BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÀI GIẢNG

THỰC HÀNH
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
(MSHP: CS119)

Nhóm Biên Soạn

ThS. Huỳnh Xuân Phong
ThS. Trần Vũ Phương
ThS. Nguyễn Ngọc Thạnh

CẦN THƠ 3/2019

 Bài 1
XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP
1. Giới thiệu
Phương pháp xác định mật số vi sinh vật sử dụng buồng đếm hồng cầu có ưu điểm là xác
định được mật số vi sinh vật một cách nhanh chóng với quy trình thực hiện đơn giản.
Nhược điểm của phương pháp này là đễ nhầm lẫn, độ chính xác không cao, không thích
hợp cho dung dịch có mật số vi sinh vật thấp và không phân biệt được tế bào sống và
chết. Trong một số trường hợp cần phải xác định mật số tế bào vi sinh vật sống một cách
nhanh chóng ở mức độ tương đối, tế bào vi sinh vật sẽ được nhuộm với chất chỉ thị màu
để phân biệt tế bào sống và chết trước khi đếm dưới buồng đếm hồng cầu. Phương pháp
này cho phép xác định được tỷ lệ tế bào vi sinh vật sống rất nhanh chóng (từ vài phút đến
vài giờ) so với phương pháp đếm mật số khuẩn lạc trên môi trường dinh dưỡng (thường
khoảng 3-4 ngày).

Buồng đếm hồng cầu

(http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/cellcounting.html)

Vùng đếm trung tâm trên buồng đếm hồng cầu

Phương pháp nhuộm methylene blue để xác định mật số tế bào vi sinh vật sống dựa trên
khả năng làm mất màu xanh của methylene blue nhờ hoạt động của hệ enzyme trong tế
bào vi sinh vật sống. Khi nhuộm với methylene blue, chất chỉ thị màu này sẽ xâm nhập
vào tất cả tế bào vi sinh vật, chất chỉ thị màu sẽ bị khử màu bởi hoạt động của enzyme

1
của tế bào sống và tế bào chết sẽ bị nhuộm màu xanh khi quan sát dưới kính hiển vi
(Painting và Kirsop, 1989).
Phương pháp đánh dấu chỉ thị huỳnh quang để xác định khả năng sống của vi sinh vật
đã được sử dụng bởi nhiều tác giả (Thanh và Nout, 2002; Breeuwer và Abee, 2000;
Davey and Kell, 1996). Phương pháp này dựa trên cơ sở sử dụng chất chỉ thị huỳnh
quang cFDA thể hiện cho hoạt động của enzyem nội bào (esterase) nằm ở màng tế bào
chất (ở tế bào nguyên vẹn), enzyme này chỉ có được khi tế bào còn sống. Khi được hấp
thu vào, cFDA (bản thân chất này không màu) sẽ bị phân cắt cho ra cF (có màu xanh)
tích luỹ tại màng tế bào chất và chính cF làm bào tử phát quang màu xanh. Tuy nhiên,
cFDA cũng có khả năng đi vào những tế bào có màng tế bào chất bị tổn thương nhưng ở
các tế bào này không có sự hiện diện của enzyme nội bào nên không phát quang xanh.
Còn chất chỉ thị huỳnh quang PI có thể đi vào những tế bào có màng tế bào chất bị tổn
thương và đi vào nhân tế bào, ở đây chúng gắn kết xen kẻ vào chuỗi ADN của tế bào làm
cho các tế bào này phát quang đỏ. Ngoài ra, những tế bào ở trạng thái miên trạng không
phát màu huỳnh quang là do chúng có màng tế bào chất nguyên vẹn nhưng thiếu đi sự
hoạt động của enzyme nội bào (Thanh và Nout, 2004). Ưu điểm của phương pháp huỳnh
quang là xác định tế bào sống nhanh (30-40 phút) tiết kiệm được nhiều thời gian so với
phương pháp đếm sống cổ điển (2-4 ngày), nhưng đảm bảo tính chính xác khi so sánh
giữa hai phương pháp (Thanh và Nout, 2002).
2. Hoá chất
- Hoá chất thông thường: K2HPO4, acid citric, NaCl,…
- Chất chỉ thị/ đánh dấu huỳnh quang: (1) cFDA [5-(and-6)carboxyfluorescein diacetate] ;
(2) PI (Propidium iodide).
- Methylene blue (C16H18ClN3S), sodium citrate dihydrate
(HOC(COONa)(CH2COONa)2·2H2O)
3. Thiết bị và Dụng cụ
- Kính hiển vi quang học Olympus CTH, kính hiển vi huỳnh quang Olympus BH2-RFL-T2.
- Bếp đun cách thuỷ (water-bath) Julabo TW20
- Máy ly tâm Eppendorf HERMLE Z233M-2
- Máy vortex, pipet, micro-pipet Biohit-6047831
- Buồng đếm hồng cầu Bürk – Türk
- Ống nghiệm, ống/tuýp Eppendorf
Và các thiết bị, dụng cụ thường dùng trong phòng thí nghiệm.
4. Các bước tiến hành
Chuẩn bị dịch trích vi sinh vật: Bào tử nấm mốc hay tế bào nấm men tổng số được xác
định bằng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu Bürk-Türk. Chuẩn bị
huyền phù bào tử nấm mốc hoặc tế bào nấm men như sau:

