TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN XXXX :2018

(Dự thảo 3)

BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN –

PHẦN XX: BỆNH SẢY THAI TRUYỀN NHIỄM
DO BRUCELLA
Animal diseases – Diagnostic procedure –

Part xx: Brucellosis

HÀ NỘI – 2018
 TCVN XXXX:2018

Lời nói đầu

TCVN: 2018 do Chi cục Thú y vùng II - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường
Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

2
 TCVN XXXX:2018

TCVN XXXX :2018

Bệnh động vật – Quy trình chẩn đoán –

Phần xx: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucella
Animal diseases – Diagnostic procedure – Part xx: Brucellosis

CẢNH BÁO  Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các
thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an
toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các
thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định
trước khi sử dụng tiêu chuẩn.
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh sảy thai truyền nhiễm đối với động vật.
2 Thuật ngữ, định nghĩa và chữ viết tắt
Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:
2.1 Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucella (Brucellosis): Là bệnh truyền nhiễm mãn tính
chung trên nhiều loài gia súc và lây sang người do vi khuẩn thuộc giống Brucella gây ra. Bệnh
thường gây viêm đường sinh dục, sảy thai, chết lưu thai và bất dục.
CHÚ THÍCH: Các vi khuẩn thuộc giống Brucella là cầu trực khuẩn bắt màu Gram âm. Đường truyền lây của bệnh sảy
thai truyền nhiễm do Brucella chủ yếu qua thức ăn nước uống, qua đường giao phối, qua sữa và các sản phẩm từ thịt,
sữa… bị nhiễm mầm bệnh.

2.2 Bổ thể (Complement-C): Là một phức hợp phân tử huyết thanh, một vài thành phần của bổ
thể có thể tự gắn với kháng nguyên đặc hiệu tạo thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể.
2.3 Dung huyết tố (Haemolysin-H): Huyết thanh của động vật gây tối miễn dịch kháng tế bào
hồng cầu khác loài ở mức hiệu giá cao và gây dung giải hồng cầu tương ứng khi có sự xuất hiện
của bổ thể.
2.4 Chữ viết tắt
- OIESS (OIE International Standard Serum): Huyết thanh chuẩn quốc tế theo qui định của Tổ
chức Thú y thế giới;
- ADN (acid deoxyribonucleic): axit deoxyribonucleic;
- Ct (Threshold Cycle): Chu kỳ ngưỡng.
- PBS (phosphate buffered saline): dung dịch đệm phosphat;
- PCR (polymerase chain reaction): phản ứng chuỗi polymerase;
- ELISA (enzymed linked immunosorbent assay): phép thử miễn dịch liên kết enzyme;
- RBT (Rose Bengal Test): Phản ứng ngưng kết hoa hồng;
- MRT (Milk Ring Test): Phản ứng vòng sữa;
- RBT (Rose Bengal Test): Phản ứng ngưng kết hoa hồng;
- CFT (Complement Fixation Test): Phản ứng kết hợp bổ thể;
- VB (Veronal buffer): Dung dịch muối đệm VB;

3
 TCVN XXXX:2018

- MHD (Minimum haemolytic dose): Liều dung huyết tối thiểu;

- ICFTU (International Complement Fixation Test Unit): Đơn vị phản ứng kết hợp bổ thể quốc tế.
3 Thuốc thử và vật liệu thử
Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng
hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có RNase và ADNse, trừ khi có quy định khác.
3.1 Thuốc thử và vật liệu thử cho phương pháp nuôi cấy, phân lập
3.1.1 Bộ thuốc nhuộm Gram
3.1.2 Thuốc nhuộm Ziehl - Neelsen
3.1.3 Metanol, 95%
3.1.4 Thạch TSA (trypticase soy agar hoặc tryptone soy agar) 
3.1.5 Thạch máu
3.1.6 Môi trường Farrell’s cải tiến
3.1.7 Môi trường CITA
3.1.8 Môi trường canh thang Brucella
3.1.9 Môi trường thạch Columbia
3.1.10 Dung dịch PBS, pH trong khoảng 7.0±0.2
3.1.11 Kháng huyết thanh chuẩn đa dòng hoặc đơn dòng đặc hiệu
3.1.12 Kít thử phản ứng Oxidase
3.1.13 Môi trường urê cơ bản
3.2 Thuốc thử và vật liệu thử cho phương pháp realtime PCR
3.2.1 Các cặp mồi, mẫu dò đặc hiệu cho Brucella sp, Brucella abortus, Brucella melitensis,
Brucella suis
3.2.2 Kít chiết tách ADN
3.2.3 Kít nhân gen
3.2.4 Đối chứng dương chuẩn, với giá trị Ct đã biết
3.3 Thuốc thử và vật liệu thử cho phản ứng huyết thanh học
3.3.1 Huyết thanh chuẩn dương (MRI-BRU, ID-vet)1, hoặc tương đương được pha loãng tới một
nồng độ nhất định để đưa ra hiệu giá dương tính dự kiến.
3.3.2 Kháng nguyên chuẩn Brucella abortus biovar 1, strain 99 hoặc S1119-3, nhuộm màu rose
bengal.
3.3.3 Kháng nguyên Brucella abortus biovar 1, strain 99 hoặc S1119-3, cho phản ứng ngưng kết,
nhuộm màu haematoxylin, bảo quản ở nhiệt độ 5oC±3oC, dùng cho phản ứng ngưng kết vòng sữa.
3.3.4 Kháng nguyên Brucella abortus biovar 1, strain 99 hoặc S1119-3 (AG-BRU, hãng ID-vet)
dùng cho phản ứng kết hợp bổ thể và phản ứng ngưng kết trong ống nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ
5oC±3oC.
3.3.5 Dung dịch EDTA-PBS, pH 7,2
3.3.6 Bổ thể (C), được chuẩn bị từ chuột lang (CPLT, hãng ID-vet) chứa 6 đơn vị dung huyết tố
50% (6CH50).
3.3.7 Hồng cầu cừu (SRBC)
3.3.8 Dung huyết tố (Haemolysin) là kháng thể thỏ kháng tế bào hồng cầu cừu.

1
Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà
cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.

4
 TCVN XXXX:2018

3.3.9 Hệ thống dung huyết: trộn một lượng bằng nhau của hồng cầu cừu (SRBC) 2.5% và 2MHD
dung huyết tố.
3.3.10 Dung dịch muối đệm VB
3.3.11 Kít ELISA
4 Thiết bị và dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau: 
4.1 Thiết bị và dụng cụ dùng chung
4.1.1 Tủ lạnh, duy trì nhiệt độ từ 2-8oC
4.1.2 Tủ lạnh âm sâu, duy trì nhiệt độ tới âm 30oC
4.1.3 Buồng cấy an toàn sinh học cấp I, II
4.1.4 Máy lắc trộn votex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 đến 2500 vòng/phút.
4.1.5 Máy ly tâm lạnh, có thể đạt tốc độ 14.000 vòng/phút
4.1.6 Nồi hấp, có thể duy trì nhiệt độ 121oC
4.1.7 Pipet đơn kênh, thể tích hút từ 100µl đến 1000µl, từ 1µl đến 10µl , từ 5 µl đến 50 µl;  20µl
đến 200µl.
4.1.8 Cối chày sứ, vô trùng
4.1.9 Lọ thủy tinh, sạch và vô trùng
4.1.10 Pipet 5 ml và 10 ml, vô trùng
4.1.11 Túi lynon, sạch và vô trùng
4.2 Thiết bị, dụng cụ cho nuôi cấy phân lập vi khuẩn
4.2.1 Kính hiển vi, có độ phóng đại 100X
4.2.2 Tủ ấm CO2, có thể duy trì ở nhiệt độ 37oC±1oC, có bổ sung từ 5% đến 10% CO2
4.2.3 Máy đồng nhất mẫu Stomacher
4.2.4 Lam kính, sạch và vô trùng
4.2.5 Ống nghiệm thủy tinh, sạch và vô trùng
4.2.6 Đĩa lồng petri, đường kính 9 mm, sạch và vô trùng
4.2.7 Đèn cồn
4.2.8 Que cấy, vô trùng
4.3 Thiết bị và dụng cụ dùng cho phương pháp realtime PCR
4.3.1 Máy realtime PCR
4.3.2 Máy spindown,
4.3.3 Ống PCR, 0.2 ml
4.3.4 Ống eppendorf, không có RNase và DNase
4.4 Thiết bị và dụng cụ dùng cho phản ứng huyết thanh học
4.4.1 Tủ ấm, duy trì nhiệt độ ở 37oC±2oC
4.4.2 Bể điều nhiệt, duy trì nhiệt độ ở 37oC±2oC
4.4.3 Bể điều nhiệt, duy trì nhiệt độ ở 59oC±2oC
4.4.4 Máy lắc đĩa 96 giếng
4.4.5 Máy đọc ELISA, bước sóng 450 nm

