, I. Pauporté, X. Pivot, A. Vincent-Salomon, E. Tabone, C.
Theillet, G. Thomas, J. Tost, I. Treilleux , F. Calvo, P. Bioulac-Sage, B. Clément, T.
Decaens, F. Degos, D. Franco, I. Gut, M. Gut, S. Heath, M. Lathrop, D. Samuel, G.
Thomas , J. Zucman-Rossi, P. Lichter, R. Eils, B. Brors, JO Korbel, A. Korshunov, P.
Landgraf, H. Lehrach, S. Pfister, B. Radlwimmer, G. Reifenberger, MD Taylor, C . von Kalle,
PP Majumder, R. Sarin, TS Rao, MK Bhan, A. Scarpa, P. Pederzoli, RA Lawlor, M. Delledonne,
A. Bardelli, AV Biankin, SM Grimmond, T. Gress, D. Klimstra, G. Zamboni, T. Shibata,
Y. Nakamura, H. Nakagawa, J. Kusada, T. Tsunoda, S. Miyano, H. Aburatani, K. Kato, A.
Fujimoto, T. Yoshida, E. Campo, C. López-Otín, X. Estivill, R. Guigó, S. de Sanjosé, MA
Piris, E. Montserrat, M. González-Díaz, XS Puente, P. Jares, A. Valencia, H.
Himmelbauer, H. Himmelbaue, V . Quesada, S. Bea, MR Stratton, PA Futreal, PJ
Campbell, A. Vincent-Salomon, AL Richardson, JS Reis-Filho, M. van de Vijver, G. Thomas, JD
Masson-Jacquemier, S. Aparicio, A .Borg, A.-L. Børresen-Dale, C. Caldas, JA Foekens, HG
Stunnenberg, L. van't Veer, DF Easton, PT Spellman, S. Martin, AD Barker, L.
Chin, FS Collins, CC Compton, ML Ferguson, DS Gerhard, G. Getz, C. Gunter, A.
Guttmacher, M. Guyer, DN Hayes, ES Lander, B. Ozenberger, R. Penny, J. Peterson, C.
Sander, KM Shaw, TP Speed, PT Spellman, JG Vockley, DA Wheeler, RK Wilson, TJ
Hudson, L. Chin, BM Knoppers, ES Lander, P. Lichter, LD Stein, MR Stratton, W. Anderson,
AD Barker, C. Bell, M. Bobrow, W. Burke, FS Collins , CC Compton, RA DePinho, DF
Easton, PA Futreal, DS Gerhard, AR Green, M. Guyer, SR Hamilton, TJ Hubbard, OP
Kallioniemi, KL Kennedy, TJ Ley, ET Liu, Y. Lu, P. Majumder, M .Marra, B. Ozenberger, J.
Peterson, AJ Schafer, PT Spellman, HG Stunnenberg, BJ Wainwright, RK Wilson, H. Yang, Mạng
lưới dự án gen ung thư quốc tế, Nature 464 (2010) 993–998, http: // dx.doi.org/
10.1038/nature08987.
[6] LA Garraway, ES Lander, Bài học từ bộ gen ung thư, Tế bào 153 (2013)
17–37, http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2013.03.002.
[7] JK Joung, JD Sander, TALENs: một công nghệ được áp dụng rộng rãi cho mục tiêu
chỉnh sửa bộ gen, Nat. Linh mục Mol. Tế bào sinh học. 14 (2012) 49–55, http://dx.doi.org/10.
1038/nrm3486.
[8] FD Urnov, EJ Rebar, MC Holmes, HS Zhang, PD Gregory, Chỉnh sửa bộ gen bằng các hạt nhân ngón
tay kẽm được thiết kế, Nat. Linh mục Genet. 11 (2010) 636–646, http://dx.doi.org/10.1038/
nrg2842.
[9] L. Cong, FA Ran, D. Cox, S. Lin, R. Barretto, N. Habib, PD Hsu, X. Wu, W. Jiang, LA Marraffini,
F. Zhang, Kỹ thuật ghép gen bằng CRISPR/ Hệ thống Cas, Khoa học. 339 (2013) 819–823, http://
dx.doi.org/10.1126/science.1231143.
[10] P. Mali, L. Yang, KM Esvelt, J. Aach, M. Guell, JE DiCarlo, JE Norville,
GM Church, kỹ thuật bộ gen người được hướng dẫn bằng RNA thông qua Cas9, Science. 339
(2013) 823–826 http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=
3712628&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
[11] Y. Ishino, H. Shinagawa, K. Makino, M. Amemura, A. Nakata, Trình tự nucleotide của gen iap,
chịu trách nhiệm chuyển đổi isozyme phosphatase kiềm ở Escherichia coli và xác định
sản phẩm gen, J. Bacteriol . 169 (1987) 5429–5433, http://dx.doi.org/10.1128/
jb.169.12.5429-5433.1987.
[12] M. Kampmann, CRISPRi và CRISPRa sàng lọc tế bào động vật có vú để phục vụ sinh học và y học
chính xác, ACS Chem. Biol. (2017), http://dx.doi.org/10.1021/acschembio.7b00657 .
[13] A. Bolotin, B. Quinquis, A. Sorokin, SD Ehrlich, Cụm lặp lại palindrome ngắn xen kẽ thường
xuyên (CRISPR) có các miếng đệm có nguồn gốc ngoại bào, Vi sinh 151 (2005) 2551–2561,
http://dx.doi . org/10.1099/mic.0.28048-0.
[14] C. Pourcel, G. Salvignol, G. Vergnaud, các phần tử CRISPR ở Yersinia pestis thu được các đoạn
lặp mới bằng cách hấp thu ưu tiên DNA của thực khuẩn và cung cấp các công cụ bổ sung cho các
nghiên cứu tiến hóa, Vi sinh học 151 (2005) 653–663, http: / /dx.doi. org/10.1099/
mic.0.27437-0.
[15] FJM Mojica, C. Díez-Villaseñor, J. García-Martínez, E. Soria, Can thiệp se-
các loại lặp lại ở sinh vật nhân sơ có khoảng cách đều đặn có nguồn gốc từ các yếu tố di
truyền ngoại lai, J. Mol. Tiến hóa. 60 (2005) 174–182, http://dx.doi.org/10.1007/
s00239-004-0046-3 .
[16] R. Barrangou, C. Fremaux, H. Deveau, M. Richards, P. Boyaval, S. Moineau,
DA Romero, P. Horvath, CRISPR cung cấp khả năng kháng lại virus ở sinh vật nhân sơ, Science
315 (2007) 1709–1712, http://dx.doi.org/10.1126/science. 1138140.
[17] E. Deltcheva, K. Chylinski, CM Sharma, K. Gonzales, Y. Chao, ZA Pirzada,
Sự trưởng thành RNA của MR Eckert, J. Vogel, E. Charpentier, CRISPR bằng RNA nhỏ được mã hóa
chuyển hóa và yếu tố chủ RNase III, Nature. 471 (2011) 602–607, http://dx.doi. org/10.1038/
nature09886.
[18] G. Gasiunas, R. Barrangou, P. Horvath, V. Siksnys, phức hợp ribonucleoprotein Cas9-crRNA làm
trung gian cho sự phân cắt DNA cụ thể để tạo ra khả năng miễn dịch thích nghi ở vi khuẩn, Proc.
Natl. Học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 109 (2012), http://dx.doi.org/10.1073/pnas.1208507109 E2579–
86.
[19] M. Jinek, K. Chylinski, I. Fonfara, M. Hauer, JA Doudna, E. Charpentier, Một endonuclease DNA
kép được hướng dẫn bằng RNA có thể lập trình theo ngữ pháp trong khả năng miễn dịch vi khuẩn
thích nghi, Khoa học 337 (2012) 816–821 , http://dx.doi.org/10.1126/science.1225829.
116
Hội thảo về Sinh học Ung thư 55 (2019) 106–119
[20] H. Deveau, R. Barrangou, JE Garneau, J. Labonté, C. Fremaux, P. Boyaval, DA Romero, P.
