Machine Translated by Google

Xúc tác sinh học và Công nghệ sinh học nông nghiệp 21 (2019) 101339

Danh sách nội dung có sẵn tại ScienceDirect

Xúc tác sinh học và Công nghệ sinh học nông nghiệp

trang chủ tạp chí: http://www.elsevier.com/locate/bab

Một hợp chất giàu chất chống oxy hóa mới 2-hydoxy 4-methylbenzaldehyde từ
Decalepis arayalpathra gây ra quá trình tự hủy trong tế bào ung thư vú

a,*,1 b c c
Ramar Thangam , Sivaraman Gokul , Malairaj Sathuvan , Veeraperumal Suresh ,
Srinivasan Sivasubramanian a,**

một

Viện Y học Dự phòng & Nghiên cứu King, Chennai, Tamilnadu, Ấn Độ

b
Trường Bảo tồn Tài nguyên Thiên nhiên, Kho lưu trữ Tài nguyên Thuốc, Đại học Liên ngành (TDU-FRLHT), Bangalore, Karnataka, Ấn Độ
c
Trung tâm Nghiên cứu Cao cấp về Thực vật học, Đại học Madras, Chennai, Tamilnadu, Ấn Độ

THÔNG TIN BÀI VIẾT TRỪU TƯỢNG

từ khóa: Decalepis arayalpathra là một loại cây thuốc đặc hữu và có nguy cơ tuyệt chủng, chủ yếu được sử dụng vì các đặc tính y
Decalepis arayalpathra học thơm và dân tộc của nó. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã báo cáo tiềm năng y sinh của 2-hydoxy 4-methylbenzaldehyde
2-Hydroxy 4-metylbenzaldehyd
(2H4MB) từ D. arayalpathra. Hợp chất 2H4MB được phân lập từ vỏ rễ tươi của cây bằng phương pháp chiết xuất hơi nước-chưng
gây độc tế bào 1
cất thủy điện và được định lượng bằng phân tích HPLC, thu được 6,5 ± 0,8 μg g hợp chất tinh khiết. Hơn nữa, tác dụng chống
chống oxy hóa
oxy hóa và chống ung thư trong ống nghiệm đã được nghiên cứu chi tiết bằng cách sử dụng các tế bào MDA-MB 231 bằng các xét
Bắt giữ chu kỳ tế bào
nghiệm dựa trên tế bào. 2H4MB đã được quan sát để hiển thị các tính năng như tạo ra các loại oxy phản ứng (ROS), cải thiện
Apoptosis phụ thuộc vào ROS
khả năng gây độc tế bào, mất khả năng màng ty thể (Δψm) và phân mảnh DNA hạt nhân, quá trình chết theo chương trình của tế
bào và ngừng chu kỳ tế bào. Hơn nữa, khả dụng sinh học của 2H4MB có thể tạo điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng nó như
một tác nhân điều trị ung thư tiềm năng.

1. Giới thiệu trường hợp mỗi năm (Ferlay và cộng sự, 2015; Miller và cộng sự, 2016). Trên toàn

cầu, ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất xảy ra ở phụ nữ và nó được báo cáo

Decalepis arayalpathra là một chi đơn loài thuộc họ Peri placaceae, dạng lá, là nguyên nhân gây tử vong thứ hai. Hormone steroid estrogen, chủ yếu là estradiol

sống lâu năm dưới tán cây bụi, được tìm thấy trong các nhóm nhỏ. Chúng là loài đặc đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sinh ung thư vú (Ferlay và cộng sự,

hữu của một số đoạn rừng ở các quận Tirunelveli, Kanyakumari và Thiruvananthapuram 2015; Miller và cộng sự, 2016). Ung thư vú bộ ba âm tính (TNBC) là nhóm ung thư

của Tamil Nadu và Kerala (Gangaprasad et al., 2005). Các bộ phận của cây chủ yếu không đồng nhất, vẫn là một thách thức điều trị đáng kể trong trường hợp không có

được sử dụng như một phương thuốc hữu hiệu để chữa các bệnh viêm loét dạ dày, ung các liệu pháp nhắm mục tiêu xác định. Các phương pháp điều trị thông thường như

thư và làm thuốc bổ để lấy lại sức lực và sức chịu đựng đã mất; rễ cây có nhiều hóa trị, xạ trị và phẫu thuật đã được ghi nhận rõ ràng về những hạn chế, biến

đặc tính trị liệu (Gangaprasad và cộng sự, 2005; Nair và cộng sự, 2014). Vì loài chứng và tác dụng phụ, đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải phát triển các tác nhân

thực vật này đã được coi là một loài có nguy cơ tuyệt chủng, nên cần phải khẩn cấp chống ung thư đầy hứa hẹn thông qua các con đường tổng hợp hoặc tự nhiên với các

bảo tồn và nhân giống loài này dưới tán cây bụi trên quy mô lớn do tiềm năng dân cơ chế chống ung thư riêng biệt. Các lựa chọn hóa trị liệu để điều trị TNBC bị hạn

tộc học và tính khả dụng sinh học của các thành phần thực vật. Trong những năm gần chế do tính không đặc hiệu, kháng thuốc và sinh khả dụng thấp hơn. Một ứng cử viên

đây, các sản phẩm tự nhiên và các phân tử hoạt tính sinh học thực phẩm có nguồn thuốc chống ung thư đầy hứa hẹn được đặc trưng để gây ra stress oxy hóa trong khối

gốc từ cây thuốc được sử dụng rộng rãi để điều trị nhiều triệu chứng và bệnh tật u hoặc môi trường tế bào dẫn đến tổn thương tế bào thông qua tổn thương DNA đáng

(Lin et al., 2008). kể (McLean et al., 2008). Người ta cũng báo cáo rằng việc hấp thụ các phân tử hoạt

tính sinh học thông qua việc tiêu thụ các chất thực phẩm dựa trên thực vật hoặc

Ung thư là căn bệnh gây tử vong đứng hàng thứ ba trên toàn thế giới, chiếm hấp thu các chất tự nhiên hoặc tổng hợp

khoảng 6 triệu ca tử vong với 16 triệu ca mới

* Đồng tác giả.

** Đồng tác giả.
Địa chỉ email: thangam1985@yahoo.co.in (R. Thangam), siva77subramanian@gmail.com (S. Sivasubramanian).
1
Địa chỉ hiện tại: Viện Hình ảnh Phân tử & Trị liệu, Khoa Y học Hạt nhân, Trường Y khoa Đại học Quốc gia Chonnam, Hwasun
Bệnh viện, Hàn Quốc.

https://doi.org/10.1016/j.bcab.2019.101339 Nhận
ngày 24 tháng 7 năm 2019; Nhận được ở dạng sửa đổi ngày 7 tháng 9 năm 2019; Được chấp nhận ngày 8 tháng 9
năm 2019 Có sẵn trực tuyến ngày 9 tháng 9 năm 2019 1878-8181/© 2019 Elsevier Ltd. Bảo lưu mọi quyền.
Machine Translated by Google

R. Thangam et al. Xúc tác sinh học và Công nghệ sinh học nông nghiệp 21 (2019) 101339

2. Phần thí nghiệm

2.1. Nguyên liệu thực vật

Khoảng 4 kg rễ tươi của D. arayalpathra được thu hoạch từ những cây được
trồng trong điều kiện tự nhiên gần như mô phỏng của Vườn thuốc Ethno (EMG),
FRLHT, Bangalore, Ấn Độ. Barium của các loài thực vật đã chuẩn bị của cô ấy
đã được gửi tại FRLH Herbarium, Bangalore để tham khảo trong tương lai.

2.2. Chiết xuất 2H4MB từ D. arayalpathra

Chiết xuất 2H4MB được thực hiện bằng quy trình chưng cất hơi nước như đã
mô tả trước đây (Nagarajan và Jagan Mohan Rao, 2003). Tóm lại, rễ tươi của
D. arayalpathra (~4 kg) được thu thập từ Vườn thuốc dân tộc và được làm sạch
thủ công bằng nước máy chảy. Vỏ rễ thịt được tách ra khỏi lõi cứng bên trong
và tiếp tục cắt thành từng miếng nhỏ. Những miếng vỏ nhỏ có thịt được ngâm
ngay vào nước để tránh làm thất thoát các chất thơm dễ bay hơi. Sau đó, ~1,5
kg vỏ cây trong 4,5 L nước được đưa vào quy trình chưng cất hơi nước trong
khoảng 5 giờ. Các chất bay hơi sinh ra cùng với hơi nước ngưng tụ được thu
gom và chiết xuất bằng cách sử dụng diclometan (500 mL x 3). Dịch chiết kết
hợp được làm khô thêm trên natri sulfat khan. Dung môi được chưng cất trên
nồi cách thủy <50 �C và phần còn lại được làm khô trong bình hút ẩm sử dụng
P2O5 và sáp parafin để thu được dầu dễ bay hơi. Chất này được kết tinh từ ete
dầu hỏa (60–80 �C) và được định lượng bằng HPLC (Hình 1).