5
 TCVN XXXX:2018

4.4.6 Đĩa 96 giếng, đáy chữ U

4.4.7 Pipet đa kênh, thể tích hút từ 25µl
4.4.8 Bản phiến kính, que trộn mẫu, đồng hồ phòng thí nghiệm
5 Chẩn đoán lâm sàng
5.1 Đặc điểm dịch tễ
Bệnh sảy thai truyền nhiễm là bệnh lây sang người, ở nhiều loài động vật khác và động vật hoang
dã. Có ba chủng chính gây bệnh là:
- Brucella abortus (biovars 1 - 6) gây bệnh chủ yếu ở gia súc, loài bò, hươu nai. 
- Brucella suis (biovars 1 - 5) gây bệnh chủ yếu ở lợn.
- Brucella melitensis (biovars 1 - 3) gây bệnh chủ yếu ở dê, cừu, đôi khi xảy ra trên cả trâu, bò.
Tất cả các chủng trên đều không có vật chủ trung gian mà chúng có thể lây bệnh qua các loài
động vật khác khi có điều kiện thích hợp như qua tiêu hóa, giao phối, con bú mẹ...
- Đường truyền lây của bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucella chủ yếu qua thức ăn nước uống,
qua đường giao phối, qua sữa và các sản phẩm từ thịt, sữa… bị nhiễm mầm bệnh.
- Bệnh có hầu hết ở các nước trên thế giới trừ những nước đã thanh toán được bệnh này.
5.2 Triệu chứng lâm sàng
5.2.1 Bệnh sảy thai truyền nhiễm trên trâu bò. 
- Con cái: Sảy thai, đẻ non, sát nhau, bất dục. Hiện tượng sảy thai thường vào tháng thứ 6 đến
tháng thứ 8.
- Con đực: Viêm tinh hoàn và mào tinh hoàn, bao dịch hoàn sưng to, túi tinh sưng, sưng khớp gối.
5.2.2 Bệnh sảy thai truyền nhiễm trên dê. 
- Con cái: Sảy thai ở giai đoạn cuối, chân đi khập khiễng.
- Con đực: Viêm tinh hoàn.
5.2.3 Bệnh sảy thai truyền nhiễm trên cừu
- Con cái: Sảy thai vào giai đoạn cuối, con sinh ra yếu hoặc chết.
- Con đực: Bao dịch hoàn sưng to, gia súc sốt cao, ủ rũ, mào tinh hoàn sưng to và rắn, tinh hoàn
teo nhỏ.
5.2.4 Bệnh sảy thai truyền nhiễm trên lợn 
- Con cái: Sảy thai, thường bị ở tuần chửa thứ 4 đến tuần 12. Có hiện tượng bất dục, tỷ lệ lợn con
sinh ra bị chết cao.
- Con đực: Viêm sưng hoặc hoại tử tinh hoàn, què hoặc liệt chân sau, viêm tinh hoàn và mào tinh
hoàn.
5.3 Bệnh tích đại thể
Bệnh tích ở các loài đều gần giống nhau.
- Con cái: Bệnh tích trên bào thai của những con vật sảy thai: vỏ bọc thai dày lên có nhiều điểm
xuất huyết. Trên núm nhau có nhiều điểm hoại tử. Nhau thai có những điểm hoại tử dạng hạt màu
vàng trắng, bờ mặt đục. Núm nhau bị biến màu, sờ vào mềm nhũn, có mủ. Cuống rốn có mủ, điểm
hoại tử lấm tấm.
- Con đực: Dịch thượng hoàn sưng to gấp 2 lần đến 3 lần bình thường, lượng tinh giảm, màng
ngoài đường sinh dục dày, có khi bị viêm khớp u mềm có mủ.
- Cơ quan phủ tạng: Gan lách sưng hay hoại tử.
6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6
 TCVN XXXX:2018

6.1 Lấy mẫu, bảo quản

6.1.1 Lấy mẫu
6.1.1.1 Gia súc mới chết.
Bệnh phẩm có thể là nhau thai, thai bị sảy, nước ối, hạch vú, hạch vùng xoang chậu, tuyến sữa, tử
cung, dịch tiết âm đạo, tinh hoàn, dịch khớp.
6.2.1.2 Gia súc sống
- Máu: Lấy máu tĩnh mạch vào buổi sáng trước khi cho gia súc ăn. Lấy khoảng 10 ml máu vào xi
lanh hoặc ống đựng mẫu chân không.
- Dịch tiết từ âm đạo: Dùng tăm bông vô trùng (swab) để thấm dịch và cho vào ống nghiệm vô
trùng (4.2.5).
- Dịch viêm khớp và dịch áp xe: Dùng tăm bông vô trùng (swab) để thấm dịch và cho ống nghiệm
vô trùng (4.2.5).
- Tinh dịch: Lấy khoảng 3 ml cho vào lọ (4.1.9), hoặc ống nghiệm vô trùng (4.2.5).
- Sữa tươi:
+ Đối với cá thể: Vệ sinh sạch bầu và cá núm vú, loại bỏ những giọt sữa đầu tiên, sau đó lấy
khoảng 10-20 ml sữa cho vào lọ vô trùng (4.1.9).
+ Đối với quần thể: Lấy khoảng 10-20ml sữa tươi từ mỗi thùng hoặc téc chứa sữa cho vào lọ vô
trùng (4.1.9).
- Sản phẩm sữa: Lấy khoảng 500g pho mai /mẫu cho vào túi nylon (4.1.11) đảm bảo vô trùng.
6.1.2 Bảo quản và vận chuyển
Mẫu bệnh phẩm gửi đi xét nghiệm phải được bảo quản trong thùng lạnh ở nhiệt độ 5oC±3oC và
vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt. Tốt nhất là vận chuyển ngay trong
ngày.

CHÚ THÍCH: Tất cả các mẫu phải được dán nhãn, ghi kí mã hiệu và gửi kèm theo Phiếu gửi mẫu bệnh phẩm và các
thông tin dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của ca bệnh.

6.2 Phát hiện vi khuẩn Brucella

6.2.1 Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn
Phương pháp này ít áp dụng do mất nhiều thời gian, nhưng khi bắt buộc phân lập cần phải chú ý
đến các biện pháp an toàn sinh học vì đây là bệnh lây sang người.
6.2.1.1 Chuẩn bị mẫu và môi trường
6.2.1.1.1 Xử lý mẫu
- Mẫu mô: Lấy khoảng 5 g mẫu, loại bỏ các mô mỡ và các tổ chức liên kết. Mẫu được cắt thành
những miếng nhỏ, nghiền bệnh phẩm bằng cối chày sứ vô trùng (4.1.8) với 5ml dung dịch thành
huyễn dịch. Huyễn dịch dùng để nuôi cấy phân lập Brucella.
- Dịch bài xuất, bài tiết: Votex kỹ ống chứa tăm bông.
- Sữa: Cho vào ống kín đem ly tâm ở 2000 g trong 15 phút. Hớt bỏ váng sữa vào dung dịch sát
trùng (tránh bị xáo trộn lớp kem). Lớp kem còn lại và lớp chất lắng dưới đáy được trộn lẫn với
nhau.
6.2.1.1.2 Chuẩn bị môi trường
Việc phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Brucella được thực hiện chủ yếu trên môi trường thạch. Đây là
dạng môi trường tốt nhất để vi khuẩn phát triển một cách thuần khiết và hạn chế khả năng tạp
nhiễm vi khuẩn khác. Tuy nhiên, cũng có thể sử dụng các môi trường lỏng để phân lập vi khuẩn
với những mẫu là tổ chức hoặc cho mục đích làm giàu vi khuẩn.

7
 TCVN XXXX:2018

- Môi trường thạch cơ bản: Có thể sử dụng các môi trường sau đây để phân lập Brucella: Thạch
TSA (3.1.4), thạch máu (3.1.5, phụ lục A.7), thạch Columbia (3.1.8). Những loại môi trường trên
thường được bổ sung từ 2% đến 5% huyết thanh trâu, bò hoặc ngựa.
- Môi trường thạch chọn lọc: Môi trường Farrell’s cải tiến (xem Phụ lục A.4) hoặc CITA (xem Phụ
lục A.5) được sử dụng rộng rãi để phân lập Brucella.
- Môi trường tăng sinh: Canh thang Brucella (xem Phụ lục A.6) thường sử dụng để làm giàu đối
với một số loại mẫu như sữa và sản phẩm của sữa hoặc các loại dịch thẩm xuất của con vật nghi
bệnh.
6.2.1.2 Các bước thực hiện
6.2.1.2.1 Cấy mẫu
- Dùng pipet (4.1.7) lấy 0,1-0,2 ml hỗn dịch bệnh phẩm sau khi đã xử lý (xem 6.2.1.1) cấy láng
trên bề mặt đĩa thạch chọn lọc hoặc trên môi trường cơ bản, ủ ấm ở 37oC trong tủ ấm CO2 (4.2.2)
với 5% đến 10% khí CO2 trong thời gian từ 3 -10 ngày.
- Đối với các mẫu sữa hay dịch tiết, hoặc các mẫu phomat khuyến cáo tăng sinh trên môi trường
canh thang Brucella (xem Phụ lục A.6), ủ ấm ở 37 oC trong tủ ấm CO2 (4.2.2) với 5% đến 10% khí
CO2 trong khoảng 3-7 ngày, sau đó cấy chuyển sang môi trường chọn lọc.
CHÚ Ý: Để tăng độ nhạy của phương pháp, phòng thí nghiệm nên kết hợp hai môi trường chọn
lọc Farrell’s cải tiến và môi trường CITA. Mỗi loại môi trường cần cấy từ 2 đến 3 đĩa thạch.
6.2.1.2.2 Ủ mẫu và đọc kết quả
- Quan sát đĩa thạch sau 4 ngày nuôi cấy:
+ Trên môi trường Farrell’s cải tiến: Mặt thạch sẽ hình thành những khuẩn lạc có kích thước
khoảng 1-2 mm, tròn, cong lồi, rìa gọn. Nhìn từ trên xuống, khuẩn lạc có màu trắng đục như màu
ngọc trai, sau đó khuẩn lạc to dần, màu đậm hơn.
+ Trên môi trường thạch CITA: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên môi trường CITA tương tự như
trên môi trường thạch Farrell’s cải tiến, nhưng màu sắc khuẩn lạc giống như màu mật ong nhạt.
- Lấy khuẩn lạc nghi ngờ, nhuộm theo phương pháp Gram (xem Phụ lục B.2) hoặc phương pháp
Ziehl - Neelsen (xem Phụ lục B.1), để quan sát đặc điểm hình thái, tính chất bắt màu của vi khuẩn.
- Khuẩn lạc nghi ngờ được tiếp tục ria cấy ra môi trường thạch TSA (3.1.4) hoặc thạch máu (3.1.5,
Phụ lục A.7) để thuần khiết vi khuẩn. Ủ ấm ở 37oC trong tủ ấm CO2 với 5% đến 10% khí trong
khoảng 3-7 ngày. Tiến hành thực hiện giám định sinh hóa và phản ứng ngưng kết huyết thanh
(xem 6.2.1.2.4).
6.2.1.2.3 Quan sát hình thái vi khuẩn
- Tiêu bản sau khi nhuộm để khô, xem trên kính hiển vi với độ phóng đại 100X (4.2.1). Nếu bệnh
phẩm có Brucella sẽ thấy:
+ Vi khuẩn bắt màu hồng (màu của vi khuẩn Gram âm) khi nhuộm bằng phương pháp nhuộm
Gram. Vi khuẩn sẽ bắt màu đỏ trên nền xanh da trời khi nhuộm bằng phương pháp Ziehl -
Neelsen.
+ Là cầu trực khuẩn nhỏ hoặc đa hình thái (hình trứng, hình gậy,…). Chúng thường nằm dải rác
thành những tế bào đơn như những hạt cát mịn đôi khi tập trung thành từng cắp hoặc chuỗi nhỏ.
+ Kích thước của Brucella vào khoảng (từ 0,5 µm đến 0,7 µm) x (từ 0,6 µm đến 1,5 µm), không
hình thành nha bào và giáp mô.
6.2.1.2.4 Giám định sinh hoá và phản ứng ngưng kết huyết thanh (Xem Phụ lục C)
- Phản ứng urease (xem Phụ lục C.2).
- Phản ứng oxidase (xem Phụ lục C.3).
- Phản ứng ngưng kết: Vi khuẩn phân lập được (xem 6.2.1.2.2) được kiểm tra bằng phản ứng
ngưng kết với kháng huyết thanh đa dòng kháng Brucella hoặc kháng huyết thanh đơn dòng đặc
hiệu (xem Phụ lục C.4).