Horvath, S. Moineau, Phản ứng của Phage đối với khả năng kháng lại mã hóa CRISPR ở
Streptococcus thermophilus, J. Vi khuẩn. 190 (2008) 1390–1400, http://dx.doi.org/10.1128/
JB.01412-07.
[21] SH Sternberg, S. Redding, M. Jinek, EC Greene, JA Doudna, Thẩm vấn DNA bằng endnuclease Cas9
hướng dẫn RNA CRISPR, Nature. 507 (2014) 62–67, http://dx.doi.org/10.1038/nature13011 .
[22] H. Deveau, R. Barrangou, JE Garneau, J. Labonté, C. Fremaux, P. Boyaval, DA Romero, P.
Horvath, S. Moineau, Phản ứng của Phage đối với khả năng kháng lại mã hóa CRISPR ở
Streptococcus thermophilus, J. Vi khuẩn. 190 (2008) 1390–1400, http://dx.doi.org/10.1128/
JB.01412-07.
[23] B. Chen, LA Gilbert, BA Cimini, J. Schnitzbauer, W. Zhang, GW Li, J. Park, EH Blackburn, JS
Weissman, LS Qi, B. Huang, Hình ảnh động của locus gen trong tế bào người sống bởi hệ thống
CRISPR/Cas được tối ưu hóa, Cell. 155 (2013) 1479–1491, http://dx.doi.org/10.1016/
j.cell.2013.12.001.
[24] B. Zetsche, JS Gootenberg, OO Abudayyeh, IM Slaymaker, KS Makarova, P. Essletzbichler, SE
Volz, J. Joung, J. van der Oost, A. Regev, EV Koonin, F. Zhang, Cpf1 Là một Endonuclease
đơn hướng dẫn RNA của hệ thống CRISPR-Cas loại 2, Ô 163 (2015) 759–771, //dx.doi.org/
10.1016/j.cell.2015.09.038.
[25] OO Abudayyeh, JS Gootenberg, S. Konermann, J. Joung, IM Slaymaker,
DBT Cox, S. Shmkov, KS Makarova, E. Semenova, L. Minakhin, K. Severinov, A. Regev, ES Lander,
EV Koonin, F. Zhang, C2c2 là một RNA được hướng dẫn lập trình bằng RNA có thể lập trình
một thành phần- nhắm mục tiêu tác nhân CRISPR, Khoa học 353 (2016), http://dx.doi.org/
10.1126/science.aaf5573.
[26] AA Smargon, DBT Cox, NK Pyzocha, K. Zheng, IM Slaymaker,
JS Gootenberg, OA Abudayyeh, P. Essletzbichler, S. Shmkov, KS Makarova, EV Koonin, F. Zhang,
Cas13b Là một RNase hướng dẫn RNA liên quan đến CRISPR loại VI-B được điều hòa khác nhau
bởi các protein phụ kiện Csx27 và Csx28, Mol. Tế bào. 65 (2017) 618–630, http://dx.doi.org/
10.1016/j.molcel.2016.12.023 e7.
[27] LS Qi, MH Larson, LA Gilbert, JA Doudna, JS Weissman, AP Arkin,
WA Lim, Tái sử dụng CRISPR làm nền tảng hướng dẫn RNA để kiểm soát biểu hiện gen theo trình
tự cụ thể, Tế bào 152 (2013) 1173–1183, http://dx.doi.org/10. 1016/j.cell.2013.02.022.
[28] LA Gilbert, MH Larson, L. Morsut, Z. Liu, RNA mô-đun qua trung gian CRISPR-
quy định phiên mã có hướng dẫn ở sinh vật nhân chuẩn, Tế bào (2013) 1–10, http://dx.doi. org/
10.1016/j.cell.2013.06.044.
[29] PI Thakore, AM D'Ippolito, L. Song, A. Safi, NK Shivakumar, AM Kabadi,
TE Reddy, GE Crawford, CA Gersbach, Chỉnh sửa biểu sinh có tính đặc hiệu cao bằng bộ ức chế
CRISPR-Cas9 để làm im lặng các yếu tố điều hòa ở xa, Nat. Phương pháp 12 (2015) 1143–1149,
http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.3630.
[30] ML Maeder, SJ Linder, VM Cascio, Y. Fu, QH Ho, JK Joung, CRISPR
Sự kích hoạt các gen nội sinh của con người được hướng dẫn bởi RNA, Nat. Phương pháp 10
(2013) 977–979, http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.2598.
[31] A. Chavez, J. Scheiman, S. Vora, BW Pruitt, M. Tuttle, EPR Iyer, S. Lin, S. Kiani,
CD Guzman, DJ Wiegand, D. Ter-Ovanesyan, JL Braff, N. Davidsohn, BE Housden, N.
Perrimon, R. Weiss, J. Aach, JJ Collins, GM Church, Lập trình phiên mã qua trung gian Cas9
hiệu quả cao, Nat. Phương pháp 12 (2015) 326–328, http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.3312.
[32] ME Tanenbaum, LA Gilbert, LS Qi, JS Weissman, RD Vale, Hệ thống gắn thẻ protein để khuếch đại
tín hiệu trong biểu hiện gen và hình ảnh huỳnh quang, Tế bào 159 (2014) 635–646, http://
dx.doi . org/10.1016/j.cell.2014.09.039.
[33] S. Konermann, MD Brigham, AE Trevino, J. Joung, OO Abudayyeh, C. Barcena, PD Hsu, N. Habib,
JS Gootenberg, H. Nishimasu, O. Nureki, F. Zhang, phiên mã quy mô bộ gen kích hoạt bằng phức
hợp CRISPR-Cas9 được thiết kế, Nature 517 (2014) 583–588, http://dx.doi.org/10.1038/
nature14136.
[34] A. Chavez, M. Tuttle, BW Pruitt, B. Ewen-Campen, R. Chari, D. Ter-Ovanesyan, SJ Haque, RJ
Cecchi, EJK Kowal, J. Buchthal, BE Housden, N. Perrimon, JJ Collins, G. Church, So sánh
các chất kích hoạt Cas9 ở nhiều loài, Nat.
Phương pháp 13 (2016) 563–567, http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.3871.
[35] JI McDonald, H. Celik, LE Rois, G. Fishberger, T. Fowler, R. Rees, A. Kramer, A. Martens, JR
Edwards, GA Challen, Hệ thống dựa trên CRISPR/Cas9 có thể lập trình lại để tạo trang web-
methyl hóa DNA cụ thể, Biol. Mở 5 (2016) 866–874, http://dx.doi.org/10.1242/bio.019067.
[36] A. Vojta, P. Dobrinić, V. Tadić, L. Bočkor, P. Korać, B. Julg, M. Klasić, V. Zoldoš, Tái sử
dụng hệ thống CRISPR-Cas9 để methyl hóa DNA mục tiêu, Nucleic Acids Res. 44 (2016) 5615–5628,
http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkw159.
[37] P. Stepper, G. Kungulovski, RZ Jurkowska, T. Chandra, F. Krueger, R. Reinhardt, W. Reik, A.
Jeltsch, TP Jurkowski, Quá trình methyl hóa DNA nhắm mục tiêu hiệu quả với chimeric
dCas9–Dnmt3a–Dnmt3L methyltransferase, Axit nucleic Res. 45 (2017) 1703–1713, http://dx.doi.org/
10.1093/nar/gkw1112.
[38] X. Xu, Y. Tao, X. Gao, L. Zhang, X. Li, W. Zou, K. Ruan, F. Wang, G. Xu, R. Hu, Một cách tiếp
cận dựa trên CRISPR cho mục tiêu Khử bằng DNA, Cell Discov. 2 (2016) 16009, http://
dx.doi.org/10.1038/celldisc.2016.9.