2
- Nấm men hoặc nấm mốc được nuôi cấy sẵn trong ống thạch nghiêng: cho 10 mL dung
dịch nước muối sinh lý vào ống mẫu, dùng que cấy cạo nhẹ phần bào tử nấm mốc hoặc tế
bào nấm men để hòa vào dung dịch ta thu được dịch trích.
- Bột bào tử nấm mốc hoặc bột nấm men: cân 1 g mẫu vào ống nghiệm vô trùng, cho vào
9 mL nước cất vô trùng, sau đó dùng máy vortex làm đều dịch huyền phù.
4.1. Xác định bào tử nấm mốc và tế bào nấm men
Phương pháp thực hiện
Dịch trích bào tử hay nấm men được pha đến độ loãng thích hợp và được đếm bằng
buồng đếm Bürk-Türk. Nhỏ một giọt lên buồng đếm kề với cạnh của lá kính, dịch huyền
phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn. Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi có
vùng không gian nằm giữa lá kính và buồng đếm được lấp đầy bởi dịch huyền phù tế bào,
còn các rãnh xung quanh thì không bị ướt. Di chuyển nhẹ nhàng buồng đếm để dịch
huyền phù đi vào trong khoang có chiều dày khoảng 0,1 mm. Đặt buồng đếm lên bàn
kính hiển vi và điều chỉnh cường độ ánh sáng để có thể quan sát rõ ràng cả tế bào lẫn
đường kẻ. Tùy thuộc vào số lượng tế bào để chọn cách đếm, có thể đếm tất cả tế bào có
trong một ô trung tâm hay chỉ đếm các tế bào trong một số các ô vuông lớn đại diện.
Tính toán kết quả
Sau khi đếm số bào tử trên buồng đếm, tính bào tử tổng số/gam cơ chất theo công thức:
N= [a/0,016] x 103 x 10n (tb/mL)
Trong đó, N: số lượng tế bào trong 1 mL; a: tổng số tế bào trong 4 ô lớn; 0,016: thể tích
của 4 ô lớn (µL); n : độ pha loãng; 103: số chuyển mm3 thành mL (1000 mm3 = 1 mL).

Hoặc: N= [(a/b) x (256/0,1)] x 103 x 10n

Trong đó N: số lượng tế bào trong 1 mL nghiên cứu; a: số tế bào trong 4 ô vuông lớn;
b: số ô vuông nhỏ trong 4 ô vuông lớn (16 x 4 = 64 ô vuông nhỏ); 256: tổng số ô vuông
nhỏ trong ô trung tâm; 0,1: thể tích dịch tế bào chứa trên ô trung tâm; 103: số chuyển
mm3 thành mL (1000 mm3 = 1 cm3 = 1 mL); n: độ pha loãng mẫu.
4.2. Xác định tế bào nấm men sống bằng phương pháp nhuộm methylene blue
Chuẩn bị dung dịch methylene blue
Hòa tan 0,01 g methylene blue vào 10 mL nước cất. Thêm vào 2 g sodium citrate
dihydrate và khuấy đều đến khi hoà tan hoàn toàn. Dịch hòa tan sau đó được lọc qua giấy
lọc và thêm nước cất đến 100 mL. Dung dịch được trữ trong chai màu nâu để tránh sáng.
Phương pháp thực hiện
Sử dụng 500 µL dịch huyền phù tế bào nấm men với nồng độ pha loãng thích hợp. Thêm
vào 500 µL dung dịch methylene blue, trộn đều bằng máy vortex. Sau đó tế bào nấm men
sẽ được đếm bằng buồng đếm Bürk-Türk
Xác định tổng số tế bào nấm men, bao gồm tế bào sống (không bị nhuộm màu) và tế bào
chết (bị nhuộm màu xanh) và tính tỷ lệ tế bào nấm men sống trong tổng số tế bào.