Hình 1. Các bước phân lập hợp chất giàu chất thơm 2-hydroxy 4-metyl benzaldehyd
(2H4MB) từ rễ cây Decalepis arayalpathra. 2.3. Định lượng 2H4MB

các dẫn xuất của các phân tử hoạt tính sinh học như vậy có thể tạo ra các loại oxy phản
Định lượng hợp chất 2H4MB từ dịch chiết kết tinh của

ứng (ROS) trong các tế bào khối u dẫn đến quá trình chết theo chương trình (Trachootham

et al., 2009; Liou và Storz, 2010). Bảng 1

Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi cố gắng nghiên cứu sự tích lũy ROS Hợp chất cô lập 2H4MB trong quá trình tạo gốc tự do được đánh giá
bằng hoạt tính chống oxy hóa.
và tổn thương DNA tiếp theo cũng như tác dụng chống tăng sinh, chết theo
1
chương trình và gây độc tế bào trong các tế bào ung thư vú MDA-MB-231 được hoạt động chống oxy hóa IC50 (mg mL )

điều trị bằng hợp chất 2H4MB có nguồn gốc từ vỏ rễ D. arayalpathra . Ngoài ĐPPH 0,5 0,04

ra, tính an toàn của hợp chất được thiết lập trong nghiên cứu này vì nó không hydroxyl 1,9 � 0,09
2,1 �
gây ra bất kỳ thay đổi bệnh lý nào trong các tế bào khỏe mạnh bình thường superoxit
Oxit nitric 0,1 0,53 � 0,03
(đối chứng), cho thấy tiềm năng dinh dưỡng của hợp chất nghiên cứu.

Hình 2. Sắc ký đồ HPLC pha đảo thể hiện độ phân giải 2H4MB, được tinh chế từ rễ của D. arayalpathra, với nhận dạng cực đại (được phát hiện ở bước sóng 220 nm) so với chuẩn
(hình bên trong).

2
Machine Translated by Google

R. Thangam et al. Xúc tác sinh học và Công nghệ sinh học nông nghiệp 21 (2019) 101339

Hình 3. (A, B) Tác dụng gây độc tế bào của 2H4MB trong tế bào bình thường ở người (HaCat) và tế bào ung thư vú di căn (MDA-MB-231) trong 24 giờ và 48 giờ ủ (A và B). Các
1
tế bào này được xử lý bằng một loạt pha loãng (10–100 μg mL ) hợp chất 2H4MB
24 và đã
48 phân
giờ bằng
lập để
xétnghiên
nghiệmcứu
MTT.
khảHợp
năng
chất
gâyđược
độc phân
tế bào
lậpphụ
ức thuộc
chế hiệu
vào quả
liềukhả
trong
năngkhoảng
sống sót
thờicủa
gian
tế
1 1
bào MDA-MB-231 ở nồng độ IC50 là 70 μg mL và 50 μg mL trong 24 và 48 giờ tương ứng; nó cho thấy ít gây độc tế bào hơn trong các tế bào HaCat (90 μg mL
thời
và gian
70 μg
ủ mL
24 )
vàgiờ.
trong
48
1 1
Thử nghiệm này được thực hiện ba lần, có nghĩa là � SD. * p � 0,05 đáng kể, so
điển
vớihình
kiểmtrong
soát các
tế bào.
bào
tế bào
HaCat
(C)MDA
Các
vàMB-231
hình
MDA-MB-231
ảnh
ở nồng
hiển
được
độ
viIC50
xử
cho
lýcủa
thấy
2H4MB
chúng.
các
hiển
đặc
Phân
thị
điểm
tích
hình
apoptotic
hình
thái ảnh
tế hình
bào
củabình
thái
các
thường trong nhóm đối chứng (không được xử lý) trong khi các tế bào ung thư được xử lý cho thấy sự co rút về hình thái tế bào, màng tế bào chảy máu và cấu trúc tế bào
hình echinoid ở các nồng độ khác nhau.

D. arayalpathra được ước tính bằng phương pháp HPLC pha ngược như đã mô tả trước đây nhặt rác được tính bằng công thức dưới đây:

(Sircar et al., 2007). Nồng độ của 2H4MB được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng
1 Abs: mẫu Abs: trống
cao (HPLC) sau khi pha loãng thích hợp với pha động, hỗn hợp đẳng tích gồm dung dịch nhặt rác ð%Þ ¼ � 100
abs:kiểm soát
nước 1 mM TFA và metanol, theo tỷ lệ 70:30 (v/v). Hệ thống HPLC được trang bị Máy bơm

Waters HPLC 525, máy dò Waters 2998 Photodiode Array và bộ tiêm thủ công Rheodyne Axit L-ascorbic được sử dụng làm đối chứng dương tính.

7725i. Quá trình phân tách sắc ký được thực hiện trên Cột phân tích Symmetry C-18

(250 mm – 4,6 mm, 5 μm) với phân tử stan dard thích hợp, ở mỗi mức nồng độ và hợp 2.4.2. Xét nghiệm loại bỏ gốc oxit nitric Khả năng

chất phân lập được so sánh với chất chuẩn để xác nhận độ tinh khiết. loại bỏ oxit nitric (NO) của hợp chất tinh khiết (2H4MB) được xác định theo báo

cáo trước đó (Tsai et al., 2007). Tóm lại, 60 μL các nồng độ khác nhau của hợp chất

pha loãng hàng loạt được hút vào một đĩa 96 giếng. Sau đó, 60 μL natri nitroprusside

10 mM được hòa tan trong PBS và đĩa được ủ dưới ánh sáng ở nhiệt độ phòng trong 150

phút. Sau khi ủ, một lượng thuốc thử Griess tương đương được thêm vào để định lượng

hàm lượng nitrit. Khả năng loại bỏ NO của 2H4MB được biểu thị bằng IC50, biểu thị
2.4. xét nghiệm chống oxy hóa
nồng độ của hợp chất cần thiết để dập tắt 50% gốc NO do natri nitroprusside giải

phóng. Ở đây, axit L-ascorbic được sử dụng làm đối chứng.

2.4.1. Xét nghiệm nhặt gốc tự do

Hoạt tính chống oxy hóa của 2H4MB tinh khiết được đánh giá bằng cách sử dụng

DPPH, như được mô tả bởi Lim et al. (2007). Hợp chất tinh khiết đã được thêm vào với

PBS và 180 μL dung dịch DPPH. Sau 30 phút. của quá trình ủ, độ hấp thụ được đo ở bước

sóng 492 nm sử dụng đầu đọc đĩa nhiều giếng (Thermo Multiskan, Waltham, MA). Khả năng