[39] IB Hilton, AM D'Ippolito, CM Vockley, PI Thakore, GE Crawford,
TE Reddy, CA Gersbach, Chỉnh sửa Epigenome bằng acetyl-transferase dựa trên CRISPR-Cas9
kích hoạt gen từ các chất xúc tiến và chất tăng cường, Nat. Công nghệ sinh học. 33 (2015)
510–517, http://dx.doi.org/10.1038/nbt.3199.
[40] AC Komor, YB Kim, MS Packer, JA Zuris, DR Liu, Lập trình chỉnh sửa cơ sở mục tiêu trong DNA bộ
gen mà không cần phân tách DNA chuỗi kép, Nature 533 (2016) 420–424, http: //dx.doi .org/
10.1038/nature17946.
[41] C. Kuscu, M. Parlak, T. Tufan, J. Yang, K. Szlachta, X. Wei, R. Mammadov, M. Adli, CRISPR-
STOP: làm im lặng gen thông qua các đột biến vô nghĩa do chỉnh sửa cơ sở gây ra, Nat. Phương
pháp 14 (2017) 710–712, http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.4327.
[42] K. Nishida, T. Arazoe, N. Yachie, S. Banno, M. Kakimoto, M. Tabata, M. Mochizuki, A. Miyabe,
M. Araki, KY Hara, Z. Shimatani, A. Kondo, Chỉnh sửa nucleotide có mục tiêu bằng cách sử
dụng hệ thống miễn dịch thích nghi của sinh vật nhân sơ và động vật có xương sống, Khoa học
Machine Translated by Google
T. Zhan và cộng sự.
353 (2016), http://dx.doi.org/10.1126/science.aaf8729.
[43] Y. Ma, J. Zhang, W. Yin, Z. Zhang, Y. Song, X. Chang, qua trung gian AID mục tiêu
đột biến gen (TAM) cho phép đa dạng hóa bộ gen hiệu quả trong tế bào động vật có vú,
Nat. Phương pháp 13 (2016) 1029–1035, http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.4027.
[44] GT Hess, L. Frésard, K. Han, CH Lee, A. Li, KA Cimprich, SB Montgomery, MC Bassik, Tiến
hóa có định hướng bằng cách sử dụng đột biến soma nhắm mục tiêu dCas9 trong tế bào
động vật có vú, Nat. Phương pháp 13 (2016) 1036–1042, http://dx.doi.org/10. 1038/
nmeth.4038.
[45] T. Hart, AHY Tong, K. Chan, J. Van Leeuwen, A. Seetharaman, M. Aregger, M.
Chandrashekhar, N. Hustedt, S. Seth, A. Noonan, A. Habsid, O. Sizova , L.
Nedyalkova, R. Climie, L. Tworzyanski, K. Lawson, MA Sartori, S. Alibeh, D. Tieu,
S. Masud, P. Mero, A. Weiss, KR Brown, M. Usaj, M. Billmann , M. Rahman, M.
Costanzo, CL Myers, BJ Andrews, C. Boone, D. Durocher, J. Moffat, Đánh giá và
thiết kế màn hình loại trừ CRISPR/SpCas9 trên toàn bộ gen, Genes Genom. Genet. 7
(2017) 2719–2727, http://dx.doi.org/10.1534/ g3.117.041277.
[46] JG Doench, N. Fusi, M. Sullender, M. Hegde, EW Vaimberg, KF Donovan,
I. Smith, Z. Tothova, C. Wilen, R. Orchard, HW Virgin, J. Listgarten, DE Root, Thiết kế
sgRNA được tối ưu hóa để tối đa hóa hoạt động và giảm thiểu tác động ngoài mục tiêu
của CRISPR-Cas9, Nat. Công nghệ sinh học. (2016), http://dx.doi.org/10.1038/nbt.3437.
[47] SQ Tsai, Z. Zheng, NT Nguyễn, M. Liebers, VV Topkar, V. Thapar,
N. Wyvekens, C. Khayter, AJ Iafrate, LP Le, MJ Aryee, JK Joung, GUIDE-seq cho phép lập
hồ sơ trên toàn bộ bộ gen về sự phân tách ngoài mục tiêu bằng các hạt nhân CRISPR-
Cas, Nat. Công nghệ sinh học. 33 (2014) 187–197, http://dx.doi.org/10.1038/nbt.3117.
[48] D. Kim, S. Bae, J. Park, E. Kim, S. Kim, HR Yu, J. Hwang, J.-I. Kim, J.-S. Kim, Digenome-
seq: lập hồ sơ toàn bộ bộ gen về các hiệu ứng ngoài mục tiêu CRISPR-Cas9 trong tế bào
người, Nat. Phương pháp 12 (2015) 237–243, http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.3284.
[49] SQ Tsai, NT Nguyen, J. Malagon-Lopez, VV Topkar, MJ Aryee, JK Joung, CIRCLE-seq: một
màn hình in vitro có độ nhạy cao đối với các mục tiêu nuclease CRISPR–Cas9 trên
toàn bộ gen, Nat. Phương pháp 14 (2017) 607–614, http://dx.doi.org/10. 1038/
nmeth.4278.
[50] JA Meier, F. Zhang, NE Sanjana, HƯỚNG DẪN: thiết kế sgRNA cho màn hình mất chức năng,
Nat. Phương pháp 14 (2017) 831–832, http://dx.doi.org/10.1038/nmeth. 4423.
[51] F. Heigwer, T. Zhan, M. Breinig, J. Winter, D. Brügemann, S. Leible, M. Boutros, nhà
thiết kế thư viện CRISPR (CLD): phần mềm thiết kế đa loài của các thư viện RNA hướng
dẫn đơn, Genome Biol . 17 (2016) 55, http://dx.doi.org/10.1186/s13059-016-0915-2 .
[52] B. Evers, K. Jastrzebski, JPM Heijmans, W. Grernrum, RL Beijersbergen,
R. Bernards, sàng lọc loại trừ CRISPR vượt trội hơn shRNA và CRISPRi trong việc xác
định các gen thiết yếu, Nat. Công nghệ sinh học. 34 (2016) 631–633, http://dx.doi.
org/10.1038/nbt.3536.
[53] DM Munoz, PJ Cassiani, L. Li, E. Billy, JM Korn, MD Jones, J. Golji, DA Ruddy,
K. Yu, G. McAllister, A. Deweck, D. Abramowski, J. Wan, MD Shirley, SY
Neshat, D. Rakiec, R. De Beaumont, O. Weber, A. Kauffmann, E. Robert McDonald, N. Keen,
F. Hofmann, Người bán WR, T. Schmelzle, F. Stegmeier, MR Schlabach, Màn hình
CRISPR cung cấp đánh giá toàn diện về các lỗ hổng ung thư nhưng tạo ra các kết quả
dương tính giả đối với các vùng gen được khuếch đại cao, Cancer Discov. 6 (2016) 900–
913, http://dx.doi.org/10.1158/ 2159-8290.CD-16-0178.
[54] T. Hart, M. Chandrashekhar, M. Aregger, Z. Steinhart, KR Brown, G. MacLeod, M. Mis, M.
Zimmermann, A. Fradet-Turcotte, S. Sun, P. Mero, P. Dirks, S. Sidhu, FP Roth, OS
Rissland, D. Durocher, S. Angers, J. Moffat, Màn hình CRISPR độ phân giải cao tiết lộ
các gen thể dục và khả năng mắc bệnh ung thư đặc trưng theo kiểu gen, Tế bào 163
(2015) 1515–1526, http : //dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.11.015.
[55] AJ Aguirre, RM Meyers, BA Weir, F. Vazquez, C.-Z. Zhang, U. Ben-David, A. Cook, G.
Ha, WF Harrington, MB Doshi, M. Kost-Alimova, S. Gill, H. Xu, LD Ali, G. Jiang, S.