8
 TCVN XXXX:2018

6.2.1.2.5 Giải thích kết quả

- Chủng vi khuẩn có thể được coi là Brucella nếu có các đặc điểm sau:
+ Phát triển tốt trên môi trường Farrell’s cải tiến hoặc môi trường CITA.
+ Khuẩn lạc chỉ xuất hiện sau 4 ngày nuôi cấy trong điều kiện có bổ sung CO 2 với các đặc điểm:
khuẩn lạc có kích thước khoảng 0.5 mm-2 mm, hình tròn, cong lồi, trong suốt, mặt nhẵn, rìa gọn.
+ Chủng vi khuẩn là cầu trực khuẩn, bắt màu gram âm, có phản ứng oxidaza/urease dương tính
và có ngưng kết với kháng huyết thanh chuẩn (xem Phụ lục C.1).
- Mẫu được coi là âm tính khi không có vi khuẩn mọc trên các môi trường thạch nuôi cấy.
6.2.2 Phương pháp Realtime PCR
Phát hiện vi khuẩn Brucella bằng kỹ thuật Realtime PCR thực hiện theo các bước sau: Sàng lọc
Brucella sp, nếu mẫu dương tính, tiếp tục thực hiện giám định loài (B. abortus, B. melitensis, B.
suis).
6.2.2.1 Xử lý mẫu
-. Mẫu mô: Mẫu được lấy đảm bảo vô trùng. Mẫu được loại bỏ các mô mỡ và các tổ chức liên kết,
cắt thành những miếng nhỏ, nghiền bệnh phẩm bằng cối chày sứ vô trùng thành huyễn dịch với
dung dịch PBS (Phụ lục A.1). Huyễn dịch dùng để tách chiết ADN theo Phụ lục D.
- Dịch tiết đường sinh dục: Mẫu swab trong môi trường PBS (Phụ lục A.1) được votex (4.1.4).
Huyễn dịch sau khi votex được sử dụng để tách chiết ADN.
- Mẫu sữa tươi: Mẫu được lấy đảm bảo vô trùng, tránh tạp nhiễm chéo. Mẫu được ly tâm 3000
rpm/15 phút. Loại bỏ phần nước phía trên. Lấy phần kem sữa để tách chiết ADN.
- Mẫu phomai: Mẫu được đồng nhất với dung dịch PBS (Phụ lục A.1) bằng máy Stomacher
(4.2.3). Sau khi đồng nhất, lấy lớp nổi phía trên được dùng để nuôi cấy tăng sinh trong môi trường
canh thang Brucella (Phụ lục A.6). Ủ 37oC trong tủ ấm CO2 (4.2.2) với 5% đến 10% khí trong
khoảng 72 giờ. Lấy 01 ml canh thang để tách chiết ADN theo Phụ lục D.
6.2.2.2 Chiết tách ADN
Mẫu sau khi được xử lý (xem 6.2.2.1), tiến hành triết tách ADN bằng kit thương mại (tham khảo
phụ lục D). Mẫu ADN thu được sau quá trình chiết tách dùng cho phản ứng realtime PCR
6.2.2.3. Chuẩn bị mồi và mẫu dò
Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.3.1) theo phương pháp realtime-PCR
khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của Brucella sử dụng cặp mồi xuôi và mồi ngược. Trình tự cặp mồi
được nêu trong Bảng E.1, Phụ lục E.
Chuẩn bị mồi như sau:
- Chuẩn bị mồi gốc: Mồi gốc và mẫu dò gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng
máy spindown ở gia tốc 6000 g trong 30s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn
nguyên. Lần đầu tiên dùng dung dịch đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 mM làm mồi gốc
và mẫu dò gốc.
- Chuẩn bị mồi sử dụng: Mồi sử dụng ở nồng độ 20 mM (20 ml mồi gốc được pha với 80 ml nước).
Mẫu dò được sử dụng ở nồng độ 6 mM (6ml mẫu dò gốc được pha với 94 ml nước. Trộn cùng 1 thể
tích mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò sau khi pha thành hỗn hợp để tiện khi sử dụng.
6.2.2.4 Thực hiện phản ứng
Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị và bộ kit thương mại theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ như bộ kít
TaqPath™ qPCR Master Mix, hãng ABI, Cat no: A152972
Pha hỗn hợp nhân gen (Master mix) theo hướng dẫn của bộ kit. Lượng hỗn hợp nhân gen dùng
cho 1 phản ứng như Phụ lục E.2

2
Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà
cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.

9
 TCVN XXXX:2018

Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp nguyên liệu:

- Hỗn hợp nhân gen: Cho 20 l vào ống PCR 0,2 ml (4.3.3);
- Mẫu ADN dương chuẩn (3.2.4): Cho 5 l vào ống PCR 0,2 ml;
- Mẫu đối chứng âm: Cho 5 l nước cất vào ống PCR 0,2 ml;
- Mẫu xét nghiệm: Cho 5 l ADN vừa tách chiết vào ống PCR;
- Đặt ống PCR vào máy realtime PCR (4.3.1);
- Chu trình nhiệt chạy phản ứng được cài đặt theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit sử dụng cho
phản ứng. Có thể tham khảo chu trình nhiệt theo phụ lục E.3
CHÚ THÍCH:
1) Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp
phản ứng.
2) Để tiết kiệm chi phí xét nghiệm, tiến hành xét nghiệm sàng lọc phát hiện Brucella sp (gen IS711) trước, nếu âm tính
thì kết luận âm tính. Trường hợp dương tính với Brucella sp, tiến hành xác định loài bằng các cặp primers/probe đặc
hiệu tương ứng cho loài (xem Phụ lục E).

6.2.2.5 Đọc kết quả

Phản ứng được công nhận: mẫu đối chứng dương tính (được chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct 
35 (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm không có Ct.
Với điều kiện phản ứng trên:
1) Mẫu có giá trị Ct  35 được coi là dương tính;
2) Mẫu không có giá trị Ct là âm tính;
3) Mẫu có giá trị Ct  40 và > 35 được coi là nghi ngờ;
Những mẫu nghi ngờ này cần được xét nghiệm lại lần 2 để khẳng định và kết luận cuối cùng.
6.3 Chẩn đoán huyết thanh học
Là phương pháp phổ biến nhất được áp dụng cho việc đánh giá đàn gia súc được kiểm tra là có
hay không bệnh sảy thai truyền nhiễm. Các phản ứng huyết thanh dùng để kiểm tra toàn đàn,
kiểm tra định kỳ và kiểm tra mẫu huyết thanh trong trường hợp có hiện tượng gia súc bị sảy thai.
6.3.1 Phản ứng ngưng kết hoa hồng (RBT)
6.3.1.1 Nguyên lý phản ứng
Kháng thể có trong huyết thanh kết hợp với kháng nguyên Brucella đã được gắn màu để tạo
thành phức hợp kháng nguyên kháng thể mà có thể quan sát thấy (phức hợp này là những hạt
chấm màu đỏ trong dung dịch trong suốt).
6.3.1.2. Tiến hành phản ứng
- Nguyên liệu phản ứng và mẫu huyết thanh để ở nhiệt độ phòng (22oC ± 4oC) khoảng 1 giờ trước
khi thực hiện phản ứng.
- Lắc đều lọ kháng nguyên một cách nhẹ nhàng để kháng nguyên chắc chắn được đồng nhất.
- Nhỏ 30 µl mẫu huyết thanh lên trên phiến kính;
- Nhỏ 30 µl kháng nguyên lên huyết thanh;
- Trộn đều mẫu huyết thanh với kháng nguyên bằng que trộn;
- Lặp lại các bước trên với huyết thanh đối chứng âm, dương;
- Nhẹ nhàng lắc tròn phiến kính trong 2 phút (có thể sử dụng máy lắc).
Quan sát sự ngưng kết sau 2 phút kể từ lúc bắt đầu lắc là khoảng thời gian tốt nhất để đánh giá
kết quả.