của gốc tự do

3
Machine Translated by Google
R. Thangam et al.
Hình 4. Đánh giá 2H4MB đối với tổn thương màng tế bào bằng cách đo sự giải phóng LDH
24 và 48 giờ ở các nồng độ khác nhau. (A) Dòng tế bào của nhóm Kiểm soát Tích cực
(HaCat) cho thấy mức độ tổn thương màng ít hơn bằng chứng là sự giải phóng LDH thấp
hơn trong khi mức độ LDH cao hơn đáng kể trong nhóm tế bào ung thư (MDA-MB-231) (B).
Nghiên cứu chỉ ra mức độ tổn thương màng tối thiểu trong các tế bào bình thường khi so
sánh với các tế bào ung thư vú. Các kết quả được biểu thị bằng Mean � SD của các giá
trị ba lần.
Hình 5. Hình ảnh hiển vi huỳnh quang nhuộm acridine cam/ethidium bromide của các tế bào MDA-MB-231 được xử lý 2H4MB cho thấy quá trình gây chết tế bào theo chương trình ở nồng độ
IC50 . Các ô khả thi đang hoạt động (màu xanh lá cây), ô chết (màu đỏ) và ô apoptotic (màu cam; như được biểu thị bằng mũi tên) được hiển thị. Các thí nghiệm đã được thực hiện
trong ba lần giữ các ô chưa được xử lý làm nhóm kiểm soát. (Để giải thích các tham chiếu đến màu sắc trong chú thích hình này, người đọc được tham khảo phiên bản Web của bài viết này.)
4
Xúc tác sinh học và Công nghệ sinh học nông nghiệp 21 (2019) 101339
1 Abs: mẫu Abs: trống
nhặt rác ð%Þ ¼ � 100
abs: kiểm soát
2.4.3. Thử nghiệm hoạt động thu hồi gốc hydroxyl Khả năng
thu hồi gốc hydroxyl của hợp chất tinh khiết (2H4MB) đã được nghiên cứu theo phương
pháp được báo cáo bởi Costa et al.
(2010). Các gốc hydroxyl được tạo ra bằng cách sử dụng 3 mL dung dịch đệm natri
photphat (150 mM, pH 7,4) chứa 10 mM FeSO4 7H2O, EDTA 10 mM, natri salicylat 2 mM,
H2O2 30% (200 mL) và các nồng độ hợp chất khác nhau. Trong kiểm soát, dung dịch đệm
natri photphat đã được thay thế bằng H2O2. Các dung dịch này sau đó được ủ ở 37 °C
trong 1 giờ và sự có mặt của gốc hydroxyl được phát hiện bằng cách đo OD ở bước sóng
510 nm. Catechin đã được sử dụng như kiểm soát tích cực.
1 Abs: mẫu Abs: trống
nhặt rác ð%Þ ¼ � 100
abs:kiểm soát
2.4.4. Thử nghiệm nhặt gốc tự do superoxide Thử
nghiệm này được tiến hành để đánh giá khả năng 2H4MB ức chế quá trình khử quang
hóa của nitroblue tetrazolium (NBT) trong hệ thống riboflavin light-NBT, theo sau một
báo cáo trước đây của Costa et al.
(2010). Mỗi 3 mL hỗn hợp phản ứng (13 mM methionine, 2 mM riboflavin, 100 mM EDTA, 75
mM NBT) được chuẩn bị có chứa 50 mM PBS (pH 7,8) và 1 mL dung dịch mẫu. Do sự hình
thành các tinh thể formazan, có sự gia tăng độ hấp thụ ở bước sóng 560 nm.
Axit L-ascorbic được sử dụng làm đối chứng dương tính.
1 Abs: mẫu Abs: trống
nhặt rác ð%Þ ¼ � 100
abs:kiểm soát
2.5. xét nghiệm chống ung thư
2.5.1. Xét nghiệm khả năng
sống của tế bào Các tế bào MDA-MB-231 (ung thư vú bộ ba âm tính di căn) và tế bào
HaCat (tế bào sừng) được nuôi cấy trong DMEM và được bổ sung 10% huyết thanh bào thai
1
bò, 100 IU/mL penicillin và 100 μg mL streptomycin, và duy trì ở nhiệt độ 37 �C với
5% CO2. Khả năng tồn tại của tế bào của hợp chất 2H4MB đã được nghiên cứu bằng cách sử
dụng xét nghiệm khả năng tồn tại của tế bào MTT (Mosmann, 1983). Tóm lại, các tế bào
MDA-MB-231 và HaCat được nuôi cấy và gieo hạt ở mật độ 1 – 104 tế bào/mL trong các đĩa
nuôi cấy mô 96 giếng trong 48 giờ để đạt được 70–80% hợp lưu. Sau khi xử lý bằng 2H4MB
(2-hyroxy 5-metylbenzaldehye) (pha loãng 10–100 μg mL ), các đĩa này được ủ ba lần trong
1
24 và 48 giờ. Một nhóm không được điều trị đã được sử dụng làm đối chứng âm tính và
dòng tế bào bình thường đã được sử dụng
Machine Translated by Google

R. Thangam et al. Xúc tác sinh học và Công nghệ sinh học nông nghiệp 21 (2019) 101339

Hình 6. 2H4MB tạo điều kiện tạo ra ROS nội bào và rối loạn chức năng ty thể trong các tế bào MDA-MB-231 trong quá trình điều trị với nồng độ phụ thuộc liều trong 24
và 48 giờ. (A) 2H4MB không có bất kỳ ảnh hưởng đáng kể nào đối với các tế bào bình thường (HaCat) bằng chứng là không có sản xuất ROS khi xử lý các tế bào. (B) Các
tế bào MDA-MB-231 được ủ với hợp chất trong 24 và 48 giờ cho thấy thế hệ ROS khi so sánh với các tế bào bình thường và hợp chất chưa được xử lý như được hiển thị bằng
hình ảnh huỳnh quang của các tế bào nhuộm DCFH DA.

Hình 7. Phân tích sự mất điện thế màng ty thể và sự phân mảnh nhân bằng kính hiển vi huỳnh quang thông qua việc xử lý tế bào HaCat (A) và tế bào MDA-MB 231 (B) bằng
hợp chất 2H4MB ở nồng độ IC50 phụ thuộc liều trong 24 và 48 giờ ủ. Các bảng hình ảnh cho thấy cho thấy sự mất điện thế màng sụn mito thông qua nhuộm Rhodamine 123
(màu xanh lá cây) (được biểu thị bằng mũi tên) và sự phân mảnh hạt nhân bằng cách nhuộm DAPI. (Để giải thích các tham chiếu đến màu sắc trong chú thích hình này,
người đọc được tham khảo phiên bản Web của bài viết này.)

như kiểm soát tích cực. Hơn nữa, các tế bào đã xử lý trong mỗi giếng được bổ sung 100 2.5.2. Xét nghiệm
1
μL dung dịch MTT (5 mg mL ), và ủ thêm 4 giờ ở 37 °C
giảm
trong
MTT.tủCác
ấm tinh
5% CO2
thểđểformazan
cho phép LDH Xét nghiệm Lactate Dehydrogenase (LDH) được sử dụng để phân tích phiên bản

được hình thành bởi các tế bào đã được hòa tan bằng cách sử dụng 100 μL DMSO và mật con của lactate thành pyruvate với sự có mặt của LDH với sự giảm NADþ song song trong

độ quang học (OD) được đo bằng đầu đọc tấm chuẩn độ vi mô ở bước sóng 570nm. Tỷ lệ tế quá trình giải phóng LDH từ màng tế bào của tế bào ung thư. Huyền phù tế bào nuôi cấy

bào khả thi được tính như sau: có kích thước 1 – 105 tế bào/mL được cấy vào sáu đĩa giếng và phát triển trong 48 giờ

dưới 5% CO2 ở 37 °C. Sau 48 giờ, các tế bào được xử lý bằng một loạt 10–100 μg mL hợp
1
chất 2H4MB và được ủ trong 24 và 48 giờ để quan sát khả năng gây độc tế bào.
môi trường
Sau đó,
OD của các tế bào được xử lý
Khả năng tồn tại của tế bào ð%Þ ¼ � 100 được thu thập và các tế bào chết trong môi trường được chuyển sang các ống ly tâm
OD của ô điều khiển
mới. Đối với dịch nổi và huyền phù tế bào

5
Machine Translated by Google

R. Thangam et al. Xúc tác sinh học và Công nghệ sinh học nông nghiệp 21 (2019) 101339

45 phút ở 100 V trên gel agarose 2% và được hiển thị trong Hệ thống Gel-Doc
(Trình xem ảnh Alpha Innotech, phiên bản 6.0.0, Nhật Bản).

2.5.6. Phân tích ngưng tụ hạt nhân bằng nhuộm DAPI

Các tế bào MDA-MB-231 và HaCat (~2 ± 105 tế bào/giếng) được nuôi cấy trong

sáu đĩa giếng và được xử lý với nồng độ IC50 phụ thuộc vào liều của chúng là

2H4MB trong 24 và 48 giờ, bao gồm cả nhóm đối chứng thích hợp (không xử lý hợp
chất) . Hơn nữa, các tế bào được rửa ba lần bằng PBS và sau đó bằng hỗn hợp
axit axetic: metanol (25:75) trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Các ô cố định được
nhuộm bằng 2,5 μg mL DAPI trong điều kiện tối. Sau khi nhuộm, các tế bào được
1
rửa bằng metanol và sấy khô. quang.
Các tấm màu được hiển thị dưới kính hiển vi huỳnh

2.5.7. Phát hiện các loại oxy phản ứng và quá trình chết theo chương trình của tế bào

Quá trình tạo ra ROS nội bào từ các tế bào trong quá trình oxy hóa ở cấp độ
Hình 8. Phân tích phân mảnh DNA nhân của các tế bào HaCat và MDA-MB-231 được
nội bào được phân tích bằng 20,70 -dichlor odihydrofluorescein di-acetate nhạy
xử lý 2H4MB ở nồng độ IC50 trong 24, 48 và 72 giờ ủ cho thấy mô hình thang
cảm với ROS bằng kính hiển vi huỳnh quang. Một ngày trước khi xử lý tế bào, tế
DNA của các tế bào biểu thị sự xuất hiện của sự kiện apoptotic.
bào ung thư và tế bào bình thường đã chọn được cấy vào các đĩa 6 giếng với mật