Pantel, Y. Lee , A. Goodale, AD Cherniack, C. Oh, G. Kryukov, GS Cowley, LA Garraway,
K. Stegmaier, CW Roberts, TR Golub, M. Meyerson, DE Root, A. Tsherniak, WC Hahn, số bản
sao bộ gen chỉ ra phản ứng của tế bào phụ thuộc vào gen đối với việc nhắm mục tiêu
CRISPR/Cas9, Cancer Discov. 6 (2016) 914–929, http://dx.doi.org/
10.1158/2159-8290.CD-16-0154.
[56] RM Meyers, JG Bryan, JM McFarland, BA Weir, AE Sizemore, H. Xu,
NV Dharia, PG Montgomery, GS Cowley, S. Pantel, A. Goodale, Y. Lee, LD Ali, G. Jiang,
R. Lubonja, WF Harrington, M. Strickland, T. Wu, DC Hawes, VA Zhivich, MR Wyatt,
Z. Kalani, JJ Chang, M. Okamoto, K. Stegmaier, TR Golub, JS Boehm, F. Vazquez, DE
Root, WC Hahn, A. Tsherniak, Hiệu chỉnh tính toán hiệu ứng số bản sao cải thiện
tính đặc hiệu của CRISPR-Cas9 sàng lọc tế bào ung thư, Nat. Genet. 49 (2017) 1779–1784,
http://dx.doi.org/10.1038/ng.3984 .
[57] K. Tzelepis, H. Koike-Yusa, E. De Braekeleer, Y. Li, E. Metzakopian, OM Dovey, A. Mupo,
V. Grinkevich, M. Li, M. Mazan, M. Gozdecka, S . Ohnishi, J. Cooper, M. Patel, T.
McKerrell, B. Chen, AF Domingues, P. Gallipoli, S. Teichmann, H. Ponstingl, U.
McDermott, J. Saez-Rodriguez, BJP Huntly, F. Iorio , C. Pina, GS Vassiliou, K. Yusa,
Màn hình loại bỏ CRISPR xác định các lỗ hổng di truyền và mục tiêu điều trị trong bệnh
bạch cầu dòng tủy cấp tính, Đại diện Tế bào 17 (2016) 1193–1205, http://
dx.doi.org/10.1016/ j.celrep.2016.09.079.
[58] B. Rauscher, F. Heigwer, L. Henkel, T. Hielscher, O. Voloshanenko, M. Boutros, Hướng
tới một bản đồ tích hợp về tương tác di truyền trong tế bào ung thư, Mol. Hệ thống.
Biol. 14 (2018) e7656, http://dx.doi.org/10.15252/msb.20177656.
[59] J. Shi, E. Wang, JP Milazzo, Z. Wang, JB Kinney, CR Vakoc, Khám phá các mục tiêu
thuốc điều trị ung thư bằng cách sàng lọc các miền protein CRISPR-Cas9, Nat.
Công nghệ sinh học. 33 (2015) 661–667, http://dx.doi.org/10.1038/nbt.3235.
[60] MA Erb, TG Scott, BE Li, H. Xie, J. Paulk, H.-S. Seo, A. Souza, JM Roberts, S. Dastjerdi,
DL Buckley, NE Sanjana, O. Shalem, B. Nabet, R. Zeid, NK Offei-Addo, S. Dhe-Paganon, F.
Zhang, SH Orkin, GE Mùa đông, JE Bradner,
117
Hội thảo về Sinh học Ung thư 55 (2019) 106–119
Kiểm soát phiên mã bằng miền ENL YEATS trong bệnh bạch cầu cấp tính, Nature 543 (2017)
270–274, http://dx.doi.org/10.1038/nature21688.
[61] T. Zhan, M. Boutros, Hướng tới một bản tóm tắt các gen thiết yếu - từ các sinh vật mô
hình đến khả năng gây chết tổng hợp trong tế bào ung thư, Crit. Mục sư Hóa sinh. Mol.
Biol. (2015) 1–12, http://dx.doi.org/10.3109/10409238.2015.1117053.
[62] M. Robson, S.-A. Im, E. Senkus, B. Xu, SM Domchek, N. Masuda, S. Delaloge,
W. Li, N. Tung, A. Armstrong, W. Wu, C. Goessl, S. Runswick, P. Conte, Olaparib điều
trị ung thư vú di căn ở bệnh nhân có đột biến BRCA dòng mầm, N. Engl. J.
Med. 377 (2017) 523–533, http://dx.doi.org/10.1056/NEJMoa1706450.
[63] Z. Steinhart, Z. Pavlovic, M. Chandrashekhar, T. Hart, X. Wang, X. Zhang,
M. Robitaille, KR Brown, S. Jaksani, R. Overmeer, SF Boj, J. Adams, J. Pan, H.
Clevers, S. Sidhu, J. Moffat, S. Angers, màn hình CRISPR trên toàn bộ bộ gen tiết lộ
một Wnt Mạch tín hiệu -FZD5 là một lỗ hổng có thể bị đánh cắp của các khối u đột
biến RNF43, Nat. Med. 23 (2017) 60–68, http://dx.doi.org/10.1038/nm.4219.
[64] T. Wang, H. Yu, NW Hughes, B. Liu, A. Kendirli, K. Klein, WW Chen,
ES Lander, DM Sabatini, Hồ sơ thiết yếu về gen cho thấy mạng lưới gen và các tương tác
gây chết tổng hợp với ras gây ung thư, Tế bào. 168 (2017) 890–903, http://dx.doi.org/
10.1016/j.cell.2017.01.013 e15 .
[65] O. Shalem, NE Sanjana, F. Zhang, Bộ gen chức năng thông lượng cao sử dụng CRISPR-Cas9,
Nat. Linh mục Genet. 16 (2015) 299–311, http://dx.doi.org/10.1038/ nrg3899.
[66] S. Ruiz, C. Thị trưởng-Ruiz, V. Lafarga, M. Murga, M. Vega-Sendino, S. Ortega,
O. Fernandez-Capetillo, Màn hình CRISPR trên toàn bộ gen xác định CDC25A là yếu tố
quyết định độ nhạy cảm với các chất ức chế ATR, Mol. Tế bào. 62 (2016) 307–313, http://
dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.03.006 .
[67] EB Krall, B. Wang, DM Munoz, N. Ilic, S. Raghavan, MJ Niederst, K. Yu, DA Ruddy, AJ
Aguirre, JW Kim, AJ Redig, JF Gainor, JA Williams, JM Asara, JG Doench, PA Janne,
AT Shaw, RE McDonald, JA Engelman, F. Stegmeier, MR Schlabach, WC Hahn, KEAP1 mất điều
chỉnh độ nhạy cảm với liệu pháp nhắm mục tiêu kinase trong ung thư phổi, Elife. 6
(2017), http://dx.doi.org/10. 7554/eLife.18970.
[68] S. Gayle, S. Landrette, N. Beeharry, C. Conrad, M. Hernandez, P. Beckett,
SM Ferguson, T. Mandelkern, M. Zheng, T. Xu, J. Rothberg, H. Lichenstein, Xác định
apilimod là chất ức chế PIKfyve kinase hạng nhất để điều trị ung thư hạch không Hodgkin
tế bào B, Máu 129 ( 2017) 1768–1778, http://dx.doi. org/10.1182/blood-2016-09-736892.
[69] K. Han, EE Jeng, GT Hess, DW Morgens, A. Li, MC Bassik, Sự kết hợp thuốc hiệp đồng điều
trị bệnh ung thư được xác định trong màn hình CRISPR cho các tương tác di truyền theo
cặp, Nat. Công nghệ sinh học. 35 (2017) 463–474, http://dx.doi.org/10.1038/nbt. 3834.
[70] JP Shen, D. Zhao, R. Sasik, J. Luebeck, A. Birmingham, A. Bojorquez-Gomez,
K. Licon, K. Klepper, D. Pekin, AN Beckett, KS Sanchez, A. Thomas, C.-C. Kuo, D. Du, A.
Roguev, NE Lewis, AN Chang, JF Kreisberg, N. Krogan, L. Qi, T. Ideker, P. Mali,
Combinatorial CRISPR-Cas9 sàng lọc để lập bản đồ tương tác di truyền de novo, Nat.