3
4.3. Xác định vi sinh vật (bào tử, nấm men) sống
- Dịch trích bào tử (như trên) hay dịch nấm men được rửa hai lần (bằng dung dịch đệm
phosphate) bằng cách ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. (Dung dịch đệm phosphate
được pha từ K2HPO4 50mM và acid citric 50mM, điều chỉnh đến pH 4,0).
- Tiếp theo, dịch trích bào tử hay nấm men được ủ 20 phút ở 40C có sự hiện diện của
chất đánh dấu huỳnh quang cFDA (10mg cFDA + 1ml aceton) và PI (5mg PI + 1ml nước
cất khử trùng). Sau đó chúng được giữ lạnh bởi đặt vào trong nước đá và được đếm trong
buồng đếm Bürk – Türk bằng kính hiển vi huỳnh quang. Dưới kính hiển vi huỳnh quang,
bào tử sống phát ra huỳnh quang xanh với cFDA, bào tử chết phát ra huỳnh quang đỏ với
PI (Thanh and Nout, 2004).
Cách thực hiện được tóm tắt theo qui trình sau:
Mẫu Nước muối sinh lý khử trùng

Pha loãng dịch trích (khoảng 106 tb/ml)

Lấy 1ml dịch trích pha loãng cho vào eppendorf

Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút

Dùng pipet rút bỏ 800µl dịch bên trên (giữ phần lắng)

Rửa (thực hiện 2 lần)

Cho vào eppendorf 800µl dung dịch đệm phosphate pH 4,0
(Vortex và ly tâm 10.000 vòng/phút, 10 phút; rút bỏ 800µl dịch bên trên giữ phần lắng)

Cho vào eppendorf

800µl dung dịch đệm phosphate pH 4,0
5µl dung dịch cFDA và 5µl dung dịch PI

Ủ ở 40oC, 20 phút trong waterbath

Trữ trong đá

Đếm mật số bào tử / tế bào trên buồng đếm Bürk-Türk dưới KHV huỳnh quang
Cách tính số lượng bào tử hay nấm men sống tương tự như cách tính tế bào hay bào tử
tổng số. Dựa vào kết quả thu được từ phương pháp đếm huỳnh quang, tính tỉ lệ
sống/chết/miên trạng của vi sinh vật.

4
Tài liệu tham khảo
Breeuwer, P., and Abee, T., 2000. Assessment of viability of microorganisms employing
fluorescence techniques. International Journal of Food Microbiology 55, pp.193-200.
Thanh, N. V., and Nout, M. J. R., 2002. Rhizopus oligosporus biomass, sporangiospore yield and
viability as influenced by harvesting age and processing conditions. Food Microbiology 19,
pp.91-96.
Thanh, N. V., and Nout, M. J. R., 2004. Dormancy, activation and viability of Rhizopus
oligosporus sporangiospores. International Journal of Food Microbiology 92, pp.171-179.
Painting, K and Kirsop, B., 1989. A quick method for estimating the percentage of viable cells in
a yeast population, using methylene blue staining. World for Culture Collections, Technical
information Federation sheet No 2. UNESCO/WFCC - Education Committee.

5
 Bài 2
XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ NẤM MEN VÀ NẤM MỐC
BẰNG PHƯƠNG PHÁP CẤY TRẢI
1. Giới thiệu
Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty. Nấm men là những tế
bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả
trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và
nấm men là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường. Mầm có thể là
một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn ty (Lê Thùy Linh, 2010).

Trong thực phẩm, xác định lượng nấm mốc và nấm men hiện diện để đánh giá chất
lượng, tình trạng vệ sinh và các điều kiện bảo quản sản phẩm và dự đoán khả năng hư
hỏng của sản phẩm vì nấm men và mốc tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm,
làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm (Lê Thanh
Mai et al., 2004).

Ngoài ra, nhiều nấm mốc có thể sản xuất ra các sản phẩm phụ, các sản phẩm phụ này có
thể là chất độc đối với con người. Một số nấm mốc có thể sản xuất độc tố (mycotoxin).
Tổng số nấm men và nấm mốc có thể được xác định bằng phương pháp đổ đĩa trong môi
trường thạch (tham khảo bài 4) hoặc xác định bằng phương pháp cấy gạt trên bề mặt
thạch.