10
 TCVN XXXX:2018

CHÚ Ý: Khi tiến hành phản ứng, phải thực hiện đồng thời cả mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng
dương.
6.3.1.3 Đánh giá kết quả
- Phản ứng âm tính: Không có sự ngưng kết.
- Phản ứng dương tính: Có các hạt ngưng kết lấm tấm màu hồng.
6.3.2 Phản ứng vòng sữa (MRT)
6.3.2.1 Nguyên lý phản ứng
Kháng thể có trong sữa kết hợp với kháng nguyên Brucella đã được gắn màu để tạo thành phức
hợp kháng nguyên kháng thể. Khi phức hợp này được tạo thành nó kéo theo lớp chất béo có
trong sữa nổi lên trên và tạo thành vòng xanh tím. Phương pháp này chỉ áp dụng cho sàng lọc
bệnh sảy thai truyền nhiễm trên đàn bò sữa.
6.3.2.2 Tiến hành phản ứng
- Trước khi làm xét nghiệm, mẫu sữa và lượng kháng nguyên chuẩn (3.3.3) đủ dùng cho xét
nghiệm phải để ở nhiệt độ phòng (22oC ±4oC).
- Cho 1 ml mẫu sữa vào ống nghiệm thủy tinh vô trùng (4.2.5);
- Lắc đều kháng nguyên và cho 50 µl kháng nguyên Brucella đã gắn màu vào mẫu và trộn đều một
cách cẩn thận;
- Đặt vào tủ ấm 37oC trong 1 h hoặc tủ lạnh ở nhiệt độ 5oC±3oC (4.1.1) từ 18h đến 20h, sau đó đọc
kết quả;
CHÚ THÍCH:
1) Đối với mẫu sữa lấy trong téc sữa, tùy thuộc vào quần thể bò sữa mà lượng mẫu dùng cho phản ứng có thể khác
nhau: Đàn <150 con, dùng 1 ml mẫu sữa; đàn từ 150-450 con, dùng 2 ml mẫu sữa; đàn từ 451-700 con, dùng 3 ml mẫu
sữa cho phản ứng MRT.
2) Khi sử dụng 2-3 ml sữa dùng cho phản ứng MRT theo quần thể đàn bò sữa, thì thêm 0.1 ml kem sữa âm tính vào
mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm.
3) Không sử dụng mẫu sữa non, mẫu sữa từ bò bị viêm vú để tiến hành xét nghiệm.

6.3.2.3 Đánh giá kết quả

- Dương tính: Hình thành lớp vòng sữa màu xanh tím bằng hoặc đậm hơn màu của lớp sữa phía
dưới. 
- Âm tính: Lớp kem phía trên có màu xanh tím nhạt hơn màu của lớp sữa phía dưới.
CHÚ Ý: Hai phản ứng trên chỉ là phản ứng sàng lọc để phát hiện sự có mặt hay không của
kháng thể. Nếu phản ứng cho kết quả dương tính thì phải tiến hành kiểm tra lại bằng các phản
ứng huyết thanh học khác.
6.3.3 Phản ứng ngưng kết trong ống nghiệm (EDTA-Tube agglutination test)
6.3.3.1 Nguyên lý phản ứng
Kháng thể có trong huyết thanh kết hợp với kháng nguyên Brucella để tạo thành phức hợp kháng
nguyên kháng thể mà có thể quan sát thấy bằng mắt thường. Phản ứng này chỉ sử dụng cho chẩn
đoán bệnh sảy thai truyền nhiễm ở trâu, bò.
6.3.3.2 Tiến hành phản ứng
Xem phụ lục F.1
6.3.3.3 Đánh giá kết quả (xem Phụ lục F.2)
- Đối với đàn không tiêm phòng vắc xin:
+ Mẫu có hiệu giá ngưng kết ≥1/100 được coi là dương tính với kháng thể Brucella;
+ Mẫu có hiệu giá ngưng kết ≤ 1/25 được coi là âm tính với kháng thể Brucella khi;
+ Mẫu có hiệu giá ngưng kết > 1/25 và < 1/100 được coi là nghi ngờ.

11
 TCVN XXXX:2018

- Đối với đàn tiêm phòng vắc xin:

+ Mẫu có hiệu giá ngưng kết ≥1/200 được coi là dương tính với kháng thể Brucella;
+ Mẫu có hiệu giá ngưng kết ≤ 1/50 được coi là âm tính với kháng thể Brucella khi;
+ Mẫu có hiệu giá ngưng kết > 1/50 và < 1/200 được coi là nghi ngờ.
Những mẫu nghi ngờ này cần được xét nghiệm lại lần 2 hoặc bằng phương pháp khác để khẳng
định và kết luận cuối cùng.
6.3.4. Phương pháp ELISA
6.3.4.1. Nguyên lý phản ứng
Dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym rồi cho kết hợp trực tiếp hay gián tiếp với
kháng nguyên. Sau đó cho cơ chất (chất nền) vào, cơ chất sẽ kết hợp với enzym đã gắn tạo nên
màu.
6.3.4.2. Tiến hành phản ứng
Theo hướng dẫn của nhà sản xuất KIT.
6.3.4.3. Đánh giá kết quả
Theo hướng dẫn của nhà sản xuất KIT.
6.3.5. Phản ứng kết hợp bổ thể (CFT)
6.3.5.1. Nguyên lý phản ứng
Kháng thể trong huyết thanh kết hợp với kháng nguyên và bổ thể sẽ không dung giải tế bào hồng
cầu cừu vì vậy hiện tượng dung huyết không xảy ra. Nếu huyết thanh không có kháng thể, bổ thể
sẽ gây dung giải hồng cầu và hiện tượng dung huyết tố sẽ xảy ra.
6.3.5.2. Chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng CFT.
6.3.5.2.1. Kháng nguyên.
- Vi khuẩn Brucella abortus biovar 1, strain 99 (AG-BRU, ID-vet). Kháng nguyên được pha loãng
tới nồng độ làm việc và bảo quản theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kháng nguyên không được
để ở nhiệt độ ≤1oC.
- Kháng nguyên phải đảm bảo yêu cầu của tiêu chuẩn OIEISS như sau:
+ Kháng nguyên được pha loãng trong dung dịch nước sinh lý (NaCl 0.85% (m/v)) và phenol ở
nồng độ 0.5% hoặc dung dịch VB.
+ Cho phản ứng ức chế dung huyết 50% với huyết thanh chuẩn ở độ pha loãng 1/200.
6.3.5.2.2 Huyết thanh chuẩn.
Huyết thanh chuẩn của hãng ID-vet (MRI-BRU, ID-vet), hoặc tương đương, có 1000 đơn vị
ICFTU/ml, được pha loãng tới một nồng độ nhất định để đưa ra hiệu giá dương tính dự kiến.
6.3.5.2.3 Bổ thể (C).
- Bổ thể của hãng ID-vet (CPLT, ID-vet), hoặc tương đương, được hoàn nguyên theo hướng dẫn
của nhà sản xuất. Chuẩn độ bổ thể chứa 6 đơn vị dung huyết tố 50% (CH50) (xem Phụ lục G.2)
- Bổ thể sau khi hoàn nguyên, nếu không sử dụng ngay phải bảo quản ở nhiệt độ 5 oC±3oC cho tới
khi thực hiện phản ứng trong ngày. Phần còn lại bảo quản ở nhiệt độ ≤ -16oC.
6.3.5.2.4 Hồng cầu cừu (SRBC) 50% được pha loãng 1/20 trong dung dịch VB (Phụ lục A.3) để
được nồng độ 2.5%.
6.3.5.2.5 Dung huyết tố (Haemolysin).
Chuẩn độ dung huyết tố tới hiệu giá 2MHD100 (xem Phụ lục G.1)
6.3.5.3 Tiến hành phản ứng
- Vô hoạt mẫu huyết thanh và huyết thanh đối chứng ở 59 oC±1oC /30 phút trong bể điều nhiệt
(4.4.2).

12
 TCVN XXXX:2018

Tiến hành phản ứng theo sơ đồ tại Bảng G.3, Phụ lục G.3.
- Cho 50 µL dung dịch VB vào giếng 1 và 25 µL dung dịch VB vào giếng 2,4,5,6,7,8.
- Cho 50 µL huyết thanh kiểm tra (đã vô hoạt 59oC±1oC /30 phút) vào giếng 1, trộn đều.
- Chuyển 25 µL huyết thanh đã pha loãng từ giếng 1 sang giếng 2, 3 và 4.
- Trộn đều giếng 2 và hút bỏ đi 25 µL.
- Bổ sung thêm 25 µL dung dịch VB vào giếng 1 và 2 để bù vào lượng còn thiếu (Giếng 1 và 2 là
đối chứng kháng bổ thể).
- Trộn đều huyết thanh và dung dịch VB ở giếng 4 và chuyển từ giếng 4 sang giếng 5, trộn đều và
chuyển tiếp tục đến giếng 8 rồi hút bỏ 25 l.
- Cho 25 l kháng nguyên ở nồng độ làm việc vào tất cả các giếng, trừ 02 giếng đầu tiên.
- Cho 25 l bổ thể (6CH50) vào tất cả các giếng.
- Ủ đĩa phản ứng ở 4oC qua đêm, hoặc 37oC±2oC trong 30 phút. Nếu ủ qua đêm ở 4 oC thì trước
khi đem làm tiếp phải cho vào tủ ấm 37oC (4.4.1) trong khoảng 10 phút.
- Chuẩn bị hệ thống dung huyết (SRBCs): Trộn 1 phần hồng cầu cừu 2.5 % với 1 phần dung huyết
tố 2 MHD100. Lắc nhẹ để trộn đều, để ở nhiệt độ phòng trong 20 phút trước khi tiến hành phản
ứng và thỉnh thoảng lại lắc nhẹ lên.
- Cho 50 µl hệ thống dung huyết vào tất cả các giếng, trộn đều và ủ ấm trong ở 37oC trong 30
phút.
- Ly tâm đĩa ở gia tốc 1000g/10 phút, ở nhiệt độ 5 oC±3oC hoặc để ở nhiệt độ 5 oC±3oC trong 2-3
giờ để hồng cầu không bị dung giải lắng xuống đáy giếng. Khi hết thời gian phản ứng thì tiến hành
đọc kết quả.
CHÚ Ý: Khi tiến hành phản ứng phải có một mẫu đối chứng dương (dùng huyết thanh dương tính
chuẩn có độ dương tính thấp) và mẫu đối chứng âm tính được tiến hành song song với mẫu kiểm
tra. Cách làm tương tự như với mẫu huyết thanh.
6.3.5.4 Đánh giá kết quả
- Phản ứng có giá trị khi:
+ Đối chứng kháng nguyên: 100% dung huyết
+ Đối chứng bổ thể: 100% dung huyết
+ Đối chứng hệ thống dung huyết: 0% dung huyết
+ Đối chứng âm: 100% dung huyết
+ Đối chứng dương: Có hiệu giá kháng thể trong ngưỡng đã biết.
+ Đối chứng huyết thanh kháng bổ thể: 100% dung huyết ở giếng 1 và 2.
- Đọc kết quả: Kết quả được đánh giá mức độ dung huyết, hoặc ngưng kết theo Bảng 1.
Bảng 1- Bảng đánh giá phản ứng kết hợp bổ thể