Phương pháp 14 (2017) 573–576, http://dx.doi.org/10. 1038/nmeth.4225.
[71] DA Jaitin, A. Weiner, I. Yofe, D. Lara-Astiaso, H. Keren-Shaul, E. David,
TM Salame, A. Tanay, A. van Oudenaarden, I. Amit, Phân tích các mạch miễn dịch bằng
cách liên kết màn hình CRISPR-Pooled với RNA-Seq đơn bào, Tế bào 167 (2016) 1883–
1896, http://dx.doi . org/10.1016/j.cell.2016.11.039 e15.
[72] A. Dixit, O. Parnas, B. Li, J. Chen, CP Fulco, L. Jerby-Arnon, ND Marjanovic, D. Dionne,
T. Burks, R. Raychowdhury, B. Adamson, TM Norman, ES Lander, JS Weissman, N. Friedman,
A. Regev, Perturb-Seq: mổ xẻ các mạch phân tử bằng hồ sơ RNA đơn bào có thể mở rộng của
các màn hình di truyền gộp, Tế bào 167 (2016) 1853–1866, http://dx.doi . org/10.1016/
j.cell.2016.11.038 e17.
[73] B. Adamson, TM Norman, M. Jost, MY Cho, JK Nuñez, Y. Chen, JE Villalta, LA Gilbert, MA
Horlbeck, MY Hein, RA Pak, AN Gray, CA Gross, A. Dixit, O Parnas, A. Regev, JS Weissman,
Nền tảng sàng lọc CRISPR đơn bào đa kênh cho phép phân tích một cách có hệ thống phản
ứng protein chưa được mở ra, Tế bào 167 (2016) 1867–1882, http://dx.doi.org/10.1016/j .
cell.2016.11.048 e21.
[74] P. Datlinger, AF Rendeiro, C. Schmidl, T. Krausgruber, P. Traxler,
J. Klughammer, LC Schuster, A. Kuchler, D. Alpar, C. Bock, Sàng lọc CRISPR gộp với
khả năng đọc bảng điểm đơn ô, Nat. Phương pháp 14 (2017) 297–301, http://
dx.doi.org/10.1038/nmeth.4177.
[75] M. Huarte, Vai trò mới nổi của lncRNA trong bệnh ung thư, Nat. Med. 21 (2015)
1253–1261, http://dx.doi.org/10.1038/nm.3981.
[76] NE Sanjana, J. Wright, K. Zheng, O. Shalem, P. Fontanillas, J. Joung, C. Cheng, A. Regev,
F. Zhang, Thẩm vấn độ phân giải cao của các yếu tố chức năng trong bộ gen không mã
hóa, Khoa học 353 (2016) 1545–1549, http://dx.doi.org/10.1126/science.aaf7613 .
[77] G. Korkmaz, R. Lopes, AP Ugalde, E. Nevedomskaya, R. Han, K. Myacheva,
W. Zwart, R. Elkon, R. Agami, Sàng lọc di truyền chức năng để tìm các yếu tố tăng cường
trong bộ gen người bằng CRISPR-Cas9, Nat. Công nghệ sinh học. 34 (2016) 192–198,
http://dx.doi.org/10.1038/nbt.3450.
[78] S. Zhu, W. Li, J. Liu, C.-H. Chen, Q. Liao, P. Xu, H. Xu, T. Xiao, Z. Cao, J. Peng, P.
Yuan, M. Brown, XS Liu, W. Wei, sàng lọc việc xóa quy mô bộ gen của con người dài không
-mã hóa RNA bằng thư viện RNA CRISPR–Cas9 hướng dẫn ghép đôi, Nat.
Công nghệ sinh học. 34 (2016) 1279–1286, http://dx.doi.org/10.1038/nbt.3715.
[79] SJ Liu, MA Horlbeck, SW Cho, HS Birk, M. Malatesta, D. He, FJ Attenello, JE Villalta, MY
Cho, Y. Chen, MA Mandegar, MP Olvera, LA Gilbert, BR Conklin, HY Chang , JS
Weissman, DA Lim, Nhận dạng quy mô bộ gen dựa trên CRISPRi của các locus RNA không mã
hóa dài chức năng trong tế bào người, Science 355 (2017), http://dx.doi.org/10.1126/
science.aah7111 eaah7111.
[80] X. Yan, Z. Hu, Y. Feng, X. Hu, J. Yuan, SD Zhao, Y. Zhang, L. Yang, W. Shan, Q. He, L.
Fan, LE Kandalaft, JL Tanyi, C. Li, C.-X. Yuan, D. Zhang, H. Yuan, K. Hua, Y. Lu, D.
Katsaros, Q. Huang, K. Montone, Y. Fan, G. Coukos, J. Boyd,
Machine Translated by Google
T. Zhan và cộng sự.
AK Sood, T. Rebbeck, GB Mills, CV Dang, L. Zhang, Đặc tính bộ gen toàn diện của các RNA
không mã hóa dài trên các bệnh ung thư ở người, Tế bào ung thư 28 (2015) 529–540, http://
dx.doi.org/ 10.1016/j.ccell.2015.09.006.
[81] J. Joung, JM Engreitz, S. Konermann, OO Abudayyeh, VK Verdine, F. Aguet, JS Gootenberg, NE
Sanjana, JB Wright, CP Fulco, Y.-Y. Tseng, CH Yoon, JS Boehm, ES Lander, F. Zhang, Màn
hình kích hoạt quy mô bộ gen xác định một locus lncRNA điều chỉnh vùng lân cận gen,
Nature 548 (2017) 343–346, http://dx.doi.org/10.1038/ thiên nhiên23451.
[82] A. Goyal, K. Myacheva, M. Groß, M. Klingenberg, B. Duran Arqué, S. Diederichs, Những thách
thức của ứng dụng CRISPR/Cas9 đối với các gen RNA không mã hóa dài, Axit Nucleic Res. 45
(2016), http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkw883 gkw883.
[83] H. Clevers, Mô hình hóa sự phát triển và bệnh tật bằng các chất hữu cơ, Ô 165 (2016) 1586–
1597, http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.05.082.
[84] G. Schwank, BK Koo, V. Sasselli, JF Dekkers, I. Heo, T. Demircan, N. Sasaki, S. Boymans, E.
Cuppen, CK Van Der Ent, EES Nieuwenhuis, JM Beekman, H. Clevers, Sửa chữa chức năng CFTR
bằng CRISPR/Cas9 trong các or-ganoid tế bào gốc ruột của bệnh nhân xơ nang, Tế bào gốc tế
bào 13 (2013) 653–658, http://dx. doi.org/10.1016/j.stem.2013.11.002.
[85] J. Drost, RH van Jaarsveld, B. Ponsioen, C. Zimberlin, R. van Boxtel, A. Buijs, N. Sachs,
RM Overmeer, GJ Offerhaus, H. Begthel, J. Korving, M. van de Wetering, G. Schwank, M.
Logtenberg, E. Cuppen, HJ Snippert, JP Medema, GJPL Kops, H. Clevers, Đột biến ung thư
tuần tự ở tế bào gốc trong tinh hoàn của con người được nuôi cấy, Nature 521 (2015) 43–
47, http : //dx.doi.org/10.1038/ Nature14415.
[86] M. Matano, S. Date, M. Shimokawa, A. Takano, M. Fujii, Y. Ohta, T. Watanabe, T. Kanai, T.
Sato, Lập mô hình ung thư đại trực tràng bằng cách sử dụng vi trung gian CRISPR-Cas9 quá
trình sản xuất các chất hữu cơ trong ruột người, Nat. Med. 21 (2015) 256–262, http://dx.
doi.org/10.1038/nm.3802.
[87] J. Drost, Sử dụng các chất hữu cơ tế bào gốc của con người được biến đổi CRISPR để nghiên cứu nguồn gốc
dấu hiệu đột biến trong bệnh ung thư, Khoa học (2017) 3130.