Phương pháp cấy gạt (kỹ thuật hộp trải)

- Dùng pipet đã vô khuẩn lấy 0,1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch (tương đương
với 2 giọt dịch). Số tế bào cấy trên bề mặt thạch phải được dàn đều và không nên vượt
quá vài trăm (có thể dùng thể tích mẫu cấy từ 0,05 - 0,5ml; tuy nhiên, thể tích mẫu cấy
càng nhỏ thì sai số có thể xảy ra càng lớn).

- Khi tất cả các thể tích 0,1 ml tế bào ở các độ pha loãng khác nhau đều đã được chuyển
lên bề mặt thạch của đĩa pêtri, sử dụng que cấy gạt bằng thuỷ tinh hoặc kim loại để dàn
đều các tế bào trên bề mặt thạch. Lưu ý rằng que cấy gạt thuỷ tinh phải được vô khuẩn
trước khi được đưa vào đĩa petri tiếp theo.

6
2. Hoá chất
- Môi trường YDC (TCVN 5750:1993)
Beef extract .............................................................5 g
Glucose .................................................................20 g
Oxytetracyline......................................................0,1 g
Agar ......................................................................15 g
Nước cất......................................................... 1000 ml
Pha chế: Đun sôi để hòa tan thành phần trên trong nước cất, để nguội khoảng
45oC trong nồi cách thủy, điều chỉnh để pH là 6,6  0,1 ở 25oC, chứa từng lượng 100ml
vào bình có dung tích phù hợp, hấp thanh trùng 121oC trong 15 phút. Trong trường hợp
không có oxytetracyline có thể thay bằng cloramphenicol (C11H12Cl2N2O5) và được chuẩn
bị như sau: Từ các lọ đã chứa 100 ml môi trường không có oxytetracyline, làm chảy môi
trường và duy trì ở 45oC trong nồi chưng cách thủy. Chuẩn bị dung dịch 0,01%
oxytetracyline bằng cách hòa tan 0,01g oxytetracyline trong 100 ml nước cất, lọc thanh
trùng. Cho 10 ml dung dịch 0,01% oxytetracyline vào 100 ml môi trường đã nóng chảy,
lắc để chộn đều.
- Môi trường OGYA (Oxytetracyline Glucose Yest extract Agar)
Yeast extract ............................................................5g
Glucose ..................................................................20g
Oxytetracyline.......................................................0,1g
Agar .......................................................................15g
Nước cất.......................................................... 1000ml
Pha chế: Đun sôi để hòa tan thành phần trên trong nước cất, để nguội khoảng
45oC trong nồi cách thủy, điều chỉnh để pH là 6,6  0,1 ở 25oC, chứa từng lượng 100ml
vào bình có dung tích phù hợp, hấp thanh trùng 121oC trong 15 phút. Trong trường hợp
không có oxytetracyline có thể thay bằng cloramphenicol (C11H12Cl2N2O5) và được chuẩn
bị như sau: Từ các lọ đã chứa 100ml môi trường không có oxytetracyline, làm chảy môi
trường và duy trì ở 45oC trong nồi chưng cách thủy. Chuẩn bị dung dịch 0,01%
oxytetracyline bằng cách hòa tan 0,01 g oxytetracyline trong 100 ml nước cất, lọc thanh
trùng. Cho 10ml dung dịch 0,01% oxytetracyline vào 100 ml môi trường đã nóng chảy,
lắc để chộn đều.

7
- Môi trường DRBC (Dichloran Rose-Bengal Chloramphenicol Agar )
Peptone ......................................................................5,0
Glucose ....................................................................10,0
Potassium dihydrogen phosphate ..............................1,0
Magnesium sulphate ..................................................0,5
Dichloran ...............................................................0,002
Rose-Bengal ..........................................................0,025
Agar .........................................................................15,0
Nước cất............................................................. 1000ml
Điều chỉnh pH 5,6 ± 0,2. Khử trùng 121oC trong 15 phút, để nguội khoảng
45-50oC và bổ sung Chloramphenicol với hàm lượng 100 mg/lít.
Ngoài ra có thể sử dụng các môi trường khác như Dicloran Glycerol Agar (DG18), Malt
Extract Agar (MEA), Potato Dextrose Agar (PDA), Sabouraud Dextrose Agar (SDA),…