Dung huyết Ngưng kết

Mức độ
(%) (%)
++++ (4+) 0 100
+++ (3+) 25 75
++ (2+) 50 50
+ (1+) 75 25
0 100 0

13
 TCVN XXXX:2018

Phản ứng được đọc ở độ pha loãng cao nhất mà tại đó phản ứng vẫn xảy ra ở mức 1+ hoặc lớn
hơn.
Sau khi đọc kết quả, hiệu giá kháng thể phải được qui đổi sang đơn vị kết hợp bổ thể quốc tế
(xem Bảng G.4, Phụ lục G). Mẫu được coi là dương tính khi có hiệu giá ≥ 20 ICFTU/ml.
7. Kết luận
- Kiểm tra toàn đàn gia súc và kiểm tra định kỳ dùng phương pháp Rose Bengal, phương pháp
ngưng kết trong ống nghiệm, phương pháp ELISA, phương pháp vòng sữa.
- Nếu quần thể động vật được tiêm phòng phải dùng phương pháp ELISA kết hợp với phương
pháp CFT.
- Động vật được coi là mắc bệnh sảy thai truyền nhiễm khi có các đặc điểm về triệu chứng, bệnh
tích điển hình và có kết quả xét nghiệm dương tính với vi khuẩn Brucella bằng phương pháp
realtime PCR, nuôi cấy phân lập vi khuẩn hoặc dương tính với kháng thể Brucella bằng phương
pháp CFT.

14
 TCVN XXXX:2018

Phụ lục A
(Quy định)
Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử
A.1 Dung dịch Phosphate Buffered Saline (PBS)
Natri clorua (NaCl)                                                 8,5 g
Dipotassium phosphate (K2HPO4  )                         2.0 g
Monotassium phosphat (KH2PO4)                          1.0 g
Nước cất    1 000 ml
Điều chỉnh pH trong khảng 7.0±0.2. Hấp 121oC trong thời gian 15 phút. Dung dịch này có
thể dùng được trong 3 tháng.
A.2 Dung dịch EDTA-PBS pH 7,2
Natri clorua (NaCl)           8,0 g
Kali clorua (KCl)                                               0,20 g
Dinatri hydrophosphat (Na2HPO4)                   1,15 g
Kali dihydrophosphat (KH2PO4)                        0,20 g
EDTA                                                                  3,72 g
Nước   1 000 ml
A.3 Dung dịch Veronal buffer calcium magnesium, pH 7.2 (VB)
Natri clorua (NaCl)     8,5 g
Barbital                                                                   0,575 g
Diethylmalonylurea sodium                                    0.185 g
MgCl2, 6 H2O                                        0,168 g
CaCl2                                               0.028 g
Nước   1 000 ml
A.4 Môi trường Farrell’s cải tiến
- Lấy 1 lít môi trường thạch cơ bản (có thể dùng thạch TSA), đun thạch và để nguội đến 56 oC, sau
đó bổ sung 5% huyết thanh bê và thêm các thành phần kháng sinh sau:

Polymyxin B sulphate: 5,000 units (5 mg)

Bacitracin: 25,000 units (25 mg)
Natamycin: 50 mg
Nalidixic acid: 5 mg
Nystatin: 100,000 units
Vancomycin: 20 mg
 Trộn đều, đổ ra đĩa petri, đậy nắp và bao gói, bảo quản môi trường ở 5±3 oC, sử dụng trong
khoảng 8 ngày.
A.5 Môi trường thạch CITA
- Lấy 1 lít môi trường thạch máu cơ bản, đun thạch và để nguội đến 56 oC, sau đó bổ sung 5%
huyết thanh bê và thêm các thành phần kháng sinh sau:

Nistatin: 100.000 IU

15
 TCVN XXXX:2018

Nitrofurantoin: 10 mg
Amphotericin B: 4 mg
Colistin methanesulfonate: 7.5 mg
Vancomycin: 20 mg
 Trộn đều, đổ ra đĩa petri, đậy nắp và bao gói, bảo quản môi trường ở 5±3 oC, sử dụng trong
khoảng 8 ngày.
A.6 Môi trường canh thang Brucella
Enzymatic Digest of casein: 10 g
Enzymatic Digest of animal tissue: 10 g
Yeast extract: 2g
Sodium Chloride: 5g
Dextrose: 1g
Sodium Bisulfite: 0.1 g
Nước     1 000 ml
Điều chỉnh pH: 7.0 ± 0.2 ở 25 C, chia ra ống nghiệm, hấp 121oC trong thời gian 15 phút.
o

Để tăng cường dinh dưỡng và tính chọn lọc của môi trường, có thể bổ sung thêm 50 ml/l huyết
thanh ngựa; 5.000 IU/l polymyxin B; 25.000 IU/l bacitracin; 100.000 IU/l nystatin; 100 mg/l
cycloheximide.

A.7. Môi trường thạch máu

Môi trường thạch máu: Sử dụng môi trường thương mại, pha chế theo hướng dẫn của nhà
sản xuất.
VÍ DỤ: Dùng môi trường thạch máu cơ bản (Blood agar base) của hãng Merck (Cat. No. 110886)
Chuẩn bị môi trường thạch máu cơ bản theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Vô trùng môi trường thạch máu cơ bản ở 121 oC trong 20 phút bằng nồi hấp (4.1.6).Đợi nhiệt độ
của môi trường thạch máu cơ bản đã vô trùng khoảng từ 45 oC đến 50oC thì bổ sung máu từ 5%
đến 8% máu thỏ, hoặc máu bê đã loại bỏ fibrin. Lắc đều và chia ra đĩa petri (4.2.6) khoảng 10 ml/
đĩa. Kiểm tra vô trùng môi trường trong tủ ấm ở nhiệt độ 37 oC/24 giờ. Bảo quản môi trường ở điều
kiện 5oC±3oC.

16
 TCVN XXXX:2018

Phụ lục B
(Quy định)
Các phương pháp nhuộm
B.1 Phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen
Bước 1: Hơ tiêu bản đã được cố định trên ngọn lửa đèn cồn.
Bước 2: Nhỏ ngập tiêu bản bằng Carbol Fuchsin. Hãy đảm bảo thuốc nhuộm luôn được phủ kín
trong suốt quá trình nhuộm.
Bước 3: Sử dụng đèn Bun-sen (đèn khí đốt hình ống như dùng trong phòng thí nghiệm), làm nóng
tiêu bản một cách từ từ cho tới khi nóng và duy trì trong 5 phút bằng cách sử dụng nhiệt độ thấp
hoặc làm nóng gián đoạn.
CHÚ Ý: Nếu hơ lửa quá nóng có thể làm vỡ phiến kính.
Bước 4: Rửa tiêu bản bằng nước.
Bước 5: Nhỏ ngập tiêu bản với axit-alcohol 3% trong 5 phút (tẩy màu). Trong 5 phút đó, có thể nhỏ
thêm axit-alcohol 3% cho tới khi tiêu bản được tẩy sạch.
Bước 6: Rửa sạch tiêu bản với nước và sau đó làm khô tiêu bản.
Bước 7: Nhỏ ngập tiêu bản bằng phẩm màu xanh metylen và giữ trong khoảng 1 phút.
Bước 8: Rửa sạch tiêu bản bằng nước. Toàn bộ các bước được thực hiện đúng và chính xác,
kiểm tra dưới kính hiển vi với vật kính dầu thấy vi khuẩn bắt màu đỏ trên nền xanh da trời.
B.2 Phương pháp nhuộm Gram
Bước 1: Nhỏ ngập tiêu bản đã cố định bằng dung dịch tím tinh thể trong 1 phút. Rửa sạch tiêu bản
nhanh dưới vòi nước (không quá 5 giây). Lau khô.
Bước 2: Nhỏ ngập tiêu bản bằng dung dịch Gram's Iodine (dung dịch iôt 2% và kali iôt 3% trong
cồn 70%) trong khoảng 1 phút. Rửa sạch tiêu bản dưới vòi nước. Lau khô.
Bước 3: Nhỏ ngập tiêu bản với cồn 95 % trong 10 giây (có thể lâu hơn nếu tiêu bản bắt màu quá
đậm) và rửa sạch bằng vòi nước. Lau khô tiêu bản.
Bước 4: Nhỏ ngập tiêu bản bằng dung dịch hữu cơ màu đỏ trong 30 giây. Rửa sạch dưới vòi
nước. Lau khô tiêu bản bằng giấy thấm nước nhưng không làm bay mất lớp cố định.
Bước 5: Kiểm tra tiêu bản dưới kính hiển vi với vật kính dầu.
 