[88] L. Tao, J. Zhang, P. Meraner, A. Tovaglieri, X. Wu, R. Gerhard, X. Zhang,
WB Stallcup, J. Miao, X. He, JG Hurdle, DT Breault, AL Brass, M. Dong, Frizzled protein
là các thụ thể biểu mô đại tràng đối với độc tố C. difficile B, Nature (2016), http://
dx.doi . org/10.1038/nature19799.
[89] E. Driehuis, H. Clevers, chỉnh sửa bộ gen CRISPR/Cas 9 và các ứng dụng của nó trong or-
ganoids, Am. J. Physiol. Tiêu hóa. Sinh lý gan. (2017), http://dx.doi.org/10. 1152/
ajpgi.00410.2016.
[90] W. Xue, S. Chen, H. Yin, T. Tammela, T. Papagiannakopoulos, NS Joshi, W. Cai, G. Yang, R.
Bronson, DG Crowley, F. Zhang, DG Anderson, PA Sharp , T. Jacks, đột biến trực tiếp qua
trung gian CRISPR của gen ung thư ở gan chuột, Nature 514 (2014) 380–384, http://dx.doi.org/
10.1038/nature13589.
[91] R. Maresch, S. Mueller, C. Veltkamp, R. Öllinger, M. Friedrich, I. Heid, K. Steiger, J. Weber,
T. Engleitner, M. Barenboim, S. Klein, S. Louzada , R. Banerjee, A. Strong, T. Stauber, N.
Gross, U. Geumann, S. Lange, M. Ringelhan, I. Varela, K. Unger, F. Yang, RM Schmid, GS
Vassiliou, R. Braren , G. Schneider, M. Heikenwalder, A. Bradley, D. Saur, R. Rad, Kỹ thuật
bộ gen tuyến tụy đa kênh và gây ra ung thư bằng cách cung cấp CRISPR/Cas9 dựa trên
truyền máu ở chuột, Nat.
Cộng đồng. 7 (2016) 10770, http://dx.doi.org/10.1038/ncomms10770.
[92] M. Zuckermann, V. Hovestadt, CB Knobbe-Thomsen, M. Zapatka, PA Northcott, K. Schramm, J.
Belic, DTW Jones, B. Tschida, B. Moriarity, D. Largaespada, MF Roussel, A Korshunov, G.
Reifenberger, SM Pfister, P. Lichter, D. Kawauchi, J. Gronych, Sự gián đoạn ức chế khối u
qua trung gian CRISPR/Cas9 của Somatic cho phép mô hình hóa khối u não linh hoạt, Nat. Cộng
đồng. 6 (2015) 7391, http://dx.doi. org/10.1038/ncomms8391.
[93] J. Luo, Y. Luo, J. Sun, Y. Chu, Y. Zhang, X. Yang, Liệu pháp gen ung thư qua trung gian
virus liên quan đến Adeno: hiện trạng, Cancer Lett. 356 (2015) 347–356, http://dx.doi.org/
10.1016/j.canlet.2014.10.045 .
[94] C. Zincarelli, S. Soltys, G. Rengo, JE Rabinowitz, Phân tích các kiểu huyết thanh AAV 1–9
biểu hiện gen qua trung gian và tính ái tính ở chuột sau khi tiêm toàn thân, Mol. Đó. 16
(2008) 1073–1080, http://dx.doi.org/10.1038/mt.2008.76.
[95] E. Senís, C. Fatouros, S. Große, E. Wiedtke, D. Niopek, AK Mueller, K. Börner, D. Grimm, kỹ
thuật gen qua trung gian CRISPR/Cas9: một loại virus liên quan đến adeno (AAV) hộp công cụ
vector, Công nghệ sinh học. J. 9 (2014) 1402–1412, http://dx.doi.org/10. 1002/biot.201400046.
[96] W. Yu, S. Mookherjee, V. Chaitankar, S. Hiriyanna, JW Kim, M. Brooks,
Y. Ataeijannati, X. Sun, L. Dong, T. Li, A. Swaroop, Z. Wu, Nrl bị hạ gục bởi CRISPR/Cas9
do AAV cung cấp ngăn ngừa thoái hóa võng mạc ở chuột, Nat. Cộng đồng. 8 (2017) 14716,
http://dx.doi.org/10.1038/ncomms14716.
[97] S. Yang, R. Chang, H. Yang, T. Zhao, Y. Hong, HE Kong, X. Sun, Z. Qin, P. Jin, S. Li, X.-J.
Li, Chỉnh sửa gen qua trung gian CRISPR/Cas9 cải thiện tình trạng nhiễm độc thần kinh trên
mô hình chuột mắc bệnh Huntington, J. Clin. Đầu tư. 127 (2017) 2719–2724, http://
dx.doi.org/10.1172/JCI92087.
[98] Y. Yang, L. Wang, P. Bell, D. McMenamin, Z. He, J. White, H. Yu, C. Xu,
H. Morizono, K. Musunuru, ML Batshaw, JM Wilson, Hệ thống AAV kép cho phép điều chỉnh bệnh
gan chuyển hóa qua trung gian Cas9 ở chuột sơ sinh, Nat.
Công nghệ sinh học. 34 (2016) 334–338, http://dx.doi.org/10.1038/nbt.3469.
[99] NE Bengtsson, JK Hall, GL Odom, MP Phelps, CR Andrus, RD Hawkins,
SD Hauschka, JR Chamberlain, JS Chamberlain, Chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 dành riêng cho cơ bắp
cải thiện sinh lý bệnh ở mô hình chuột mắc chứng loạn dưỡng cơ Duchenne, Nat. Cộng
đồng. 8 (2017) 14454, http://dx.doi.org/ 10.1038/ncomms14454.
[100] M. Tabebordbar, K. Zhu, JKW Cheng, WL Chew, JJ Widrick, WX Yan,
C. Maesner, EY Wu, R. Xiao, FA Ran, L. Cong, F. Zhang, LH Vandenberghe, GM Church, AJ
Wagers, Chỉnh sửa gen in vivo ở cơ chuột loạn dưỡng và tế bào gốc cơ, Khoa học 351 (2016)
407 –411, http://dx.doi.org/10.1126/science.aad5177 .
118
Hội thảo về Sinh học Ung thư 55 (2019) 106–119
[101] WL Chew, M. Tabebordbar, JKW Cheng, P. Mali, EY Wu, AHM Ng, K. Zhu, AJ Wagers, GM Church, AAV-
CRISPR-Cas9 đa chức năng và máy chủ của nó phản hồi lại, Nat. Phương pháp 13 (2016) 868–
874, http://dx.doi.org/10.1038/nmeth. 3993.
[102] W. Mehnert, K. Mäder, Hạt nano lipid rắn: sản xuất, mô tả đặc tính và ứng dụng, Adv. Thuốc
cung cấp. Rev. 64 (2012) 83–101, http://dx.doi.org/10.1016/ J.ADDR.2012.09.021.
[103] N. Pardi, MJ Hogan, RS Pelc, H. Muramatsu, H. Andersen, CR DeMaso,
KA Dowd, LL Sutherland, RM Scearce, R. Parks, W. Wagner, A. Granados, J. Greenhouse, M.
Walker, E. Willis, J.-S. Yu, CE McGee, GD Sempowski, BL Mũi, YK Tâm, Y.-J. Huang, D.
Vanlandingham, VM Holmes, H. Balachandran, S. Sahu, M. Lifton, S. Higgs, SE
Hensley, TD Madden, MJ Hope, K. Karikó, S. Santra, BS Graham, MG Lewis, TC Pierson ,
BF Haynes, D. Weissman, Bảo vệ vi-rút Zika bằng một loại vắc-xin mRNA biến đổi
nucleoside liều thấp duy nhất, Nature 543 (2017) 248–251, http://dx.doi.org/10. 1038/thiên
nhiên21428.