3. Thiết bị và Dụng cụ
- Bếp đun cách thuỷ (water-bath) Julabo TW20
- Máy vortex
- Nồi khử trùng nhiệt ướt
- Đĩa pêtri.
- Pipet, micro-pipet Biohit-6047831
- Ống nghiệm, tuýp eppendorf và các thiết bị, dụng cụ thường dùng trong phòng thí
nghiệm.
4. Các bước tiến hành
Nấm men và nấm mốc là các vi sinh vật đơn bào hoặc đa bào, hình thành khuẩn lạc trong
môi trường lựa chọn ở 25  1oC trong 48 - 72 giờ (TCVN 5750:1993). Môi trường dinh
dưỡng phải chứa chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn (chất kháng sinh như
oxytetracyline hoặc chloramphenicol) (Lê Thanh Mai et al., 2004).
Tóm tắt quy trình thực hiện
Mẫu

Đồng nhất mẫu

Pha loãng mẫu (1ml mẫu + 9ml nước peptone)

Đồng nhất mẫu

Trải 0,1ml mẫu lên môi trường thạch

8
 
Ủ 25  1 C trong 48 - 72 giờ
o


Đếm khuẩn lạc nấm mốc và nấm men

Tính kết quả (đơn vị CFU/g)
* Tính kết quả: Sau khi khuẩn lạc đã mọc, đếm số khuẩn lạc đã mọc trên đĩa và tính kết
quả theo công thức như trong phần xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Gọi N là số khuẩn lạc có trong 1g mẫu được tính theo công thức:

N= C
(n1 + 0,1n2) d
Trong đó:
C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri.
d: Nồng độ pha loãng mẫu, mà ở đó đĩa petri đầu tiên được chọn để đếm có số
khuẩn lạc thỏa điều kiện 30 < x < 300.
n1: Số đĩa chọn đếm các khuẩn lạc ở nồng độ đầu tiên (n1 = 1 hoặc n1 = 2).
n2: Số đĩa chọn đếm các khuẩn lạc ở nồng độ kế tiếp (n2 = 1 hoặc n2 = 2).
Ví dụ: - Ở nồng độ pha loãng 10-2 được chọn để đếm khuẩn lạc là: 183 và 180.
- Ở nồng độ pha loãng 10-3 được chọn để đếm khuẩn lạc là: 30 và 48.
Áp dụng công thức, ta có:
C 183 + 180 + 30 +48 441
N= = -2 = = 20,045
(n1 + 0,1n2) d [2 + (0,1 x 2)] x 10 0,022

Làm tròn số và biểu thị kết quả với 2 số có nghĩa trong khoảng từ 0,1 đến 9,9 và
nhân với 10n (n là số bậc lũy thừa cơ số 10). Kết quả trên được biểu thị: 2,0 x 105 CFU/g.
Tài liệu tham khảo
Lê Thanh Mai. 2008. Phân tích vi sinh thực phẩm. Trường Đại học Bách khoa Hà Nội. Lê
Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng và Lê Thị Lan
Chi. 2004. Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, Trường Đại học
Bách khoa Hà Nội.
Lê Thùy Linh. 2010. Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm. Trường Đại học Công
nghiệp thực phẩm TP. HCM.
TCVN 5750:1993. 1993. Phương pháp xác định nấm men và nấm mốc. Hà Nội.
Trần Linh Thước. 1998. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm, mỹ
phẩm. NXB Giáo dục.

9
 Bài 3
XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ
(NF V08-051)

1. Định nghĩa
Là vi sinh vật phát triển được ở nhiệt độ 30-37oC trong điều kiện hiếu khí trên môi
trường dinh dưỡng không chọn lọc. Tổng số sinh vật vật hiếu khí hiện diện cho biết được
mức độ nhiễm vi sinh vật của nguồn nước, thực phẩm,...
2. Nguyên tắc
- Cấy một lượng xác định mẫu thử nghiệm vào đĩa petri.
- Đổ thạch dinh dưỡng vào, lắc đều và ủ ở 30oC/24-48 giờ trong điều kiện hiếu
khí.
- Sau 24 giờ đếm tất cả những khuẩn lạc hiện diện trên đĩa petri.
3. Môi trường nuôi cấy
Môi trường PCA (Plate Count Agar)
Tryptone 0,5%
Yeast extract 0,25%
Glucose 0,1%
Agar 1,5-2,0%
Nước Vừa đủ 100%

Hòa tan 26,5 g bột khan môi trường PCA trong 1 lít nước, đun và khuấy nhẹ cho
đến khi tan hoàn toàn, chỉnh pH=7,00,2. Phân vào chai 100 mL môi trường. Khử trùng
nhiệt ướt ở 121oC trong 20 phút.
4. Dụng cụ
-Tủ sấy dùng để khử trùng nhiệt khô ở 180oC.
-Nồi khử trùng nhiệt ướt 121oC.
-Tủ ủ 37oC.
-Bếp đun cách thuỷ 45oC, 50oC.
-Buồng đến khuẩn lạc.