độ 2 – 105 tế bào/giếng. Trước khi xử lý, các tế bào kết dính được rửa bằng PBS
và nhuộm bằng thuốc nhuộm 50 μM pha loãng trong metanol. Sau đó, các tế bào này
của mỗi nhóm), các hóa chất khử LDH được thêm vào và ủ ở 37 °C trong 15 phút.
được ủ ở 37 °C trong 30 phút để cho phép kết hợp và kích hoạt DCF-DA, tiếp theo
Tổn thương màng tế bào được phân tích bằng các phép đo rò rỉ LDH từ các tế bào
là loại bỏ thuốc nhuộm tự do bằng cách rửa bằng metanol. Những tấm nhuộm màu
chết, điều này cũng cho biết tỷ lệ phần trăm độc tính tế bào trong các tế bào
này đã được phân tích về cường độ huỳnh quang (485/530nm) bằng Trạm hình ảnh tế
được xử lý bằng hợp chất. OD của dung dịch formazan được đo trên đầu đọc vi bản
bào Floid, Life Technologies.
ở bước sóng 570 nm sau khi hòa tan với DMSO. Tác dụng gây độc tế bào của các
giếng được xử lý bằng hợp chất đã được nghiên cứu về sự giải phóng LDH cùng với
sự kiểm soát không được xử lý.
2.5.8. Phân tích tế bào học dòng chảy

Việc đo hàm lượng DNA của tế bào trong các giai đoạn chu kỳ tế bào khác
2.5.3. Phân tích kính hiển vi huỳnh quang để cảm ứng apoptosis
nhau được thực hiện bằng phương pháp tế bào học dòng chảy. Tóm lại, các tế bào
Để đánh giá mức độ cảm ứng chết theo chương trình trong các tế bào MDA-
MDA-MB 231 (1 � 106 ) được cấy vào đĩa nuôi cấy và được gắn trong 24 giờ. Sau
MB-231 và HaCat, các tế bào này được cấy vào các phiến kính 13 mm, được đặt
đó, các tế bào được xử lý với nồng độ IC50 là 2H4MB trong 16, 24 và 48 giờ ủ.
trong các đĩa 6 giếng (Coster, Hoa Kỳ) với mật độ 1,5 ± 105 tế bào/giếng và phát
Hơn nữa, các tế bào đã xử lý được thu hoạch bằng cách trypsin hóa và tạo viên ở
triển trong 48 giờ. Các tế bào được xử lý thêm với nồng độ IC50 phụ thuộc vào
tốc độ 2500 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Các tế bào được tái huyền
liều lượng của nó . Các tế bào được rửa bằng PBS và nhuộm màu bằng cách sử dụng
phù trong 300 μL PBS–EDTA, trong đó 700 μL etanol 70% đã được làm lạnh được
hỗn hợp acridine cam và ethidium bromide (AO/EB) có nồng độ bằng nhau là 20–50
thêm từng giọt một cách khôn ngoan bằng cách trộn chậm.
μL. Các tế bào nhuộm màu ngay lập tức được hiển thị dưới kính hiển vi huỳnh
Dung dịch được thêm nhẹ nhàng để đảm bảo trộn đều etanol và các mẫu được bảo
quang với bộ lọc kích thích ở bước sóng 480nm để phát hiện các tế bào sống (màu
quản ở 0 °C qua đêm. Sau đó, các thể tích 1:100 của 20 mg mL RNase được thêm
xanh lá cây), tế bào chết theo chương trình (màu cam) và tế bào hoại tử (màu 1
vào hỗn hợp tế bào và hỗn hợp này iodide
được ủ mới
ở 37chuẩn
°C trong
bị (50
1 giờ.
μg mlPro
) đã
1 pidium
được thêm
đỏ) khi xử lý bằng 2H4MB.
vào nồng độ cuối cùng và nó được ủ trong 10–20 phút. Các tế bào đã nhuộm màu
được phân tích DNA togram của anh ấy và phân tích
phân bố pha chu kỳ tế bào được
(Hệ
thực
thống
hiện
tếbằng
bào học
phương
miễn
pháp
dịch
tếBecton
bào học
Dickinson)
dòng chảy
2.5.4. Phân tích mất điện thế màng ty thể (ΔΨm)
Các tế bào MDA-MB-231 và HaCat được nuôi cấy trong các đĩa sáu giếng (2 ±

105 tế bào/giếng) và cho phép đạt được 60–70% hợp lưu trong một ngày trước khi
xử lý với nồng độ IC50 phụ thuộc vào liều là 2H4MB.
(Thangam và cộng sự, 2012).
Sau các khoảng thời gian nhất định (24 và 48 giờ), các tế bào được xử lý đã
được cố định bằng cách sử dụng kết hợp axit Acetic: Methanol (1:3), rửa thêm
2.6. Phân tích thống kê
hai lần bằng PBS và tiếp xúc với thuốc nhuộm Rhodamine 123 (Rh-123) đặc hiệu
1
Δψm (10 μg mL nhuộm
) trong
màu20được
phútrửa
ở nhiệt
bằng metanol
độ môi trường
tuyệt đối,
trongsau
bóng
đó tối.
làm bay
Các hơi
tế bào
và
Tất cả dữ liệu được thể hiện dưới dạng trung bình � SD của ba thí nghiệm
phân tích sự thay đổi của màng ty thể bằng kính hiển vi huỳnh quang với bước
độc lập. Các giá trị IC50 được tính toán với sự trợ giúp của phần mềm Graph-Pad
sóng kích thích và phát xạ lần lượt là 505nm và 534nm.
Prism Phiên bản 5.0 (Graph-Pad Software, Inc., USA). * p � 0,05 giá trị được

coi là có ý nghĩa thống kê.

3. Kết quả và thảo luận

2.5.5. Phân tích sự phân mảnh tổn thương DNA hạt nhân
Sự tổn thương DNA hạt nhân được phân tích bằng xét nghiệm phân mảnh DNA bộ
3.1. Phân tích định lượng và định tính
gen, trong đó các tế bào được xử lý với nồng độ phụ thuộc vào liều lượng là
2H4MB trong 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Các tế bào đã xử lý được bổ sung 10 mL
Hợp chất nghiên cứu 2H4MB, được chiết xuất và tinh chế từ rễ cây Decalepis
dung dịch chứa 10 mM Tris HCl, 10 mM EDTA (pH 8,0) và 20 mg mL proteinase K để
1 arayalpathra, là một aldehyde thơm và có cấu trúc tương tự như vanillin, là một
phân lập DNA bị phân mảnh. Các hỗn hợp
xuấtđược
DNA ủbằng
ở 37dung
°C trong 3 giờ, sau
dịch phenol: đó chiết
chloroform:
chất tạo hương vị quan trọng trong thực phẩm trong công nghiệp. Nghiên cứu này
isoamyl alcohol (25:24:1).
cho thấy tầm quan trọng vì 2H4MB có thể được sử dụng làm chất thay thế tiềm

Sau đó, DNA chiết xuất được xử lý bằng RNase tự do DNase năng cho vanillin. Do đó, nghiên cứu tập trung vào việc tinh chế 2H4MB bằng
1 phân tích HPLC pha đảo ngược (Hình 2) cũng như đánh giá hợp chất này về các đặc
cô đặc 20 mg mL ở 4 °C trong 45 phút và kết tủa với 100 mL natri axetat 2,5 M
tính chống ung thư thông qua việc gây ra quá trình chết theo chương trình cụ
và 3 thể tích etanol. Sau đó, phân tích phân mảnh DNA được thực hiện bằng cách
thể trong các tế bào ung thư. Kết quả phân tích hóa học thực vật của chúng tôi
sử dụng điện di cho cho thấy 1 rằng vỏ rễ
thịt chứa 6,5 – 0,8 μg g 2H4MB và

6
Machine Translated by Google

R. Thangam et al. Xúc tác sinh học và Công nghệ sinh học nông nghiệp 21 (2019) 101339

Hình 9. Phân tích chu kỳ tế bào bằng phương pháp tế bào học dòng chảy. Dân số chu kỳ tế bào (%) của các tế bào ung thư được điều trị chống lại 2H4MB ở nồng độ IC50 trong các khoảng thời

gian khác nhau (16, 24, 48 giờ) khi được nghiên cứu bằng phương pháp tế bào học dòng chảy với nhóm đối chứng tương ứng. Biểu đồ cho thấy quần thể tế bào trong các giai đoạn khác nhau của

chu kỳ tế bào so với nhóm kiểm soát tế bào (**p � 0,05). Việc bắt giữ chu kỳ tế bào trong pha G0/G1 có liên quan đến sự gia tăng số lượng phân bố tế bào do cảm ứng apoptotic so với nhóm

không được điều trị.

độ tinh khiết thu được là 84,6 ± 6,6 trong chiết xuất kết tinh được đánh giá bằng RP và các tình trạng bệnh lý bao gồm nhiều loại ung thư (Srivas tava và Shivanandappa,

HPLC, và những quan sát này phù hợp với các báo cáo trước đó (Verma et al., 2014). 2009). Trong nghiên cứu hiện tại này, chúng tôi đã chứng minh cả chất chống oxy hóa

và điều hòa các sự kiện chết theo chương trình giúp phân biệt tế bào bình thường và

tế bào ung thư thông qua các nghiên cứu chi tiết về các thử nghiệm thu gom gốc tự do,

độc tính tế bào, cảm ứng chết theo chương trình và phân tích chu kỳ tế bào bằng cách
3.2. hoạt động chống oxy hóa
sử dụng hợp chất 2H4MB được phân lập.