17
 TCVN XXXX:2018

Phụ lục C
(Quy định)
Các phản ứng sinh hóa
C.1 Đặc điểm sinh hóa của các loài vi khuẩn Brucella.
Bảng C.1- Một số đặc trưng của các loài Brucella

PỨ ngưng kết
huyết thanh đơn Hình thái Sản Phản Phản
Loài Biovar dòng đặc hiệu khuẩn sinh ứng ứng
lạc H2S oxidase urease
A M R
1, 2, 3 + - -
4 - + -
B. abortus 5 - + - S + + +
6 + - -
9 - + -
1 + - -
2 + - -
B. suis 3 + - - S - + +
4 + + -
5 - + -
1 - + -
B. melitensis 2 + - - S - + +
3 + + -
B. ovis - - + R - - -
B. canis - - + R - - +
B. neotomae + - - S + + +
CHÚ THÍCH: S: khuẩn lạc nhẵn, R: khuẩn lạc nhám, +: Dương tính

C.2 Phân giải urê

Có thể sử dụng môi trường urê cơ bản (urea agar base - Christensen), hoặc tương đương.
- Cấy vi khuẩn vào môi trường có urê, nuôi cấy ở 37oC, sau 24h đọc kết quả. 
- Phản ứng âm tính: Môi trường không thay đổi màu.
- Phản ứng dương tính: Môi trường chuyển từ màu vàng sang màu tím.
C.3 Phản ứng oxidaza
Phản ứng được tiến hành trên giấy có tẩm dung dịch 1% tetra methyl p-phenyl diamine
dihydrochloride.
- Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch chà sát lên trên mặt giấy.
- Phản ứng dương tính: Khi xuất hiện màu hồng đậm sau 30 giây.
- Phản ứng âm tính: Khi giấy tẩm giữ nguyên màu.
C.4 Phản ứng ngưng kết huyết thanh
- Đặt phiến kính trong đĩa Petri.
- Nhỏ một giọt kháng huyết thanh chuẩn vào một ô trên phiến kính và nhỏ một giọt nước sinh lý
vào một ô khác trên phiến kính làm đối chứng âm.
- Lấy một lượng nhỏ khuẩn lạc trộn đều với kháng huyết thanh chuẩn và một phần khuẩn lạc khác
trồn đều với nước sinh lý.
- Quan sát phản ứng sau 5 phút.

18
 TCVN XXXX:2018

- Đọc kết quả:

+ Phản ứng dương tính: Khi có hiện tượng ngưng kết với kháng huyết thanh chuẩn.
+ Phản ứng âm tính: Không có hiện tượng ngưng kết giống như đối chứng âm tính.

19
 TCVN XXXX:2018

Phụ lục D
(Tham khảo)
Quy trình tách chiết ADN
D.1 Tách chiết ADN bằng bộ kít DNeasy Blood Tissue Kit (Code: 69504)
GHI CHÚ:
- Trước khi sử dụng DNeasy lần đầu, xin đọc kỹ thông tin về các lưu ý quan trọng trong sách hướng dẫn kèm theo kít.
- Buffers ATL and AL* có thể kết tủa khi lưu giữ. Nếu có tủa, hâm nóng buffer ở 56oC cho đến khi tan hết tủa.
- Buffers AW1* và AW2+ ở nồng độ đậm đặc, trước khi sử dụng lần đầu, thêm Ethanol (96-100%) vào 2 buffers này,
như chỉ thị ở nhãn lọ buffer.
- Chuẩn bị sẵn bể ủ nhiệt nước ở 56oC có khuấy (lắc) cho bước 2.
- Tất cả các bước ly tâm tiến hành ở nhiệt độ phòng 15- 25oC.

1. Mẫu được nghiền, đồng nhất trong dung dịch PBS với tỷ lệ 10% (1 g mẫu và 9 ml dung dịch
PBS), hút 250 µl dịch mẫu cho vào ống eppendorf 1.5 ml. Thêm vào 180 l (microliter) buffer ATL.
2. Thêm 20 l proteinase K, trộn nhẹ bằng vortex, ủ ấm ở 55oC cho đến khi mẫu bị dung giải hoàn
toàn. Thỉnh thoảng vortex mẫu hoặc đặt mẫu trong bể ủ nhiệt có đảo lắc. Thời gian dung giải mẫu
có thể từ 1- 3 giờ hoặc nhiều hơn.
3. Vortex 15 giây. Thêm 200 ul buffer AL vào ống mẫu, trộn qua bằng vortex. Thêm 200 l Ethanol
(96-100%) vào mẫu, trộn qua bằng vortex. Mẫu và buffer Al và ethanol phải được trộn đều ngay
lập tức bằng vortex hoặc bằng pipet.
4. Hút toàn bộ hỗn hợp trong bước 3 vào ống QIAamp spin column đặt trong ống Collection tube
(2 ml). Ly tâm 8000 v/phút trong thời gian 1 phút. Bỏ ống Collection tube cùng dịch đã qua ly tâm.
5. Đặt QIAamp spin column vào ống Collection tube mới. Thêm 500 l buffer AW1. Ly tâm 8000
vòng/phút trong thời gian 1 phút. Bỏ ống Collection tube và dịch đã qua ly tâm.
6. Đặt QIAamp spin column trong ống Collection tube mới. Thêm 500 l buffer AW2. Ly tâm tốc độ
tối đa 14000 vòng/phút, trong thời gian 3 phút để làm khô màng ống QIAamp spin column. Bỏ ống
Collection tube và dịch đã qua ly tâm.
Ghi chú:
Bước này nhằm loại bỏ hoàn toàn Ethanol còn dư để tiến hành hoà tan ở bước sau. Chuyển ống
QIAamp spin column ra phải hết sức cẩn thận, tránh chạm đáy ống vào dung dịch đã qua ly tâm ở
ống Collection tube. Nếu chạm vào, cần ly tâm lại. Nếu dung dịch không xuống hết ống Collection
tube, ly tâm lại. Tốt nhất là chuyển sang ống Collection tube mới và ly tâmn ở tốc độ tối đa 14000
v/phút thêm 1 phút nữa.
7. Đặt QIAamp spin column vào trong sạch. Thêm 200 l buffer AE thẳng vào màng ống QIAamp
spin column (không được chạm đầu típ vào màng). Để ở nhiệt độ phòng 1 phút, rồi ly tâm 8000
vòng/phút trong 1 phút. Bỏ cột QIAamp spin column, giữ và bảo quẩn mẫu thu được trong ống 1,5
ml ở điều kiện lạnh - 20oC.
CHÚ THÍCH:
- Bước 1 và 7 ghi mã hiệu mẫu ở cả nắp và thân ống nghiệm để tránh mất nhãn mẫu, ống nghiệm ở bước 7 là ADN
tổng số cho PCR và lưu mẫu ở – 20oC, nên có thể ghi thêm các thông tin khác nếu cần.
- Khi chuyển mẫu vào cột QIAamp spin column (bước 5), thì không được ghi mã hiệu mẫu vào phần thân cột, để tránh
gây ô nhiễm mẫu.

D.2 Chiết tách ADN bằng các bộ kít thương mại khác
Có thể chiết tách ADN bằng các bộ kít thương mại có chất lượng tương đương. Quy trình chiết
tách được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

20
 TCVN XXXX:2018

Phụ lục E
(Tham khảo)
Trình tự các cặp mồi, mẫu dò và chu trình nhiệt cho phản ứng realtime PCR
Bảng E.1-Trình tự các cặp mồi, mẫu dò cho phản ứng realtime PCR
Cặp mồi,
Loài Trình tự (5’-3’)
mẫu dò
Mồi xuôi GCTCGGTTGCCAATATCAATGC
Brucella sp (IS711) Mồi ngược GGGTAAAGCGTCGCCAGAAG
Mẫu dò FAM- AAATCTTCCACCTTGCCCTTGCCATCA-BHQ1
Mồi xuôi GCACACTCACCTTCCACAACAA
B. abortus
(gen BruAb2-0168) Mồi ngược CCCCGTTCTGCACCAGACT
Mẫu dò FAM-TGGAACGACCTTTGCAGGCGAGATC-BHQ1
Mồi xuôi TCGCATCGGCAGTTTCAA
B. melitensis
Mồi ngược CCAGCTTTTGGCCTTTTCC
(gen BME II0466)
Mẫu dò Cy5-CCTCGGCATGGCCCGCAA-BHQ2
Mồi xuôi CCTGCAAAAAGCAGGAACCA
B. suis
Mồi ngược CCTCCGCCAGTCGTGAAA
(gen BR0952)
Mẫu dò FAM-ATATGGCCGGCTATCCGCGTTCG-BHQ1

Bảng E.2-Thành phần phản ứng realtime PCR

(Sử dụng kit TaqPath™ qPCR Master Mix, hãng ABI, Cat no: A15297)
Thể tích
Thành phần
(µL)
Nước tinh khiết không có nuclease 6.0
2X Reaction buffer 12,5
Mồi xuôi (20 µM) 0,5
Mồi ngược (20 µM) 0,5
Probe (6 µM) 0,5
Tổng thể tích 20

Bảng E.3-Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR

(TaqPath™ qPCR Master Mix, hãng ABI, Cat no: A152973)

Vi khuẩn đích Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ

95oC 5 phút 1 chu kỳ
Brucella sp 95oC 15 giây
40 chu kỳ
57oC (anealing) 60
B. abortus/ 95oC 5 phút 1 chu kỳ
melitensis/sui 95oC 15 giây
40 chu kỳ
s 60oC (anealing) 45 giây
3
Thông tin này đưa ra để tạo điều kiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà
cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm thương mại khác nếu cho kết quả tương đương.