10
5. Phương pháp thực hiện
Ngày 1
- Cân 20 g mẫu thử, thêm 180 mL nước muối sinh lý (NaCl 0,85%) hoặc đệm
peptone.
- Nghiền bằng stomacher (230 vòng/phút trong 1 phút).
- Pha loãng dần 10-2,10-3,… (tùy theo mức độ nhiễm khuẩn của mẫu thử).
- Lấy 1 mL mẫu thử ở các nồng độ pha loãng kế tiếp cho vào đĩa petri.
- Rót 15-20 mL thạch PCA (45-50oC) vào đĩa petri và lắc đều.
- Để yên cho môi trường đặc lại và ủ ở 37oC/24-48 giờ.
Ngày 2 và 3
Đếm tất cả những khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa petri ở 2 nồng độ kế tiếp nhau
(chọn đĩa petri ở nồng độ sao cho có số khuẩn lạc: 30 < x < 300).
6. Cách tính kết quả
Gọi N là số khuẩn lạc có trong 1g mẫu được tính theo công thức:

N= C
(n1 + 0,1n2) d
Trong đó:
C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri.
d : Nồng độ pha loãng mẫu, mà ở đó đĩa petri đầu tiên được chọn để đếm có số
khuẩn lạc thỏa điều kiện 30 < x < 300.
n1: Số đĩa chọn đếm các khuẩn lạc ở nồng độ đầu tiên (n1 = 1 hoặc n1 = 2).
n2: Số đĩa chọn đếm các khuẩn lạc ở nồng độ kế tiếp (n2 = 1 hoặc n2 = 2).
Ví dụ:
- Ở nồng độ pha loãng 10-2 được chọn để đếm khuẩn lạc là: 183 và 180.
- Ở nồng độ pha loãng 10-3 được chọn để đếm khuẩn lạc là: 30 và 48.
Áp dụng công thức, ta có:
C 183 + 180 + 30 +48 441
N= = = = 20.045
(n1 + 0,1n2) d [2 + (0,1 x 2)] x 10-2 0,022

Làm tròn số và biểu thị kết quả với 2 số có nghĩa trong khoảng từ 0,1 đến 9,9 và nhân với
10n (n là số bậc lũy thừa cơ số 10). Kết quả trên được biểu thị: 2,0 x 104 CFU/g mẫu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO:
Dénombrement des micro-organismes par comptage des colonies obtenus à 30 oC.
Méthode de routine. Microbiologie alimentaire 8e édition, Tome 2-AFNOR 2002, page 11 NF
V08-051.

11
 Bài 4
XÁC ĐỊNH COLIFORMS TỔNG SỐ,
COLIFORMS CHỊU NHIỆT VÀ E. COLI
(Phương pháp MPN)

Phương pháp MPN NF ISO 4831, NF V08-016

1. Định nghĩa
Coliforms tổng số là những vi sinh vật hình que, Gram âm, hiếu khí, kị khí tuỳ
nghi, có khả năng phát triển trong môi trường có muối mật, lên men đường lactose và
sinh gas ở nhiệt độ 35-37oC trong vòng 24-48 giờ, oxydase âm tính.
Escherichia coli có cùng tính chất giống như Coliforms tổng số nhưng phát triển
ở 44,5oC và sản sinh indol từ tryptophane.
2. Nguyên tắc
- Cấy một lượng mẫu thử vào 3 ống môi trường chọn lọc, nồng độ đậm đặc.
- Cấy lượng mẫu thử vào 3 ống môi trường lỏng chọn lọc, nồng độ pha loãng.
- Thực hiện tương tự với lượng mẫu thử pha loãng 10-1, 10-2,…
- Ủ ở 35-37oC/24-48 giờ.
- Từ những ống nghiệm dương tính (sinh gas) và dựa vào bảng MPN tính
Coliforms tổng số và E. coli có trong 1 g hay 1 mL mẫu.
3. Dụng cụ
-Tủ sấy dùng để khử trùng nhiệt khô ở 180oC.
-Nồi khử trùng nhiệt ướt 121oC.
-Tủ ủ 37oC, 44,5oC
-Bếp đun cách thuỷ 45oC, 50oC.
-Ống hút khắc vạch 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL.
4. Môi trường nuôi cấy và thuốc thử
4.1. Dung dịch pha loãng
- NaCl 9,0 g
- KCl 0,42 g
- CaCl2 0,48 g
- Hydrogénocarbonate natri 0,2 g
- Nước cất 1.000 mL