Đặc tính loại bỏ gốc tự do DPPH của hợp chất từ D. arayalpathra được trình bày
Hiển thị tính năng chống oxy hóa là một trong những chiến lược điều trị quan trọng
trong Bảng 1 và cho thấy rằng hợp chất 2H4MB thể hiện tác dụng loại bỏ gốc tự do mạnh
đối với các bệnh khác nhau. Các sản phẩm thực vật có hoạt tính sinh học đang được sử
mẽ với IC50 là 0,5 – 0,04 mg mL . Người ta đã báo cáo rằng khả năng cho hydro hoặc của
dụng như một nguồn mạnh để phát triển các chiến lược điều trị chống oxy hóa do tác 1
các phân tử chống oxy hóa có thể tự
gópdophần
(Chen
vàovàtính
Ho, năng
1995).
chống oxy hóa hoặc nhặt gốc
dụng độc hại và bệnh lý tối thiểu của chúng trái ngược với các loại thuốc tổng hợp

(Singh và Bhat, 2003; Ling và cộng sự, 2013). Bên cạnh đó, các phương pháp trị liệu

mới nổi kết hợp tính năng chống oxy hóa cùng với các chức năng cụ thể khác như điều
Các gốc superoxide, thường được tạo ra trong các quá trình logic sinh lý bình
biến trong các con đường chuyển hóa và tế bào khác nhau bao gồm các tầng tín hiệu,
thường, chủ yếu ở ty thể, bắt đầu quá trình peroxy hóa lipid và tổn thương màng tế bào
điều hòa quá trình chết theo chương trình thông qua các biểu hiện gen thay đổi để phân
(Valko et al., 2007; Sundaresan et al., 1995). Nó là
biệt tế bào bình thường.