21
 TCVN XXXX:2018

Phụ lục F
(Quy định)
Phản ứng ngưng kết trong ống nghiệm (EDTA-Tube agglutination test)
F.1 Tiến hành phản ứng
- Pha loãng kháng nguyên với tỷ lệ 1:100 bằng EDTA-PBS (Phụ lục A.2)
- Chuẩn bị 5 ống nghiệm thủy tinh vô trùng đánh dấu thứ tự từ 1 đến 5, lấy kháng nguyên đã pha
loãng vào các ống theo thứ tự từ 1 đến 5 như sau: 2,0; 1,0; 1,0; 1,0 và 1,0 ml.
- Cho 0,08 ml huyết thanh cần kiểm tra vào ống 1.
- Trộn đều và pha loãng bằng cách chuyển 1 ml huyễn dịch ống 1 sang ống 2, trộn đều và chuyển
1 ml của ống 2 sang ống 3, tiếp tục đến ống thứ 5 và bỏ 1 ml cuối cùng. Như vậy các ống có độ
pha loãng của huyết thanh theo thứ tự là: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400.
- Ủ trong tủ ấm ở 37oC (4.4.1) trong thời gian 48 h.
Các bước tiến hành được tóm tắt ở bảng dưới đây:
Bảng F.1- Sơ đồ các bước tiến hành phản ứng ngưng kết trong ống nghiệm

Thứ tự các ống nghiệm

Các bước Nguyên liệu
1 2 3 4 5
Kháng nguyên 1:100, (ml) 2.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Pha loãng Chuyển 1 ml từ ống 1 sang ống 2, trộn

Huyết thanh mẫu (µL) 0.08 đều, chuyển tiếp tục đến ống 5 rồi hút bỏ
1 ml
Hiệu giá huyết thanh pha loãng 1:25 1:50 1:100 1:200 1:400
Hiệu giá tính theo ĐV quốc tế (IU/mL) 25 50 100 200 400
o
Trộn đều và ủ 37 C trong thời gian 48 h

F.2 Đánh giá kết quả.

Bảng F.2-Đánh giá kết quả phản ứng ngưng kết trong ống nghiệm

22
 TCVN XXXX:2018

Đàn không Đàn tiêm vắc

Độ pha loãng
tiêm vắc xin xin
1:25 1:50 1:100 1:200
- - - - Âm tính Âm tính
I - - - Âm tính Âm tính
+ - - - Âm tính Âm tính
+ I - - Nghi ngờ Âm tính
+ + - - Nghi ngờ Âm tính
+ + I - Nghi ngờ Nghi ngờ
+ + + - Dương tính Nghi ngờ
+ + + I Dương tính Nghi ngờ
+ + + + Dương tính Dương tính
CHÚ THÍCH: I: Ngưng kết không hoàn toàn; (+): Ngưng kết; (-): Không ngưng kết

Phụ lục G
(Quy định)
Chuẩn độ các dung dịch của phương pháp CFT
G.1 Chuẩn độ dung huyết tố (H)
- Dung huyết tố của hãng MyBiosourse (Cat No. MBS524107) hoặc tương đương, pha loãng ở
nồng độ 1/250 (10 l dung huyết tố + 2490 l VBS). Từ nồng độ 1/250, pha một dãy các nồng độ
khác nhau như sau:
Bảng G.1.1-Sơ đồ pha loãng chuẩn độ dung huyết tố
- Hiệu giá pha loãng thứ cấp
Thành phần
1/2 1/4 1/8 1/12 1/16 1/20 1/24
Dung huyết tố 1/250, l 50 50 50 50 50 50 50
VBS, l 50 150 350 550 750 950 1150
HG pha loãng cuối cùng 1/100 1/200 1/400 1/500
1/500 1/3000 1/6000
0 0 0 0

Chuẩn bị bổ thể (6.3.5.2.3): Pha loãng bổ thể 1/10 trong dung dịch VB.
- Chuẩn bị hồng cầu cừu 2.5% (6.3.5.2.4).
- Chuyển 25 l của mỗi nồng độ pha loãng dung dịch dung huyết tố sang một dãy giếng trong đĩa
96 giếng (đáy chữ U) tương ứng. 
- Thêm 25 l của hỗn dịch hồng cầu cừu (SRBC) 2.5 %.
- Cho 50 l VBS vào tất cả các giếng (riêng giếng đầu tiên cho 75 l).
- Thêm 25 l bổ thể 1/10 vào tất cả các giếng (trừ giếng đầu tiên).
- Lắc đĩa hoặc vỗ nhẹ vào thành đĩa để trộn đều, đậy nắp và ủ ở nhiệt độ 37 oC/30 phút trong tủ
ấm.
- Ly tâm đĩa ở tốc độ 200-400g/5-10 phút.
- Đọc kết quả:
+ Đối chứng dung huyết tố: không có hiện tượng dung huyết.
+ Tại nồng độ pha loãng cao nhất gây 100% dung huyết hồng cầu cừu được xác định là 01 đơn vị
dung huyết tố (MHD-Minimum Haemolytic Dose).

23
 TCVN XXXX:2018

+ Sử dụng 02MHD để tiến hành phản ứng CFT.

VÍ DỤ: Từ giếng 2 đến giếng 5 có nhiều dung huyết tố làm tan 100% hồng cầu cừu. Từ giếng 6 đến giếng 9 ít dung
huyết tố do đó không tan hết hồng cầu cừu. Do vậy, giếng thứ 5 được xác định là 01 đơn vị dung huyết tố), tương ứng
với độ pha loãng 1/2000. Hai đơn vị MHD =1/2000 x 2=1/1000 (lấy haemolysin ở nồng độ pha loãng 1/1000 được sử
dụng làm phản ứng)

Bảng G.1.2- Sơ đồ phản ứng chuẩn độ dung huyết tố

Thành phần 1 2 3 4 5 6 7 8 9
H đã pha loãng 1/250 1/100 1/200 1/400 1/500
1/250 1/500 1/3000 1/6000
* 0 0 0 0
Dung huyết tố, l 25 25 25 25 25 25 25 25 25
SRBC 2.5%, l 25 25 25 25 25 25 25 25 25
VBS, l 75 50 50 50 50 50 50 50 50
Bổ thể 1/10, - 25 25 25 25 25 25 25 25
o
Trộn đều và ủ ở nhiệt độ 37 C/30 phút
Ly tâm đĩa ở tốc độ 200-400g/5-10 phút
CHÚ THÍCH: * Kiểm soát đối chứng dung huyết tố, H: haemolysin;

G.2 Chuẩn độ bổ thể

Sử dụng bổ thể được sản xuất bởi hãng ID-Vet (CPLT, hãng ID-vet), hoặc tương đương.
- Bổ thể pha loãng ở nồng độ 1/100 trong dung dịch VB (50 l bổ thể + 4500 l dung dịch VB)
- Từ nồng độ pha loãng 1/100, tiến hành pha loãng một dãy bổ thể và cho các thành phần của
phản ứng theo sơ đồ sau: 
Bảng G.2-Sơ đồ phản ứng chuẩn độ bổ thể

Dãy ống nghiệm H control

Thành
phần H10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 H0
0
C 1/100,
40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 400 0
l
VB, l 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 0 0
Kháng
200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200
nguyên, l
VB, l 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 0 400
o
Lắc đều và ủ trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 37 C/30 phút
CHÚ THÍCH: H100: Ống gây 100% dung huyết; H0: Ống không gây dung huyết.

- Cho 400 l hệ thống dung huyết (2MHD100) vào tất cả các giếng.
- Lắc đều và ủ trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 37oC/30 phút.
- Ly tâm ở tốc độ 400-800g/5-10 phút.
- Xác định đơn vị dung huyết 50% của bổ thể (CH50):
+ Trộn một thể tích (500 µl) nước trong của ống H0 hoặc dung dịch VB với một thể tích tương
đương (500 µl) nước trong của ống H100. Trong trương hợp không có ống xuất hiện 100% dung
huyết, thì lấy 400 µl trộn với 1600 µl hệ thống dung huyết (SRBCs) để thành ống có 50% dung
huyết (H50).

24
 TCVN XXXX:2018

+ Ống nào trong dãy phản ứng có màu sắc giống với ống H50 được xác định là ống gây 50%
dung huyết.
+ Tính toán số lượng bổ thể cần cho phản ứng CFT (VC):
V Ci
VC = x c x 6 x VCFT x n
ƩV
Trong đó: VCi: Thể tích bổ thể ở nồng độ pha loãng 1/100
ƩV: Tổng thể tích bổ thể ở nồng độ pha loãng 1/100 pha loãng trong dung dịch VB.
Ci: Nồng độ bổ thể pha loãng ban đầu.
6: 6 đơn vi dung huyết của bổ thể (6CH50)
VCFT: Thể tích bổ thể cần trong phản ứng CFT.
n: Số lượng phản ứng
Vi dụ: Số lượng giếng phản ứng là 100; mỗi giếng sử dụng 25 µl bổ thể ở hiệu giá pha loãng.
Lượng bổ thể cần = 100 x 25 µl = 2500 µl. Trong quá trình chuẩn độ bổ thể, xác định được ống
thứ 7 gây 50% dung huyết (H50),
100 1
Thể tích bổ thể ban đầu cần cho phản ứng = x x 6 x 25 x 100 = 75 µl
200 100
Lấy 75 µl bổ thể tinh khiết pha loãng trong 2425 µl được 6CH50
G.3 Sơ đồ thực hiện phản ứng CFT
Thực hiện phản ứng kết hợp bổ thể (xem 6.3.5) theo sơ đồ phản ứng trong Bảng G.3:

Bảng G.3-Sơ đồ phản ứng CFT

Giếng Đối chứng

Nguyên liệu
KN BT HTDH
1 2 3 4 5 6 7 8
VBS, l 50 25 - 25 25 25 25 25 25 50 75
Trộn đều ống 4 và chuyển sang
Huyết thanh vô hoạt, l 50 25 25 25 ống 5, trộn đều, chuyển tiếp tục
đến ống 8 rồi hút bỏ 25 l
Độ pha loãnghuyết
1/2 1/4 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64
thanh
Bổ sung VBS, l 25 25 - - - - - -

Kháng nguyên (Ag), l 25 25 25 25 25 25 25 - -

Bổ thể (6CH50), l 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 -

Ủ Ủ ở 4oC qua đêm, hoặc 37oC±2/30 phút

Hệ thống dung huyết, l 50 50 50 50 50 50 50 50

Ủ Ủ ở 37oC±2oC/30 phút
Ly tâm đĩa ở 1000g/10 phút, ở nhiệt độ 5oC±3oC
Ly tâm đĩa
hoặc để ở nhiệt độ 5oC±3oC trong 2-3 giờ
Đọc kết quả
CHÚ THÍCH: KN: Đối chứng kháng nguyên; BT: Đối chứng bổ thể; HTDH: Hệ thống dung huyết.