12
4.2. Canh thang Tryptose et Lauryl sulfate natri
-Tryptone 20,0 g
- Lactose 5,0 g
- K2HPO4 2,75 g
- KH2PO4 2,75 g
- NaCl 5,0 g
- Natri lauryl sulfat CH3(CH2)11OSO3Na 0,1 g
- Nước cất 1.000 mL
Hòa tan 40 g bột khan (môi trường nồng độ đơn) và 80 g bột khan (môi trường
nồng độ kép) trong 1 lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn toàn. Chỉnh pH =
6,7  0,1. Phân 10 mL môi trường nồng độ đơn vào các ống nghiệm 16 x 160 mm và 10
mL môi trường nồng độ kép vào các ống nghiệm 12 x 120 mm (trong các ống nghiệm có
ống Durham). Khử trùng nhiệt ướt ở 121oC/20 phút.
4.3. Môi trường xanh lục sáng (Brilliant Green Bile Broth – BGBL)
- Peptone bactériologique 10 g
- Bile de boeuf (muối mật) 10 g
- Lactose 10 g
- Vert brillant 0,0133 g
- nước cất 1.000 mL
Hòa tan 40 g bột khan (môi trường nồng độ đơn) và 80 g bột khan (môi trường
nồng độ kép) trong 1 lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn toàn. Chỉnh pH =
7,2  0,1. Phân 10 mL môi trường nồng độ đơn vào các ống nghiệm 16 x 160 mm và 10
mL môi trường nồng độ kép vào các ống nghiệm 12 x 120 mm (trong các ống nghiệm có
ống Durham). Khử trùng nhiệt ướt ở 121oC/20 phút.
4.4. Môi trường Peptone d’indol
- Tryptone 10 g
- NaCl 5,0 g
- Nước cất 1.000 mL
Hòa tan 15 g bột khan trong 1 lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn
toàn. Chỉnh pH = 7,3. Phân 5-10 mL môi trường vào các ống nghiệm 16 x 160 mm. Khử
trùng nhiệt ướt ở 121oC/20 phút.

13
4.5. Thuốc thử Kovac’s
- P.méthyl amino bezandéhyde 5g
- Alcool amylique 75 mL
- HCl 25 mL
Hòa tan P. méthyl amino bezandéhyde trong Alcool amylique, đun cách thủy nhẹ
ở 50-55oC cho đến khi tan hoàn toàn. Thêm HCl vào, vừa cho vào vừa làm lạnh với nước
đá. Bảo quản ở 4oC trong chai màu nâu.
5. Phương pháp thực hiện
Ngày 1

- Cân 20 g mẫu thử, thêm 180 mL đệm pepton. Nghiền bằng stomacher trong 1
phút.

- Pha loãng ở các nồng độ thích hợp.

- Cho 1 mL mẫu ở mỗi nồng độ (khoảng 3-5 nồng độ) vào 6 ống môi trường TLS.
- Ủ 3 ống môi trường TLS ở 37oC và 3 ống môi trường TLS ở 44,5oC trong thời
gian 24-48 giờ.
Ngày 2
- Quan sát các ống nghiệm có sinh gas trong chuông Durham.
- Chuyển 1 mL mẫu từ các ống nghiệm có sinh gas tương ứng sang môi trường
khẳng định (BGBL).
- Ủ các ống tương ứng ở 37oC/24-48 giờ để xác định Coliforms tổng số và ở
44,5oC/24-48 giờ để xác định Coliforms chịu nhiệt.
Ngày 3
- Quan sát các ống nghiệm có sinh gas trong chuông Durham.
- Ghi nhận số ống sinh gas ở 37oC và 44,5oC  tra bảng MPN.
- Chuyển 1 mL mẫu từ các ống nghiệm có sinh gas trong môi trường BGBL ủ ở
44,5oC sang môi trường Peptone d’indol.
- Tiếp tục ủ các ống môi trường Peptone d’indol ở 44,5oC trong thời gian 24 giờ.
Ngày 4
- Cho vào khoảng 3-4 giọt thuốc thử Kovac’s vào các ống nghiệm môi trường
Peptone d’indol.