7
Machine Translated by Google
R. Thangam et al.
trong nghiên cứu đã chỉ ra rằng 2H4MB ức chế đáng kể gốc superoxide ở IC50 là
1
2,1 – 0,1 mg mL (Bảng 1). Trong các hệtạo
thống
ra bởi
sinhhoạt
học,động
oxitxúc
nitric
tác của
(NO)nitric
được
oxide synthase (NOS) trên L-arginine và NO là một yếu tố thư giãn quan trọng
có nguồn gốc từ nội mô (Tsuchiya et al., 1999). Tuy nhiên, vai trò của NO được
chỉ định trong các tình trạng bệnh lý khác nhau vì nó được biết là gây tổn
thương tế bào và mô ở nồng độ cao (Sueishi et al., 2011). Hợp chất nghiên cứu
2H4MB có khả năng loại bỏ oxit nitric mạnh và tác dụng loại bỏ NO được phát
hiện ở IC50 là 0,53 ÷ 0,03 mg mL . Bên cạnh đó, hợp chất thể hiện khả năng
nhặt gốc tự do hy droxyl đáng kể (Bảng 1) và do đó nó bảo vệ các tế bào khỏi
1
tổn thương DNA do các gốc hydroxyl (Aruoma et al., 1998; Moorhouse et al.,
1985).
3.3. Đánh giá độc tính tế bào
2H4MB đã được phân tích về tác dụng ức chế của nó đối với tế bào ung thư
vú bộ ba âm tính (MDA-MB-231) và tế bào bình thường (HaCat) bằng xét nghiệm
MTT. Các tế bào MDA-MB-231 và HaCat được xử lý bằng 2H4MB trong khoảng 24 giờ
và 48 giờ. Người ta đã quan sát thấy rằng phân tử này ức chế hiệu quả sự tăng
sinh tế bào với khả năng gây độc tế bào mạnh của nó có giá trị IC50 khoảng 70
1 1
μg mL (48 giờ) đối với các tế bào
(24 ung
giờ)thư
và biểu
50 μgmômLvú; tuy
nhận
nhiên,
là ítnóđộc
được
hơnghi
đối
với các tế bào bình thường bằng chứng là các giá trị IC50 của nó là 90 μg mL
1 1
(24 giờ) và 70 μg mL (48 giờ) (Hình 3). Điều quan trọngthấy
là hợp
tác chất
dụng này
chống
cho
tăng sinh yếu hơn ở các tế bào bình thường so với các tế bào ung thư theo kết
quả của xét nghiệm MTT (Hình 3). Những thay đổi về hình thái tế bào cũng được
phân tích bằng các nghiên cứu vi mô sau khi điều trị bằng hợp chất và người
ta thấy rằng các tế bào ung thư đang biểu hiện những thay đổi hình thái
apoptotic đặc trưng như co rút tế bào, phồng màng, v.v. (Hình 3). Người ta
cũng quan sát thấy rằng những thay đổi về đặc điểm hình thái giữa các tế bào
được xử lý hợp chất 2H4MB (MDA-MB-231), tế bào bình thường (HaCat) và tế bào
(đối chứng) không được xử lý (Hình 3) vì chúng nổi bật trong các tế bào ung
thư khi so sánh với tế bào bình thường và các tế bào điều khiển không được
điều trị. Kết quả trong ống nghiệm này ủng hộ việc sử dụng hợp chất 2H4MB này
như một chất dẫn đầu chống ung thư mạnh.
Thử nghiệm LDH để đánh giá tác dụng ức chế phụ thuộc vào liều của hợp chất
nghiên cứu được thực hiện bằng cách xử lý các tế bào trong 24 giờ và 48 giờ
(Hình 4). Kết quả cho thấy sự giải phóng LDH cao hơn trong nhóm tế bào ung thư
vì các tế bào này biểu hiện tổn thương màng tế bào trên diện rộng (Hình 4b).
Cơ chế hoạt động chống ung thư của hợp chất này chưa được nghiên cứu và kết
quả nghiên cứu đã chứng minh đặc tính chống ung thư tiềm năng của 2H4MB thông
qua cả xét nghiệm MTT và LDH (Hình 3 và Hình 4), và nghiên cứu hiện tại đã
tiết lộ các chức năng chống ung thư toàn thân của 2H4MB như một phân tử hoạt
tính sinh học mạnh để ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư vú (Hình 4b).
3.4. Cảm ứng của quá trình chết rụng
Nhuộm kép với ethidium bromide và acridine cam được sử dụng để đánh giá sự
hiện diện của các tế bào khả thi và apoptotic khi xử lý các tế bào bằng 2H4MB.
Các tế bào khả thi xuất hiện với màu xanh lá cây, trong khi các tế bào chết
theo chương trình và các tế bào chết xuất hiện với màu cam và đỏ (Hình 5).
Người ta phát hiện ra rằng hợp chất này làm giảm khả năng tồn tại của các tế
bào MDA MB-231 bằng cách làm hỏng DNA hạt nhân. Sự hiện diện của các tế bào
MDA-MB-231 apoptotic tăng lên trong quá trình điều trị, trong khi tỷ lệ HaCat
apoptotic giảm và các tế bào kiểm soát (không được điều trị) cho thấy tác dụng
apoptotic cụ thể của hợp chất chống lại các tế bào ung thư (Hình 5). Ở nồng
độ IC50 phụ thuộc vào liều lượng , hợp chất này thể hiện các tính năng cảm
ứng quá trình chết theo chương trình trong các tế bào MDA-MB-231, so với các
tế bào đối chứng bình thường (HaCat) và không được xử lý. Các tế bào ung thư
được điều trị đã được chứng minh là có các đặc điểm như bong màng, cơ thể chết
theo chương trình và mức độ ngưng tụ hạt nhân cao (Hình 5), và những quan sát
này phù hợp với các báo cáo trước đây bằng cách sử dụng các hợp chất tự nhiên
và tổng hợp có tác dụng gây ra quá trình chết theo chương trình và ức chế tăng
trưởng tế bào tính năng trong các tế bào ung thư (Surh, 2003). Tuy nhiên, của chúng đặc
tôi điểm apoptotic này.
số 8
Xúc tác sinh học và Công nghệ sinh học nông nghiệp 21 (2019) 101339
hợp chất nghiên cứu 2H4MB thể hiện các tính năng trên ngoài việc gây ra quá
trình chết theo chương trình liên quan đến ROS và các hoạt động chống oxy hóa
nhặt gốc tự do đặc biệt trong các tế bào bình thường (Bảng 1 và Hình 6). Những
kết quả này cho thấy 2H4MB có tác dụng cảm ứng apoptotic chống lại tế bào ung
thư nhưng có tác dụng bảo vệ tế bào khác biệt đối với tế bào bình thường thông
qua tác dụng nhặt gốc tự do.
3.5. Sự hình thành ROS và dấu hiệu của quá trình tự hủy
Được biết, việc sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS) có liên quan đáng kể
đến việc kích hoạt quá trình tự hủy ở tế bào bình thường cũng như tế bào ung
thư bằng cách kích hoạt nhiều con đường chết tế bào (Liou và Storz, 2010).
Sự gợi ra bất thường về nồng độ ROS trong các tế bào ung thư do căng thẳng
oxy hóa có khả năng kích hoạt các tầng tín hiệu apoptotic (Lin và Beal, 2006).
Qua nghiên cứu của chúng tôi, người ta nhận thấy rằng 2H4MB, ở nồng độ IC50 ,
có khả năng tạo ra các mức ROS cao trong các tế bào MDA-MB-231 khi so sánh với
các mức ROS không đáng kể trong các tế bào HaCat bình thường. Trong quá trình
điều trị, mức độ tạo ra ROS nội bào được xác định bởi sự phát huỳnh quang DCFH-
DA của DCF trong các tế bào sống.
1 1
(Hình 6). 2H4MB ở nồng độ 70 μg mL (24 giờ) và 50 μg mL (48 giờ) tạo ra ROS
đủ để gây ra quá trình chết theo chương trình trong các tế bào MDA-MB-231.
Kết quả nghiên cứu này gợi ý rằng khả năng hình thành ROS trong 2H4MB có thể
liên quan đến tiềm năng cảm ứng apoptotic của nó khi nghiên cứu mô tả cả tính
năng tạo ROS và tính năng cảm ứng apoptotic. Các nghiên cứu báo cáo rằng việc
sản xuất quá nhiều ROS trong tế bào dẫn đến căng thẳng oxy hóa gây ra, tổn
thương DNA, lipid và protein và những sự kiện này đang kích hoạt các yếu tố
gây ung thư và tình trạng chết theo chương trình liên quan đến sự điều hòa
của nhiều con đường truyền tín hiệu, chức năng hạt nhân và ty thể (Irani ,
2000; Trachootham và cộng sự, 2009). Nghiên cứu hóa dược với một số hợp chất
có nguồn gốc tổng hợp và tự nhiên như paclitaxel, cisplatin, doxorubicin và
các hợp chất tự nhiên, quercetin, EGCG, curcumin, v.v. đã khám phá tiềm năng
của các hóa chất này đối với các đặc tính chống ung thư bao gồm cả việc kích
hoạt quá trình chết theo chương trình phụ thuộc ROS (Green và Kroemer) ,
2004). (Hình 6). Hiện tượng chống oxy hóa là một đặc điểm cơ bản của các hợp
chất thực phẩm có hoạt tính sinh học, góp phần bảo vệ sức khỏe, bao gồm các
chức năng chống đột biến, chống ung thư và chống lão hóa. Việc nhặt rác ROS
bảo tồn tính ổn định bộ gen của tế bào thông qua việc loại bỏ các chất gây
ung thư và can thiệp vào sự hình thành chất bổ sung DNA (Collins et al., 2005;
Gawlik-Dziki et al., 2012; Liou và Storz, 2010) trong các tế bào bình thường.
Tuy nhiên, ROS cũng liên quan đến quy định sinh lý của các đường truyền tín
hiệu xác định sự tăng sinh và khả năng vận động của tế bào (Liou và Storz,
2010; Zhang và cộng sự, 2008). Các chất hóa học thực vật có thể can thiệp trực
tiếp vào các tầng tín hiệu tế bào liên quan đến việc điều chỉnh quá trình
viêm, tạo mạch và xâm lấn ung thư và tác dụng ức chế hiệp đồng đối với chức
năng của protein kinase (De Raedt và cộng sự, 2011; Zhang và cộng sự, 2008).
3.6. Phá vỡ tính toàn vẹn của màng ty thể trong tế bào ung thư
Vai trò chính của ty thể là quy định về quá trình chết theo chương trình
nội tại (Hengartner, 2000; Kroemer và Reed, 2000; Thornberry, 1998). Bào quan
này đóng vai trò quan trọng trong việc phân chia, tăng sinh, buôn bán, truyền
tín hiệu và di chuyển tế bào ung thư (Brindley, 2004). Độ dốc điện hóa tối ưu
là rất quan trọng để duy trì tiềm năng xuyên màng của ty thể (Δψm) cũng như
quá trình tổng hợp ATP (Pierroz et al., 2012) và việc mất Δψm dẫn đến rối loạn
chức năng của ty thể và gây chết tế bào sau đó. Kết quả nghiên cứu đã chứng
minh rằng 2H4MB có khả năng gây ra rối loạn chức năng sụn mito thông qua sự
mất điện thế màng (Δψm) trong các tế bào ung thư được điều trị (Hình 7). Chúng
tôi nhận thấy rằng 2H4MB thực hiện quá trình khử cực mito chondrial như thể
hiện trong các tế bào nhuộm Rh-123. Chúng tôi cũng nhận thấy rằng sự phân mảnh
DNA và phân mảnh hạt nhân (nhuộm DAPI) trong các tế bào được xử lý bằng hợp
chất dẫn đến việc gây ra quá trình chết theo chương trình của tế bào (Ellis,
2001). Bên cạnh đó, các hình ảnh huỳnh quang (Rh-123-DAPI) tiết lộ rằng có các
đặc điểm như tổ chức bất thường của mạng lưới ty thể cũng như sự phân rã hạt
nhân và phân mảnh trong các tế bào ung thư được điều trị bằng hợp chất và các
Machine Translated by Google
R. Thangam et al.
nổi bật trong các tế bào ung thư được điều trị bằng hợp chất so với kiểm soát tích cực
(HaCat) và các tế bào không được điều trị (Hình 7).
Tác động chống ung thư của hợp chất 2H4MB cũng được quy cho khả năng tạo điều kiện
thuận lợi cho quá trình hoán vị màng ty thể (Chen et al., 2010; Trachootham et al., 2009;
Valko et al., 2006). Những sự kiện này ngoài những phát hiện đã đề cập trước đó như nồng
độ ROS tăng cao gây ra stress oxy hóa (ROS) và tác dụng gây độc tế bào cụ thể đối với tế