25
 TCVN XXXX:2018

G.4 Qui đổi hiệu giá huyết thanh sang đơn vị ICFTU/ml
Bảng G.4- Qui đổi hiệu giá huyết thanh sang đơn vị ICFTU/ml

Ức chế dung huyết (Ngưng kết)

Độ pha loãng huyết
thanh 25% 50% 75% 100%
(+) (++) (+++) (++++)
1/2 8.33 10 11.67 13.33
1/4 16.67 20 23.33 26.67
1/8 33.33 40 46.67 53.33
1/16 66.67 80 93.33 106.67
1/32 133.33 160 187 213.33
1/64 266.67 320 373.33 426.67
1/128 533.33 640 746.67 853.33
1/256 1066.67 1280 1493.33 1706.67

Phụ lục H
(Quy định)
Kiểm soát hiệu giá kháng nguyên dùng cho phương pháp CFT, RBT và MRT
Việc kiểm soát kháng nguyên chỉ áp dụng trong trường hợp phòng thí nghiệm tự sản xuất kháng
nguyên chuẩn để sử dụng cho phản ứng huyết thanh học, nhằm đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu
của kháng nguyên trước khi thực hiện xét nghiệm, đảm bảo tính chính xác của phương pháp thử.
H.1 Kiểm soát kháng nguyên Brucella dùng cho phản ứng CFT
- Pha loãng huyết thanh chuẩn ở nồng độ 1/50 trong dung dịch VB.
- Từ nồng độ pha loãng 1/50, tiếp tục pha loãng trong một dãy ống nghiệm theo tỷ lệ 0.8%, 0.7%,
0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2% trong dung dịch VB (xem Bảng H.1.1).
Bảng H.1.1-Sơ đồ pha loãng huyết thanh chuẩn
Hiệu giá pha loãng
Thành phần
1/50 0.8% 0.7% 0.6% 0.5% 0.4% 0.3% 0.2%
Huyết thanh chuẩn (OIESS), ml 0.1 - - - - - - -
VB (ml) 4.9 0.6 0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9
HT chuẩn 1/50 (OIESS), ml - 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1

- Pha loãng kháng nguyên theo Bảng H.1.2 (kháng nguyên có thể pha loãng tùy theo nồng độ vi
khuẩn).
Bảng H.1.2-Sơ đồ pha loãng kháng nguyên
1/40 1/60 1/80 1/100 1/120 1/140
Thành phần
2.5% 1.66% 1.25% 1% 0.83% 0.71%

26
 TCVN XXXX:2018

Kháng nguyên chuẩn (ml) 0.1 - - - - -

VB (ml) 3.9 0.25 0.50 0.75 1.0 1.25
Kháng nguyên chuẩn 2.5% (ml) - 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50

- Thực hiện phản ứng CFT (xem 6.3.5) bằng cách xét nghiệm từng nồng độ pha loãng huyết thanh
với từng nồng độ kháng nguyên pha loãng.
- Đọc và đánh giá kết quả:
+ Hiệu giá kháng nguyên trong phản ứng CFT phải cho phản ứng ức chế dung huyết 50% với
huyết thanh chuẩn ở độ pha loãng 1/200 (0.5%).
Bảng H.1.3-Ví dụ về đọc và đánh giá kết quả hiệu giá kháng nguyên
Huyết thanh chuẩn (OIESS), ml 0.8% 0.7% 0.6% 0.5% 0.4% 0.3% 0.2%
Hiệu giá kháng nguyên
1/40 50% 25% 0 0 0 0 0
1/60 <75% <50% 25% 0 0 0 0
1/80 75% <75% <50% 25% 0 0 0
1/100 75% 75% >50% 50%(*) <25% 0 0
1/120 75% 75% >50% 50% 25% 0 0
1/140 100% 75% >50% <50% 25% 0 0

GHI CHÚ: (*) Kết quả kháng nguyên ở nồng độ 1/100 cho phản ứng ức chế 50% với huyết thanh
chuẩn ở độ pha loãng 1/200 là đạt yêu cầu.
H.2 Kiểm soát hiệu giá kháng nguyên dùng cho phản ứng RBT
- Pha loãng huyết thanh chuẩn ở nồng độ 1/25 trong dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0.85%).
- Từ nồng độ pha loãng 1/25, tiếp tục pha loãng trong một dãy ống nghiệm theo Bảng H.2.1 thành
các nồng độ pha loãng 1/40, 1/45, 1/50, 1/55, 1/100.
Bảng H.2.1-Sơ đồ pha loãng huyết thanh chuẩn

Hiệu giá pha loãng

Thành phần
1/25 1/40 1/45 1/50 1/55 1/100
Huyết thanh chuẩn (OIESS), ml 0.2 - - - - -
NaCl 0.85% (ml) 4.8 0.3 0.4 0.5 0.6 0.75
HT chuẩn 1/25 (OIESS), ml - 0.5 0.5 0.5 0.5 0.25
Kết quả ++ + +/- - -
-
Thực hiện phản ứng RBT (xem 6.3.1).
- Đánh giá kết quả:
+ Kháng nguyên dung cho phản ứng RBT phải cho kết quả dương tính với huyết thanh chuẩn ở
độ pha loãng 1/45 và phản ứng âm tính ở độ pha loãng 1/55 là đạt yêu cầu.
H.3 Kiểm soát kháng nguyên dung cho phản ứng MRI
- Pha loãng huyết thanh chuẩn ở nồng độ 1/5 trong dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0.85%).
- Từ nồng độ pha loãng 1/5, tiếp tục pha loãng trong một dãy ống nghiệm thành các nồng độ pha
loãng 1/10, 1/20, 1/50, 1/100 (xem Bảng H.3).
Bảng H.3-Sơ đồ pha loãng huyết thanh chuẩn

27
 TCVN XXXX:2018

Hiệu giá pha loãng

Thành phần
1/5 1/10 1/20 1/50 1/100
Huyết thanh chuẩn (OIESS), ml 0.2 - - - -
NaCl 0.85% (ml) 0.8 0.2 0.3 0.36 0.38
HT chuẩn 1/5 (OIESS), ml - 0.2 0.1 0.04 0.02
kết quả ++ + +/- -

- Chuyển 05 ống huyết thanh đã pha loãng ở 5 nồng độ tương ứng trên và pha loãng 1/10 trong
mẫu sữa âm tính, thành các nồng độ pha loãng tương ứng 1/20, 1/100, 1/200, 1/500 và 1/1000.
- Thực hiện phản ứng MRT (xem 6.3.2).
- Đánh giá kết quả:
+ Kháng nguyên dung cho phản ứng MRT phải cho kết quả dương tính với huyết thanh chuẩn ở
độ pha loãng 1/500 và phản ứng âm tính ở độ pha loãng 1/1000 là đạt yêu cầu.

GHÚ THÍCH:
1) Khi tiến hành đánh giá nồng độ kháng nguyên, phải tiến hành đánh giá trên các mẫu huyết thanh chuẩn âm tính (ít
nhất 05 mẫu).
2) Quy trình sản xuất kháng nguyên phải tuân thủ yêu cầu của Tổ chức Thú y thế giới (Manual of Standards for
Diagnostic Tests and Vaccines, chương 2.1.4).

28
 TCVN XXXX:2018

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. OIE (Office International des Epizooties). Manual of Standards for Diagnostic Tests and
Vaccines (May 2016). Chương 2.1.4.
[2]. Council Directive 64/432/EEC and Decision 2004/226/EC as regards diagnostic tests for
bovine brucellosis.
[3]. TCVN 8400-13:2011. Quy trình chẩn đoán bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucella.
[4]. William S. Probert, Kimmi N. Schrader, and Margot H. Real-Time Multiplex PCR Assay for
Detection of Brucella spp., B. abortus, and B. melitensis. Journal of Clinical Microbiology.
2004;42(3):1290-1293.
[5]. Brucellosis: Serological tests. OIE reference laboratory for Brucellosis in Thailand. National
Institute of Animal Health.
[6]. Hinić V, Brodard I, Thomann A, Cvetnić Z, Makaya PV, Frey J, Abril C. Novel identification and
differentiation of Brucella melitensis, B. abortus, B. suis, B. ovis, B. canis, and B. neotomae
suitable for both conventional and real-time PCR systems. J Microbiol Methods. 2008
Oct;75(2):375-8.
[7]. А. Daugaliyeva, S. Peletto, A. Sultanov, S. Baramova, P.L. Acutis, A. Adambaeva O.
Tusipkanuly, B. Usserbayev. Development of a Differential PCR Assay for Detection of Brucella
abortus and Brucella melitensis: an Analytical Approach for Monitoring of Brucella spp. in Foods of
Animal Origin. Journal of Food Quality and Hazards Control 3 (2016) 53-59
[8]. Sung-Il Kang, Moon Her, Jong Wan Kim, Ji-Yeon Kim, Kyung Yuk Ko,Yun-Mi Ha, and Suk
Chan Jung. Advanced Multiplex PCR Assay for Differentiation of Brucella Specie. Applied and
environmental, Sept. 2011, p. 6726–6728
[9]. Marília Cristina Sola, Eurione A.G. da Veiga Jardim ,Marcius Ribeiro de Freitas, Albenones
José de Mesquita. Real-time PCR detection of Brucella spp. ADN in lesions and viscera of bovine
carcasses. Journal of Microbiological Methods 104 (2014) 87–91.
_____________________________

29