14
 - Ghi nhận có màu đỏ xuất hiện thì kết luận có sự hiện diện của E. coli  tra bảng
MPN.
6. Cách tính kết quả
Quan sát những ống nghiệm sinh gas ở môi trường ủ ở 37oC ghi nhận là dương
tính, rồi sau đó tra vào bảng MPN tính số lượng Coliforms tổng số có trong 1 g hay 1 mL
mẫu.
Quan sát những ống nghiệm sinh gas ở giá ống nghiệm ử ở 44,5 oC (Coliforms
chịu nhiệt) và Indol dương tính, tra bảng MPN tính số lượng E. coli có trong 1 g hay 1
mL mẫu.
Ví dụ:
- Dung dịch pha loãng 10-1  1 mL 3 ống (+)
- Dung dịch pha loãng 10-2  1 mL 2 ống (+)
- Dung dịch pha loãng 10-3  1 mL 1 ống (+)
- Dung dịch pha loãng 10-4  1 mL 0 ống (+)

Ta được: 3:2:1
Tra vào bảng MPN ta có: 15
Vì 3 ống (+) đầu ở nồng độ 10-1
Do đó ta có: 15 x 10 = 1,5 x 102

 Kết quả Coliforms tổng số là: 1,5 x 102 C

F
U/g
TÀI

LIỆU THAM KHẢO

Directives générales pour le dénombrement des Coliformes. Technique du nombre le plus
probable”. Microbiologie alimentaire 8e édition, Tome 1 – AFNOR 2002, page 239 NF ISO
4831, NF V08-016.
Directives générales pour le dénombrement des Escherichia coli. Technique du nombre
le plus probable”. Microbiologie alimentaire 8e édition, Tome 1 – AFNOR 2002, page 265 NF
ISO 7251, NF V08-020.

15
PHỤ LỤC

16
 “quy dịnh giới hạn tối da o nhiễm sinh học va hoa học trong thực phẩm”
(Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007 của Bộ trưởng Bộ Y Tế)
* Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong thịt và sản phẩm thịt
Giới hạn vi sinh vật (Trong 1g hoặc 1ml sản
TT Sản phẩm Loại vi sinh vật
phẩm) (*)
1. Thịt tươi, đông lạnh
1.1 Thịt tươi, thịt đông lạnh TSVSVHK 105
nguyên con hoặc cắt Coliforms 102
miếng E. coli 102
S. aureus 102
Cl.perfringens 102
Salmonella Không có
1.2 Thịt tươi, thịt đông lạnh TSVSVHK 106
xay nhỏ Coliforms 102
E. coli 102
S. aureus 102
Cl.perfringens 102
Salmonella Không có
2. Thịt và sản phẩm thịt chế biến không xử lý nhiệt (sử dụng trực tiếp)
2.1 Thịt và sản phẩm thịt TSVSVHK 103
dạng muối, xông khói Coliforms 50
E. coli 10
S. aureus 102
Cl.perfringens 102
Salmonella Không có
Listeria monocytogenes Không có
2.2 Thịt và sản phẩm thịt lên Coliforms 50
men E. coli 10
S. aureus 102
Cl.perfringens 102
Salmonella Không có
Listeria monocytogenes Không có
3. Thịt và sản phẩm thịt đã qua xử lý nhiệt
3.1 Thịt và sản phẩm thịt TSVSVHK 104
đóng gói Coliforms 50
E. coli Không có (hoặc < 3 MPN)
S. aureus 102
Cl.perfringens 10
Cl. botuliniums Không có
Salmonella Không có
Listeria monocytogenes Không có
3.2 Thịt và sản phẩm thịt TSVSVHK 105
không đóng gói Coliforms 50
E. coli Không có (hoặc < 3 MPN)
S. aureus 102
Cl.perfringens 102
Salmonella Không có
Listeria monocytogenes Không có
3.3 Thịt khô TSVSVHK 105
Coliforms 50
E. coli Không có (hoặc < 3 MPN)
S. aureus 102
Cl.perfringens 102
Salmonella Không có
Listeria monocytogenes Không có
3.4 Thịt hộp E. coli Không có (hoặc < 3 MPN)
S. aureus Không có
Cl.perfringens Không có
Cl.botuliniums Không có
Salmonella Không có
(*) Tính trên 25g hoặc 25ml đối với Salmonella, Listeria monocytogenes.

17