bào ung thư chứng minh tiềm năng của hợp chất đóng vai trò là chất chống ung thư để phát
triển hóa trị liệu mới.
3.7. Hình thái hạt nhân thay đổi thông qua kích hoạt apoptosis trong tế bào ung thư
Nhuộm DAPI của các tế bào ung thư được xử lý 2H4MB cho thấy sự ngưng tụ và phân mảnh
hạt nhân (Hình 7 và Hình 8). Những kết quả này về kích hoạt apoptotic có tương quan với các
quan sát khác về thế hệ ROS, mất Δψm và độc tính tế bào trong các tế bào MDA-MB231 so với
các tế bào bình thường. Hình ảnh huỳnh quang của nhuộm DAPI xác nhận sự ngưng tụ hạt nhân
trong các tế bào được xử lý hợp chất so với các tế bào không được xử lý và các tế bào điều
khiển (HaCat). Nhuộm Rh-123 và DCFH-DA của các tế bào thí nghiệm cho thấy những thay đổi về
hình thái do bắt đầu apoptotic qua trung gian ty thể (Hình 6, Hình 7 và Hình 8). Sự phân
mảnh DNA bộ gen là một sự kiện duy nhất cho thấy tình trạng chết theo chương trình (Martín
et al., 2009). Phân tích kháng điện di cho thấy sự phân mảnh DNA rộng rãi và đây là một
tính năng quan trọng của phản ứng tế bào đối với hợp chất 2H4MB đã chọn của chúng tôi (Hình
8). Do đó, người ta đề xuất rằng độc tính tế bào của hợp chất được chọn của chúng tôi được
thể hiện bằng phương pháp gây ra quá trình chết theo chương trình như được tiết lộ bởi
những thay đổi về hình thái (Hình 8) (Morris và Geller, 1996; Zhang và cộng sự, 2008).
3.8. Ảnh hưởng của 2H4MB đối với quy định chu kỳ tế bào
Hơn nữa để phân tích ảnh hưởng của 2H4MB trong việc điều hòa chu kỳ tế bào, các thí
nghiệm tế bào học dòng chảy đã được thực hiện sau khi nhuộm các tế bào bằng propidium
iodide (Hình 9). Việc xử lý các tế bào MDA-MB-231 bằng cách sử dụng nồng độ IC50 là 2H4MB
trong 16, 24, 48 giờ dẫn đến sự giảm số lượng tế bào của các pha G2/M và S so với nhóm đối
chứng; tuy nhiên, người ta đã quan sát thấy rằng có sự gia tăng dân số tế bào trong pha G0/
G1 cho thấy việc bắt giữ chu kỳ tế bào có tác dụng trong các tế bào ung thư. Kết quả thực
nghiệm này chỉ ra rằng hợp chất 2H4MB được phân lập đã trực tiếp gây ra quá trình chết theo
chương trình của tế bào trong các tế bào MDA-MB-231 thông qua quá trình bắt giữ chu kỳ tế
bào ở pha G0/G1 vì phần lớn các tế bào không thể chuyển sang các giai đoạn tiếp theo của
chu kỳ tế bào (Thangam et al., 2012). Nhìn chung, kết quả nghiên cứu của chúng tôi chứng
minh các đặc tính chống ung thư của 2H4MB bằng các tác động cụ thể của tế bào ung thư như
độc tế bào, gây ra quá trình chết theo chương trình do mất tiềm năng màng ty thể cũng như
sự phân mảnh hạt nhân và bắt giữ chu kỳ tế bào và những đặc điểm này của hợp chất dựa trên
thực vật dẫn đầu. cung cấp những hiểu biết đầy hứa hẹn để phát triển nó thành một tác nhân
trị liệu chống ung thư mới để giảm gánh nặng liên quan đến
ung thư.
4. Kết luận
Để kết luận, chúng tôi khẳng định rằng các loại thuốc có nguồn gốc từ thực vật được sử
dụng rộng rãi để điều trị các bệnh khác nhau bao gồm cả ung thư. Những phát hiện trong
nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng hợp chất 2H4MB được phân lập từ D. arayalpathra có
các hoạt tính chống oxy hóa và chống ung thư tiềm năng ngoài việc gây ra quá trình chết
theo chương trình thông qua việc mất điện thế màng ty thể và ngừng chu kỳ tế bào trong các
tế bào ung thư vú (MDA-MB-231) nhưng không có trong tế bào bình thường (HaCat). Kết quả cho
thấy rằng hợp chất 2H4MB có tiềm năng được sử dụng như một chất bổ sung chống oxy hóa tự
nhiên trong chế độ ăn uống. Do đó, nghiên cứu này cung cấp một mối quan tâm mới về việc
phát triển các chiến lược hóa trị liệu chống lại các tế bào ung thư thông qua việc nhắm mục
tiêu các chức năng của ty thể với việc bắt giữ chu kỳ tế bào.
9
Xúc tác sinh học và Công nghệ sinh học nông nghiệp 21 (2019) 101339
Xung đột lợi ích
Không có.
Người giới thiệu
Aruoma, OI, Deiana, M., Jenner, A., Halliwell, B., Kaur, H., Banni, S., Corongiu, FP, Assunta Dessí, M.,
Aeschbach, R., 1998. Đã tìm thấy tác dụng của hydroxytyrosol trong dầu ô liu nguyên chất đối với tổn
thương DNA oxy hóa và quá trình oxy hóa lipoprotein mật độ thấp.
J. Nông nghiệp. Hóa chất thực phẩm https://doi.org/10.1021/jf980649b.
Brindley, DN, 2004. Lipid phosphate phosphatase và các protein liên quan: phát tín hiệu
chức năng trong sự phát triển, phân chia tế bào và ung thư. J. Tế bào. hóa sinh. 92, 900–912. https://
doi.org/10.1002/jcb.20126.
Chen, C.-W., Ho, C.-T., 1995. Đặc tính chống oxy hóa của polyphenol chiết xuất từ trà xanh và trà đen. J.
Lipid thực phẩm. https://doi.org/10.1111/j.1745-4522.1995. tb00028.x.
Chen, Z., Liang, X., Zhang, H., Xie, H., Liu, J., Xu, Y., Zhu, W., Wang, Y., Wang, X.,
Tan, S., Kuang, D., Qian, X., 2010. Một loại chất chống ung thư dựa trên naphthalimide mới có tác dụng
ức chế topoisomerase II và gây ra quá trình hoán vị màng lysosomal và quá trình chết theo chương trình.
J. Med. hóa học. 53, 2589–2600. https://doi.org/10.1021/jm100025u .
Collins, P., Jones, C., Choudhury, S., Damelin, L., Hodgson, H., 2005. Tăng
biểu hiện của protein tách rời 2 trong các tế bào HepG2 làm giảm tổn thương oxy hóa và quá trình chết
theo chương trình. Gan Int. https://doi.org/10.1111/j.1478-3231.2005.01104.x.
Costa, LS, Fidelis, GP, Cordeiro, SL, Oliveira, RM, Sabry, DA, C^ amara, RBG, Nobre, LTDB, Costa, MSSP,
Almeida-Lima, J., Farias, EHC, Leite, EL, Rocha , HAO, 2010. Hoạt tính sinh học của polysaccharid
sulfat từ rong biển nhiệt đới. sinh học. Dược sĩ. 64, 21–28. https://doi.org/10.1016/j. biopha.2009.03.005.
De Raedt, T., Walton, Z., Yecies, JL, Li, D., Chen, Y., Malone, CF, Maertens, O., Jeong, SM, Bronson,
RT, Lebleu, V., Kalluri, R ., Normant, E., Haigis, MC, Manning, BD, Wong, KK, Macleod, KF,
Cichowski, K., 2011. Khai thác các lỗ hổng của tế bào ung thư để phát triển liệu pháp kết hợp cho các
khối u do ras điều khiển. Tế bào ung thư 20, 400–413. https://doi.org/10.1016/j.ccr.2011.08.014.
Ellis, AE, 2001. Cơ chế bảo vệ vật chủ bẩm sinh của cá chống lại virus và vi khuẩn.
nhà phát triển Hợp phần miễn dịch. https://doi.org/10.1016/S0145-305X(01)00038-6.
Ferlay, J., Soerjomataram, I., Dikshit, R., Eser, S., Mathers, C., Rebelo, M., Parkin, DM, Forman, D., Bray,
F., 2015. Tỷ lệ mắc và tử vong do ung thư trên toàn thế giới: nguồn, phương pháp và các mẫu chính trong
GLOBOCAN 2012. Int. J. Ung thư. https://doi.org/ 10.1002/ijc.29210.
Gangaprasad, A., Decruse, SW, Seeni, S., Nair, GM, 2005. Vi nhân giống và
phục hồi sinh thái loài Decalepis arayalpathra (joseph & chandra.) venter - một loài thực vật dân tộc
đặc hữu và có nguy cơ tuyệt chủng ở Tây Ghats. Ấn Độ J. Công nghệ sinh học. 4, 265–270.
�
Gawlik-Dziki, U., Jezyna, M., Swieca, M., Dziki, D., Baraniak, B., Czyz, J., 2012. Ảnh hưởng của
khả năng tiếp cận sinh học của các hợp chất phenolic đối với hoạt động chống ung thư trong ống nghiệm
của mầm bông cải xanh. Thực phẩm Res. quốc tế 49, 469–476. https://doi.org/10.1016/j. foodres.2012.08.010.
Green, DR, Kroemer, G., 2004. Sinh lý bệnh của cái chết tế bào ty thể.
Khoa học 80. https://doi.org/10.1126/science.1099320.
Hengartner, MO, 2000. Hóa sinh của quá trình chết theo chương trình. Thiên nhiên. https://doi.org/
10.1038/35037710.
Irani, K., 2000. Tín hiệu oxy hóa trong quá trình phát triển, chết và sống sót của tế bào mạch máu: đánh giá
vai trò của các loại oxy phản ứng trong cơ trơn và tín hiệu giảm thiểu tế bào nội mô và quá trình chết
theo chương trình. Vòng tròn. độ phân giải https://doi.org/10.1161/01.RES.87.3.179.
Kroemer, G., Reed, JC, 2000. Ty thể kiểm soát sự chết của tế bào. tự nhiên y tế. https://doi.
org/10.1038/74994.
Lim, YY, Lim, TT, Tee, JJ, 2007. Đặc tính chống oxy hóa của một số loại trái cây nhiệt đới: một nghiên cứu
so sánh. Hóa chất thực phẩm 103, 1003–1008. https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2006.08.038.
Lin, MT, Beal, MFF, 2006. Rối loạn chức năng ti thể và stress oxy hóa ở
các bệnh thoái hóa thần kinh. Bản chất 443, 787–795 bản chất05292 [pii]\ 10.1038/
thiên nhiên05292.
Lin, Y., Shi, R., Wang, X., Shen, H.-M., 2008. Luteolin, một loại flavonoid có tiềm năng
phòng ngừa và điều trị ung thư. Curr. Mục tiêu Thuốc Ung thư 8, 634–646. https://doi. org/
10.2174/156800908786241050.
Ling, H.-Q., Zhao, S., Liu, D., Wang, Junyi, Sun, H., Zhang, C., Fan, H., Li, D., Dong, L., Tao, Y ., Gao,
C., Wu, Huilan, Li, Y., Cui, Y., Guo, X., Zheng, S., Wang, B., Yu, K., Liang, Q., Yang, W. , Lou, X.,
Chen, J., Feng, M., Jian, J., Zhang, Xiaofei, Luo, G., Jiang, Y., Liu, J., Wang, Z., Sha, Y., Zhang, B.,
Wu, Huajun, Tang, D., Shen, Q., Xue, P., Zou, S., Wang, X., Liu, X., Wang, F., Yang, Y., An , X., Dong,
Z., Zhang, K., Zhang, Xiangqi, Luo, M.-C., Dvorak, J., Tong, Y., Wang, Jian, Yang, H., Li, Z., Wang, D.,
Zhang, A., Wang, Jun, 2013. Dự thảo bộ gen của tổ tiên bộ gen A lúa mì Triticum urartu. Thiên nhiên.
https://doi.org/10.1038/nature11997.
Liou, GY, Storz, P., 2010. Các loại oxy phản ứng trong bệnh ung thư. Radic tự do. độ phân giải https://doi.org/
10.3109/10715761003667554 .
Martín, R., Ibeas, E., Carvalho-Tavares, J., Hern� andez, M., Ruiz-Gutierrez, V., Nieto, M.
L., 2009. Các diol triterpenic tự nhiên thúc đẩy quá trình chết theo chương trình trong các tế bào u
tế bào hình sao thông qua khử cực ty thể qua trung gian ROS và kích hoạt JNK. PLoS One 4. https://
doi.org/10.1371/journal.pone.0005975.
McLean, L., Soto, U., Agama, K., Francis, J., Jimenez, R., Pommier, Y., Sowers, L., Brantley, E., 2008.
Aminoflavone gây ra tổn thương DNA oxy hóa và phản ứng oxy hóa apoptosis qua trung gian loài trong
các tế bào ung thư vú. quốc tế J. Ung thư 122, 1665–1674. https://doi.org/10.1002/ijc.23244.
Machine Translated by Google