[104] JD Finn, AR Smith, MC Patel, L. Shaw, MR Youniss, J. van Heteren,
T. Dirstine, C. Ciullo, R. Lescarbeau, J. Seitzer, RR Shah, A. Shah, D. Ling, J.
Growe, M. Pink, E. Rohde, KM Wood, WE Salomon, WF Harrington, C. Dombrowski, WR
Strapps, Y. Chang, DV Morrissey, Chỉ một lần sử dụng các hạt nano lipid CRISPR/Cas9 đã đạt
được hiệu quả chỉnh sửa bộ gen in vivo mạnh mẽ và bền bỉ, Cell Rep. 22 (2018) 2227–2235,
http://dx.doi.org /10.1016/j.celrep.2018. 02.014.
[105] C. Jiang, M. Mei, B. Li, X. Zhu, W. Zu, Y. Tian, Q. Wang, Y. Guo, Y. Dong, X. Tan, A CRISPR/
Cas9 không vi-rút hệ thống phân phối để nhắm đích điều trị HBV DNA vàpcsk9 in vivo, Cell
Res. 27 (2017) 440–443, http://dx.doi.org/10.1038/cr.
2017.16.
[106] JB Miller, S. Zhang, P. Kos, H. Xiong, K. Zhou, SS Perelman, H. Zhu,
DJ Siegwart, Chỉnh sửa gen CRISPR/Cas không vi rút trong ống nghiệm và in vivo được kích
hoạt bằng cách đồng phân phối hạt nano tổng hợp của Cas9 mRNA và sgRNA, Angew. Chem. Int.
Ed. 56 (2017) 1059–1063, http://dx.doi.org/10.1002/anie.201610209.
[107] K. Lee, M. Conboy, HM Park, F. Jiang, HJ Kim, MA Dewitt, VA Mackley, K. Chang, A. Rao, C.
Skinner, T. Shobha, M. Mehdipour, H. Liu , WC Huang, F. Lan, NL Bray, S. Li, JE Corn,
K. Kataoka, JA Doudna, I. Conboy, N. Murthy, Phân phối hạt nano của Cas9 ribonucleoprotein
và DNA của người hiến in vivo tạo ra sự sửa chữa DNA theo hướng tương đồng, Nat. Sinh học.
Anh. 1 (2017) 889–901, http://dx. doi.org/10.1038/s41551-017-0137-2.
[108] P. Barata, AK Sood, DS Hong, Liệu pháp nhắm mục tiêu RNA trong lâm sàng ung thư
thử nghiệm: hiện trạng và hướng đi trong tương lai, Điều trị ung thư. Bản sửa đổi 50 (2016)
35–47, http://dx.doi.org/10.1016/j.ctrv.2016.08.004.
[109] S. Chen, NE Sanjana, K. Zheng, O. Shalem, K. Lee, X. Shi, DA Scott, J. Song,
JQ Pan, R. Weissleder, H. Lee, F. Zhang, PA Sharp, Màn hình CRISPR toàn bộ bộ gen trong mô
hình chuột phát triển khối u và di căn, Ô 160 (2015) 1246–1260, http://dx.doi . org/10.1016/
j.cell.2015.02.038.
[110] CQ Song, Y. Li, H. Mou, J. Moore, A. Park, Y. Pomyen, S. Hough, Z. Kennedy,
A. Fischer, H. Yin, DG Anderson, D. Conte, L. Zender, XW Wang, S.
Thorgeirsson, Z. Weng, W. Xue, Màn hình CRISPR trên toàn bộ gen xác định các chất điều
hòa protein kinase được hoạt hóa bằng mitogen là thuốc ức chế khối u gan ở chuột,
Gastroenterology 152 (2017) 1161–1173, http://dx.doi.org/10.1053/j.gastro. 2016.12.002
e1.
[111] J. Roper, T. Tammela, NM Cetinbas, A. Akkad, A. Roghanian, S. Rickelt,
M. Almeqdadi, K. Wu, MA Oberli, F. Sánchez-Rivera, YK Park, X. Liang, G. Eng, MS Taylor, R.
Azimi, D. Kedrin, R. Neupane, S. Beyaz, ET Sicinska, Y. Suarez, J. Yoo, L. Chen, L.
Zukerberg, P. Katajisto, V. Deshpande, AJ Bass, PN Tsichlis, J. Lees, R. Langer, RO Hynes,
J. Chen, A. Bhutkar, T .Jacks, Ö.H. Yilmaz, Các mô hình chỉnh sửa bộ gen và cấy ghép cơ quan
in vivo của bệnh ung thư đại trực tràng và di căn, Nat. Công nghệ sinh học. 35 (2017)
569–576, http://dx.doi.org/10.1038/nbt. 3836.
[112] J. Weber, R. Öllinger, M. Friedrich, U. Ehmer, M. Barenboim, K. Steiger, I. Heid, S. Mueller,
R. Maresch, T. Engleitner, N. Gross, U. Geumann , B. Fu, A. Segler, D. Yuan, S. Lange,
A. Strong, J. de la Rosa, I. Esposito, P. Liu, J. Cadiñanos, GS Vassiliou, RM Schmid,
G. Schneider, K Unger, F. Yang, R. Braren, M. Heikenwälder, I. Varela, D. Saur,
A. Bradley, R. Rad, CRISPR/Cas9 gây đột biến đa bội soma cho genom ung thư chức năng thông
lượng cao ở chuột, Proc. Natl. Học viện. Khoa học. 112 (2015) 13982–13987, http://dx.doi.org/
10.1073/pnas. 1512392112.
[113] RJ Platt, S. Chen, Y. Chu, MJ Yim, L. Swiech, HR Kempton, JE Dahlman, O. Parnas, TM
Eisenhaure, M. Jovanovic, DB Graham, S. Jhunjhunwala, M. Heidenreich, RJ Xavier, R.
Langer, DG Anderson, N. Hacohen, A. Regev, G. Feng, PA Sharp, F. Zhang, CRISPR-Cas9 đánh
chuột để chỉnh sửa bộ gen và lập mô hình ung thư, Ô 159 (2014) 440–455, http ://dx.doi.org/
10.1016/j.cell. 2014.09.014.
[114] RD Chow, CD Guzman, G. Wang, F. Schmidt, MW Youngblood, L. Ye,
Y. Errami, MB Dong, MA Martinez, S. Zhang, P. Renauer, K. Bilguvar, M. Gunel, PA Sharp, F.
Zhang, RJ Platt, S. Chen, màn hình CRISPR in vivo trực tiếp qua trung gian AAV xác định
chức năng thuốc ức chế trong u nguyên bào thần kinh đệm, Nat. Khoa học thần kinh. 20 (2017)
1329–1341, http://dx.doi.org/10.1038/nn.4620.
[115] T. Wirth, N. Parker, S. Ylä-Herttuala, Lịch sử liệu pháp gen, Gene 525 (2013) 162–169, http://
dx.doi.org/10.1016/j.gene.2013.03.137 .
[116] T. Hirsch, T. Rothoeft, N. Teig, JW Bauer, G. Pellegrini, L. De Rosa, D. Scaglione, J.
Reichelt, A. Klausegger, D. Kneisz, O. Romano, A. Secone Seconetti, R. Contin, E. Enzo, I.
Jurman, S. Carulli, F. Jacobsen, T. Luecke, M. Lehnhardt, M. Fischer, M. Kueckelhaus, D.
Quaglino, M. Morgante, S. Bicciato, S. Bondanza, M. De Luca, Tái tạo toàn bộ lớp biểu bì của
con người bằng tế bào gốc chuyển gen, Nature 551 (2017) 327–332, http://dx.doi.org/10.1038/
nature24487.
[117] JR Mendell, S. Al-Zaidy, R. Shell, WD Arnold, LR Rodino-Klapac, TW Trước,
Machine Translated by Google
T. Zhan và cộng sự.
L. Lowes, L. Alfano, K. Berry, K. Church, JT Kissel, S. Nagendran, J. L'Italien, DM
Sproule, C. Wells, JA Cardenas, MD Heitzer, A. Kaspar, S. Corcoran, L. Braun, S.