R. Thangam et al. Xúc tác sinh học và Công nghệ sinh học nông nghiệp 21 (2019) 101339

Miller, KD, Siegel, RL, Lin, CC, Mariotto, AB, Kramer, JL, Rowland, JH, Stein, K. Sueishi, Y., Hori, M., Kita, M., Kotake, Y., 2011. Khả năng loại bỏ oxit nitric (NO) của các chất chống oxy

D., Alteri, R., Jemal, A., 2016. Điều trị ung thư và thống kê tỷ lệ sống sót, 2016 CA A Cancer J. Clin.. hóa tự nhiên. Hóa chất thực phẩm 129, 866–870. https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2011.05.036.

https://doi.org/10.3322/caac.21349.

Moorhouse, CP, Halliwell, B., Grootveld, M., Gutteridge, JMC, 1985. Ion coban(II) là chất thúc đẩy gốc Sundaresan, M., Yu, ZX, Ferrans, VJ, Irani, K., Finkel, T., 1995. Yêu cầu đối với

hydroxyl và khả năng hình thành gốc “crypto-hydroxyl” trong các điều kiện sinh lý. Tác dụng khác biệt tạo H2O2 để truyền tín hiệu yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu. Khoa học 270, 296–299. https://

của chất tẩy gốc hydroxyl. doi.org/10.1126/science.270.5234.296.

Tướng quân BBA Subj. https://doi.org/10.1016/0304-4165(85)90147-3. Surh, YJ, 2003. Phòng ngừa ung thư bằng hóa chất thực vật trong chế độ ăn uống. tự nhiên Mục sư

Morris, EJ, Geller, HM, 1996. Cảm ứng quá trình chết theo chương trình của tế bào thần kinh bằng Sự xấu xa. https://doi.org/10.1038/nrc1189.

camptothecin, chất ức chế DNA topoisomerase-I: bằng chứng về độc tính không phụ thuộc vào chu kỳ tế bào. Thangam, R., Gunasekaran, P., Kaveri, K., Sridevi, G., Sundarraj, S., Paulpandi, M., Kannan, S., 2012.

J. Sinh học tế bào. https://doi.org/10.1083/jcb.134.3.757. Một loại protein phân hủy mới từ nọc độc Naja naja gây độc tế bào và chết theo chương trình ở người

Mosmann, T., 1983. Xét nghiệm đo màu nhanh cho sự phát triển và sống sót của tế bào: dòng tế bào ung thư người trong ống nghiệm. Quy trình Hóa sinh. https://doi.org/10.1016/

ứng dụng cho các thử nghiệm tăng sinh và gây độc tế bào. J. miễn dịch. Phương pháp 65, 55–63. https:// j.procbio.2012.04.020.

doi.org/10.1016/0022-1759(83)90303-4. Thornberry, NA, 1998. Caspase: chất trung gian chính của quá trình chết theo chương trình. hóa học. sinh

Nagarajan, S., Jagan Mohan Rao, L., 2003. Xác định 2-hydroxy-4-methoxyben zaldehyde trong rễ của Decalepis học. https://doi. org/10.1016/S1074-5521(98)90615-9.

hamiltonii (wight & arn.) và hemidesmus indicus R. Trachootham, D., Alexandre, J., Huang, P., 2009. Nhắm mục tiêu tế bào ung thư bằng ROS

anh J. AOAC Int. 86, 564–567. cơ chế trung gian: một phương pháp điều trị triệt để? tự nhiên Rev. Thuốc Discov. 8, 579–591. https://

Nair, SN, Mhatre, M., Menon, S., Shailajan, S., 2014. HPLC-ESI-MS/MS đã được kiểm chứng doi.org/10.1038/nrd2803.

phương pháp định lượng axit 2-hydroxy-4-methoxy benzoic từ huyết tương chuột và ứng dụng của nó vào Tsai, PJ, Tsai, TH, Yu, CH, Ho, SC, 2007. So sánh các hoạt động khử NO và khử NO của các loại trà thảo mộc

nghiên cứu dược động học bằng phương pháp lấy mẫu thưa thớt. khác nhau với trà xanh. Hóa chất thực phẩm https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2006.08.013.

J.Pharm. sinh học. hậu môn. 100, 190–198. https://doi.org/10.1016/j. jpba.2014.08.002.

Tsuchiya, T., Shimizu, H., Horie, T., Mori, M., 1999. Biểu hiện của thụ thể leptin trong phổi: leptin như

Pierroz, V., Joshi, T., Leonidova, A., Mari, C., Schur, J., Ott, I., Spiccia, L., Ferrari, S., một yếu tố tăng trưởng. Ơ. J. Dược phẩm. https://doi.org/10.1016/S0014-2999 (98)00884-X.

Gasser, G., 2012. Đặc tính tế bào và phân tử của tác dụng sinh học của phức hợp ruthenium(II) kết hợp

với axit 2-pyridyl-2-pyrimidine-4-carboxylic. Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, MT, Mazur, M., Telser, J., 2007. Miễn phí

Mứt. hóa học. Sóc. 134, 20376–20387. https://doi.org/10.1021/ja307288s. gốc tự do và chất chống oxy hóa trong các chức năng sinh lý bình thường và bệnh tật của con người. Tạp

Singh, B., Bhat, TK, 2003. Ứng dụng điều trị tiềm năng của một số thuốc kháng dinh dưỡng chí quốc tế về hóa sinh & sinh học tế bào 39 (1), 44–84.

các chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật. J. Nông nghiệp. Hóa chất thực phẩm 51, 5579–5597. https:// Valko, M., Rhodes, CJ, Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M., 2006. Các gốc tự do, kim loại và chất chống oxy

doi.org/10.1021/jf021150r . hóa trong ung thư do stress oxy hóa gây ra. hóa học. sinh học. Tương tác. 160, 1–40. https://doi.org/

Sircar, D., Dey, G., Mitra, A., 2007. Một phương pháp HPLC đã được xác thực cho đồng thời 10.1016/j.cbi.2005.12.009.

xác định 2-Hydroxy-4-methoxybenzaldehyde và 2-Hydroxy-4-methoxy benzoic acid trong các cơ quan rễ Verma, RS, Mishra, P., Kumar, A., Chauhan, A., Padalia, RC, Sundaresan, V., 2014.

của hemidesmus indicus. sắc ký. https://doi. org/10.1365/s10337-006-0146-x. Thành phần hóa học của mùi thơm rễ cây Decalepisarayalpathra (J. Joseph và V.

Chandras) Venter, một loài thực vật dân tộc đặc hữu và có nguy cơ tuyệt chủng ở Western Ghats, Ấn Độ.

Srivastava, A., Shivanandappa, T., 2009. Rễ cây Decalepis hamiltonii tăng cường tình trạng chống oxy hóa tự nhiên sản xuất. độ phân giải https://doi.org/10.1080/14786419.2014.918127.

của gan và não chuột. J. Khoa học. Thực phẩm nông nghiệp. 89, 2461–2466. https://doi.org/ 10.1002/ Zhang, R., Humphreys, I., Sahu, RP, Shi, Y., Srivastava, SK, 2008. Cảm ứng in vitro và in vivo của quá trình

jsfa.3748. chết theo chương trình bởi capsaicin trong các tế bào ung thư tuyến tụy được trung gian thông qua quá

trình tạo ra ROS và con đường chết của ty thể. Apoptosis 13, 1465–1478. https://doi.org/10.1007/

s10495-008-0278-6.

10