Likhite, C. Miranda, K. Meyer, KD Foust, AHM Burghes, BK Kaspar, Liệu pháp thay
thế gen một liều cho bệnh teo cơ cột sống, N.
Tiếng Anh. J. Med. 377 (2017) 1713–1722, http://dx.doi.org/10.1056/
NEJMoa1706198 .
[118] S. Rangarajan, L. Walsh, W. Lester, D. Perry, B. Madan, M. Laffan, H. Yu,
C. Vettermann, GF Pierce, WY Wong, KJ Pasi, AAV5–Factor VIII chuyển gen trong bệnh máu
khó đông nặng A, N. Engl. J. Med. 377 (2017) 2519–2530, http://dx.doi. org/10.1056/
NEJMoa1708483.
[119] S. Russell, J. Bennett, JA Wellman, DC Chung, Z.-F. Yu, A. Tillman, J. Wittes, J. Pappas,
O. Elci, S. McCague, D. Cross, KA Marshall, J. Walshire, TL Kehoe, H. Reichert, M. Davis,
L. Raffini, LA George , FP Hudson, L. Dingfield, X. Zhu, JA Haller, EH Sohn, VB Mahajan,
W. Pfeifer, M. Weckmann, C. Johnson, D. Gewaily, A. Drack, E. Stone, K. Wachtel, F
Simonelli, BP Leroy, JF Wright, KA High, AM Maguire, Hiệu quả và độ an toàn của voretigene
neparvovec (AAV2- hRPE65v2) ở bệnh nhân mắc chứng loạn dưỡng võng mạc di truyền qua
trung gian RPE65: thử nghiệm ngẫu nhiên, có kiểm soát, nhãn mở, giai đoạn 3 , Lancet
390 (2017) 849–860, http:// dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(17)31868-8.
[120] P. Tebas, D. Stein, WW Tang, I. Frank, SQ Wang, G. Lee, SK Spratt,
RT Surosky, MA Giedlin, G. Nichol, MC Holmes, PD Gregory, DG Ando, M. Kalos, RG
Collman, G. Binder-Scholl, G. Plesa, W.-T. Hwang, BL Levine, CH June, Chỉnh sửa gen
CCR5 trong tế bào T CD4 tự trị của người nhiễm HIV, N. Engl. J. Med. 370 (2014) 901–910,
http://dx.doi.org/10.1056/NEJMoa1300662 .
[121] TI Cornu, C. Mussolino, T. Cathomen, Tinh chỉnh các chiến lược để dịch chỉnh sửa bộ gen
sang phòng khám, Nat. Med. 23 (2017) 415–423, http://dx.doi.org/10.1038/
nm.4313.
[122] D. Cyranoski, lần đầu tiên thử nghiệm chỉnh sửa gen CRISPR ở người, Nature 539 (2016) 479,
http://dx.doi.org/10.1038/nature.2016.20988.
[123] Y. Iwai, M. Ishida, Y. Tanaka, T. Okazaki, T. Honjo, N. Minato, Sự tham gia của PD-L1 lên
các tế bào khối u trong việc thoát khỏi hệ thống miễn dịch của vật chủ và liệu
pháp miễn dịch khối u bằng PD- Phong tỏa L1, Proc. Natl. Học viện. Khoa học. 99 (2002)
12293–12297, http://dx.doi.org/10.1073/pnas.192461099.
[124] M. Reck, D. Rodríguez-Abreu, AG Robinson, R. Hui, T. Csőszi, A. Fülöp, M. Gottfried,
N. Peled, A. Tafreshi, S. Cuffe, M. O'Brien, S. Rao, K. Hotta, MA Leiby, GM
Lubiniecki, Y. Shentu, R. Rangwala, JR Brahmer, Pembrolizumab so với hóa
trị liệu cho phổi không phải tế bào nhỏ dương tính với PD-L1
119
Hội thảo về Sinh học Ung thư 55 (2019) 106–119
ung thư, N. Engl. J. Med. 375 (2016) 1823–1833, http://dx.doi.org/10.1056/
NEJMoa1606774 .
[125] J. Eyquem, J. Mansilla-Soto, T. Giavridis, SJC van der Stegen, M. Hamieh,
KM Cunanan, A. Odak, M. Gönen, M. Sadelain, Nhắm mục tiêu CAR đến locus TRAC bằng
CRISPR/Cas9 giúp tăng cường khả năng đào thải khối u, Nature 543 (2017) 113–117, http://
dx.doi.org/10.1038 /thiên nhiên21405.
[126] F. Heigwer, G. Kerr, M. Boutros, E-CRISP: xác định trang web mục tiêu CRISPR nhanh, Nat.
Phương pháp 11 (2014) 122–123, http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.2812.
[127] PD Hsu, DA Scott, JA Weinstein, FA Ran, S. Konermann, V. Agarwala, Y. Li, EJ Fine, X. Wu,
O. Shalem, TJ Cradick, LA Marraffini, G. Bao, F. Zhang, Tính đặc hiệu nhắm mục tiêu DNA
của các hạt nhân Cas9 được hướng dẫn bởi RNA, Nat. Công nghệ sinh học. 31 (2013) 827–
832, http://dx.doi.org/10.1038/nbt.2647.
[128] K. Labun, TG Montague, JA Gagnon, SB Thyme, E. Valen, CHOPCHOP v2: một công cụ web dành
cho thế hệ tiếp theo của kỹ thuật gen CRISPR, Nucleic Acids Res. 44 (2016) W272–W276,
http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkw398.
[129] CR MacPherson, A. Scherf, Thiết kế RNA hướng dẫn linh hoạt cho các ứng dụng CRISPR sử
dụng bàn làm việc protospacer, Nat. Công nghệ sinh học. 33 (2015) 805–806, http://dx.doi.
org/10.1038/nbt.3291.
[130] MA Moreno-Mateos, CE Vejnar, J.-D. Beaudoin, JP Fernandez, EK Mis,
MK Khokha, AJ Giraldez, CRISPRscan: thiết kế sgRNA hiệu quả cao để nhắm mục tiêu CRISPR-
Cas9 in vivo, Nat. Phương pháp 12 (2015) 982–988, http://dx.doi. org/10.1038/nmeth.3543.
[131] R. Chari, P. Mali, M. Moosburner, GM Church, Làm sáng tỏ các thông số kỹ thuật bộ gen
CRISPR-Cas9 thông qua phương pháp tiếp cận thư viện trên thư viện, Nat. Phương pháp 12
(2015) 823–826, http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.3473.
[132] J. Winter, M. Breinig, F. Heigwer, D. Brügemann, S. Leible, O. Pelz, T. Zhan, M.
Boutros, caRpools: gói R để phân tích dữ liệu thăm dò và lập tài liệu về gộp Màn
hình CRISPR/Cas9, Tin sinh học 32 (2016) 632–634, http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/
btv617.
[133] W. Li, J. Köster, H. Xu, C.-H. Chen, T. Xiao, JS Liu, M. Brown, XS Liu, Kiểm soát chất
lượng, lập mô hình và trực quan hóa màn hình CRISPR với MAGECK-VISPR, Genome Biol. 16
(2015) 281, http://dx.doi.org/10.1186/s13059-015-0843-6.
[134] J. Yu, J. Silva, A. Califano, ScreenBEAM: một thuật toán phân tích tổng hợp mới cho
sàng lọc bộ gen chức năng thông qua mô hình phân cấp Bayesian, Tin sinh học 32 (2016)
260–267, http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/btv556.
[135] J. Winter, M. Schwering, O. Pelz, B. Rauscher, T. Zhan, F. Heigwer, M. Boutros,
CRISPRAnalyzeR: Phân tích tương tác, chú thích và tài liệu về các màn hình CRISPR gộp,
bioRxiv (2017) 109967, http://dx.doi.org/10.1101/109967.